Extracto
Antecedentes
Dos moléculas de señalización que son atractivas para la terapia dirigida son el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR). Se investigaron posibles interferencias entre estas 2 vías, particularmente a la luz de la reciente evidencia que implica PPAR para la terapia contra el cáncer.
Principales conclusiones
A medida evaluada mediante ensayos de MTT, gefitinib (inhibidor de EGFR) y DIM- C (PPAR agonista) inhibió el crecimiento de líneas celulares de cáncer de vejiga 9 de una manera dependiente de la dosis, pero con sensibilidad variable. Además, la combinación de gefitinib y DIM-C demostró la inhibición máxima de la proliferación celular en comparación con cada fármaco solo. Estos resultados fueron confirmados
in vivo
, donde la terapia de combinación el crecimiento del tumor máximo inhibido en contraste con cada tratamiento solo cuando se compara con el control (p & lt; 0,04). Se observó inducción de la expresión de PPAR, junto con la acumulación nuclear en respuesta a concentraciones crecientes de gefitinib través de la activación del factor de transcripción CCAT /proteína-β potenciador de unión (CEBP-β). En estas líneas celulares, líneas celulares de cáncer de vejiga sensibilizados de manera significativa que eran resistentes a la inhibición del EGFR de manera específica en programación C-DIM.
Conclusión
Estos resultados sugieren que el PPAR agonista DIM-C puede ser una excelente alternativa a la vejiga tumores resistentes a la inhibición del EGFR y eficacia de combinación pueden ser alcanzados de manera-horario específico
Visto:. Mansure JJ, Nassim R, S Chevalier, Szymanski K, J Rocha, Aldousari S, et al. (2013) Un nuevo mecanismo de PPAR gamma de inducción a través de EGFR señalización Constituye racional para la terapia de combinación en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (2): e55997. doi: 10.1371 /journal.pone.0055997
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Septiembre, 2012; Aceptó 3 de enero de 2013; Publicado: 8 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Mansure et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de la Sociedad de Investigación del cáncer. (Http://www.src-crs.ca/en-CA) W. Kassouf es un receptor de un premio becario de investigación clínica de la FRSQ. (Http://www.frsq.gouv.qc.ca/en/index.shtml). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Casi todos los pacientes con cáncer de vejiga metastásico sucumben a la enfermedad, con una supervivencia media de 18 meses, incluso con los mejores regímenes quimioterapéuticos disponibles. A medida que la comprensión de la biología del carcinoma urotelial (CU) mejora, nuevos enfoques necesitan ser estudiados. Dos moléculas de señalización que son atractivas para la terapia dirigida son el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y los γ del receptor proliferador de peroxisoma activados (PPAR). La inhibición de la función de EGFR es muy atractivo entre la amplia gama de objetivos biológicos implicados en la progresión del carcinoma urotelial (CU). Aunque mecanismo por el cual EGFR regula la biología del tumor en el cáncer de vejiga no está claramente definido, se ha demostrado que la señalización de EGFR regula la supervivencia celular, la proliferación, la diferenciación, y la invasión [1]. Por otra parte, EGFR está implicado en la angiogénesis y la metástasis [2] inducida por tumor. Sin embargo, los ensayos clínicos con inhibidores de EGFR en cabeza y cuello, pulmón, cáncer de colon y demostraron que sólo una minoría de los pacientes parecían beneficiarse de este enfoque. En el contexto de células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC), se demostró que las respuestas clínicas estaban relacionados con la activación de mutaciones dentro del dominio tirosina quinasa de EGFR, lo que sugiere que una mejor comprensión de los efectos biológicos de los inhibidores de EGFR en el cáncer ayudará a identificar tumores que responderán a la terapia [3], [4]. Aunque ninguno de 17 líneas de células UC humanos ni ninguna de 75 tumores primarios evaluados en M. D. Anderson Cancer Center contenía la activación de mutaciones de dominio quinasa del EGFR [5], inhibidores de EGFR bloquean la progresión del ciclo celular en 6/17 líneas celulares de la UC. Hemos demostrado que la expresión de alto EGFR está asociada con un fenotipo agresivo [6], y que la modulación de la GSK-3β podría ser un predictor de la respuesta a los inhibidores de EGFR en el cáncer de vejiga [7]. Nosotros creemos que el EGFR sigue siendo un fuerte eje de señalización en la progresión del cáncer de vejiga, donde su inhibición puede beneficiar a pacientes seleccionados.
Otro receptor de interés se PPAR, un receptor activado por ligando y un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de factores de transcripción [8], [9]. Es importante destacar que, PPAR juega un papel importante en la carcinogénesis. PPAR es altamente expresado en muestras de tumores de los diferentes sitios, incluido el cáncer de vejiga (revisado en la referencia [10]). PPAR es un objetivo interesante para la terapia del cáncer, no sólo debido a su elevada expresión en los tumores, sino también porque PPAR activación da como resultado la proliferación celular disminuida, disminución de G
0 /G
1 a la fase S progresión, el aumento de la diferenciación terminal, y la apoptosis [11], [12], [13]. Además, los agonistas PPAR son potentes inhibidores de la angiogénesis
in vitro
y
in vivo
, en parte debido a la regulación a la baja de VEGF [14], [15]. Recientemente, una nueva clase de agonistas PPAR, 1,1-bis (3'-indolil) -1 - (
p
-substitutedphenyl) metanos (PPAR-activa DIM-Cs), ha sido desarrollado y demostrado ser significativamente más potente que la anterior generación de fármacos. Hemos publicado el primer informe sobre la actividad antitumoral significativa de PPAR-activa DIM-Cs en las células de la UC
in vitro
y
in vivo
[16]. El uso de potentes PPAR-activa DIM-Cs era atractiva y garantiza una evaluación adicional en el tratamiento de la CU.
Un estudio previo ha demostrado que los agonistas PPAR aumentan la actividad antitumoral de gefitinib, posiblemente mediado a través de la inducción de la expresión de PTEN
In
vitro [17]. Además, la curcumina fue mostrado para inducir la expresión de PPAR y de inhibir la proliferación de las células estrelladas hepáticas [18]. Otros han demostrado que la curcumina también puede inhibir la activación del EGFR y estos resultados corroboran aún más la diafonía de potencial entre los dos ejes de señalización de interés.
El objetivo de este estudio es investigar la interferencia entre estos dos ejes de señalización, ya que comparten algunos efectores de señalización corriente abajo comunes y evaluar si la combinación de PPAR agonista y un inhibidor de EGFR puede superar la resistencia a la terapia EGFR en cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
La UC línea celular 253J BV se genera a partir de la línea celular humana UC 253J como se describe anteriormente [19] y fue proporcionado amablemente por el Dr. Colin PN Dinney de M. D. Anderson Cancer Center de Houston, Texas. La serie UM-UC de líneas celulares de carcinoma urotelial utilizados en este estudio fueron caracterizados genotípica y proporcionado por la muestra de núcleo de los Programas Especializados de Investigación de Excelencia genitourinarias en el cáncer de vejiga en el MD Anderson Cancer Center [20].
Medicamentos
el gefitinib (Iressa ZD1839) fue suministrado por AstraZeneca, Londres, Reino Unido) y el disponible por vía oral PPAR-activa DIM-C fue generosamente proporcionado por el Dr. S. segura, Houston, TX como polvo seco.
ensayo de proliferación celular
células de cáncer de vejiga se trataron con diferentes concentraciones de gefitinib (0,001 M a 100 mM) y DIM-C (0,01 M a 10 M) en de EMEM suplementado con 10% de FBS durante 48 La proliferación celular hs se evaluó usando ensayos de MTT (Sigma-Aldrich, Canadá). El valor de GI50 se definió como la concentración media de medicamento que genera 50% de inhibición del crecimiento.
análisis de transferencia Western
células se recogieron a ~ 75% a 80% de confluencia en tampón de lisis (RIPA ) y un cóctel de inhibidores de fosfatasa y proteasa (Roche Diagnostics, Alemania). Las proteínas se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) mediante electrotransferencia semiseco. anticuerpos monoclonales primarios [receptor EGF (15F8), tubulina y b-actina (Cell Signaling Technology, Nueva Inglaterra, MA)] y PPAR (sc-7273, Santa Cruz Biotechnology, California, Estados Unidos) se aplicaron para detectar bandas de interés. Además, se utilizaron los siguientes anticuerpos de conejo de la señalización celular: Akt; fosfo-Akt (Ser473); GSK-3β; fosfato GSK-3β (Ser9); p21 Waf1 /Cip1; p44-42 MAPK (Erk1 /2); fósforo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2). Anti-conejo y anti-ratón de inmunoglobulinas (IgG) acoplados a HRP /rábano picante se usaron como anticuerpos secundarios de acuerdo con el anticuerpo primario.
inmunofluorescencia
Las células cultivadas en ocho pocillos cámaras de plástico se lavaron en hielo con PBS frío que contenía inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, Alemania) y se fijaron con 3,7% de paraformaldehído. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de gefitinib (0, 2, 4 y 8 M) durante 24 hs y después se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón PPAR anticuerpo primario (1:50) durante la noche. La inmunofluorescencia se reveló utilizando anticuerpos anti-ratón acoplado a FITC (Alexa Fluor 488) o rodamina (CY3; Invitrogen). 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se utilizó para teñir los núcleos. Las microfotografías fueron tomadas con un invertido Olympus IX-81 microscopio equipado con una cámara digital CoolSnap HQ y el ImagePro + software (versión 5.0.1; Media Cybernetics).
Aislamiento de RNA y PCR en tiempo real
ARN total fue extraído de las células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. La síntesis de ADNc se realizó utilizando el Quantitec Reverse Transcription Kit (Qiagen, Mississauga, ON). Para la amplificación RT-PCR, se utilizaron cebadores validados de Qiagen (Hs_CEBPB_2_SG QuantiTect Primer Ensayo QT00998494). No contaminación de ADN genómico o pseudogenes fueron detectados por PCR sin la etapa de transcripción inversa en el ARN total utilizado. actina β se utilizó como control interno. Las reacciones comenzaron a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 20 s. Melting picos de los productos de PCR se determinaron mediante desnaturalización por calor sobre un gradiente de temperatura C 35 ° a 0,2 ° C /s de 60 a 95 ° C. Los números de ciclos que cruzan un umbral arbitrario (
C t
) se determinaron utilizando MyIQ software del sistema, la versión 1.0.410 (BioRad, CA, EE.UU.). Doble cambio en el ARNm diana en relación con ß actina se calculó de la siguiente manera: doble cambio = 2
-ΔΔ
C
t donde ΔΔ
C
t = (
C
t
target -
C
t β actina)
tiempo
X CD - (
C
t
target -
C
t β actina)
tiempo 0 tiempo
X es
punto de tiempo después de 3 hs gefitinib. Tiempo 0 representa el experimento hora de inicio (añadido ningún fármaco).
Los xenoinjertos de tumores de vejiga
ratones desnudos hembra (adquirido de Charles Rivers, Wilmington, MA) fueron inyectados subcutáneamente con las células KU-7 (10
6 células por inyección). Los animales de cada serie (10 ratones por grupo) fueron aleatorizados y asignados a un tratamiento y los grupos placebo. DIM-C se le dio 60 mg /kg 3 veces por semana y gefitinib se le dio 2 mg /día, 5 veces por semana. Todos los fármacos y el placebo se les dio por sonda oral. El tratamiento se continuó durante 4 semanas y, posteriormente, los tumores se cosecharon y se pondera. Los tumores se snap-congelado en nitrógeno líquido para su posterior análisis.
Este estudio se llevó a cabo siguiendo los procedimientos normalizados de trabajo para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill. El protocolo fue aprobado por el Fondo para el Cuidado de Animales de la Universidad McGill de Investigación del Centro de Salud (Permiso Número: 5428). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
La inmunohistoquímica
Las secciones seriadas de xenoinjertos de tumores de los ratones tratados con placebo y tratamiento de combinación (gefitinib más DIM-C ) se incubaron durante la noche a 4 ° C, con anticuerpos específicos contra primarios PPAR (sc-7273 monoclonal de ratón IgG
1 de dilución de anticuerpos 1:1000, Santa Cruz, CA, EE.UU.), p21 (anticuerpo de conejo 12D1 1:100 dilución, la señalización celular, MA, EE.UU.). Se añadió anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de conejo anticuerpo secundario, conjugado con HRP y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. El desarrollo de color se realizó con sustrato DAB (Sigma Aldrich, Canadá), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La inmunotinción se evaluó en un método semicuantitativo basado en el promedio de cinco focos en el porcentaje de células viables que muestran expresión positiva. Las muestras se obtuvieron en base a la intensidad de la tinción nuclear y citoplasmática de anticuerpos en cada diapositiva. Los valores se compararon mediante la prueba t de Student para datos independientes.
Análisis de microarrays
xenoinjertos de tumores de vejiga, se tiñeron sectorizado por hematoxilina y eosina y los tumores fueron asignadas para un mayor aislamiento. El ARN total se extrajo como se describió anteriormente. El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop-ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) y se controló la calidad con el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Genoma Quebec Centro de Innovación, CA). Los análisis de microarrays se llevaron a cabo en la Universidad McGill y Genoma Quebec Centro de Innovación, utilizando la tecnología de Illumina BeadArray ™. El HumanHT-12 Expresión BeadChip ™ se utilizó y contenía más de 22.000 sondas de la base de datos NCBI RefSeq, que proporciona mayor rendimiento de procesamiento de 12 muestras por chip. Hay una cobertura de & gt; 99,99% de todos los tipos de grano en cualquier dado HumanHT-12. TotalPrep de amplificación del ARN kit de Ambion se utilizó para llevar a cabo una ronda de amplificación 50 a 500 ng de RNA total. La síntesis de ADNc y la amplificación in vitro de transcripción
In fueron seguidos por hibridación. Los BeadChips fueron imágenes utilizando un lector de BeadArray o iScan de Illumina. El análisis estadístico y visualización de los datos de los experimentos de microarrays se ha realizado mediante el paquete de software FlexArray versión 1.6 desarrollado y proporcionado por Genoma Quebec. Los análisis funcionales de la vía de señalización y se evaluaron utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA).
Análisis estadístico
Todos los datos fueron analizados utilizando el software STATA versión 10.0. Los resultados de
in vivo
se compararon mediante medidas repetidas ANOVA y la prueba exacta de Fischer. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Expresión basal de PPAR y EGFR en un panel de líneas celulares de carcinoma urotelial
Hemos informado anteriormente de que la inhibición de. EGFR eje de señalización y la activación de PPAR eje son eficaces en la inhibición significativamente la proliferación de células de carcinoma humano a través de diferentes vías, en parte convergente de PI3K /Akt, ciclina D1, y los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina [7], [16]. En nuestro trabajo anterior, hemos demostrado la expresión significativa de los miembros de su familia a través de varias líneas celulares de la UC [7]. Para investigar más a fondo para la interacción entre los dos ejes de señalización, que primero examinado para caracterizar los niveles de EGFR y la expresión de PPAR a través de un panel de 9 líneas de células de la UC. Como se revela en la Figura 1 A, todas las líneas celulares ensayadas expresan varios niveles de EGFR y PPAR. Nosotros no demostró una correlación entre los niveles basales de expresión y la etapa de la enfermedad de las cuales las líneas celulares se obtuvieron a partir de 9 (de superficial a invasivo para metastásico). También hemos determinado la respuesta a la dosis de entre las líneas celulares de carcinoma urotelial (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, UM-UC13, RT4, 253JP, 253J-BV, KU7) a diferentes concentraciones de EGFR inhibidor (gefitinib) y el agonista PPAR (DIM-C) después de 72 horas del tratamiento (Figura 1 B). Hemos sido capaces de estratificar varias líneas celulares de la UC que van desde muy sensibles a las relativamente resistente a la inhibición del EGFR, mientras que no se observaron cambios significativos para justificar una estratificación en respuesta a DIM-C. De nota, UC5, la línea celular más sensible a gefitinib, es diferente del resto de las líneas celulares, ya que contiene la amplificación del gen EGFR.
(A) Expresión de PPAR y EGFR en relación con los niveles endógenos de β- actina y tubulina, respectivamente, y representada en unidades entre líneas celulares de cáncer de vejiga 9 que reflejan diferentes etapas de la enfermedad (de superficial a invasiva & amp; sin metástasis, invasivo y metástasis linfática). (B) Dosis-respuesta de las líneas celulares de cáncer de vejiga a PPAR agonista (DIM-C) y el inhibidor de EGFR (gefitinib). El valor de GI50 se definió como la concentración media de medicamento que genera 50% de inhibición del crecimiento en comparación con los controles.
Efectos de Combined EGFR inhibidores y agonistas de PPAR? Terapia
Hemos investigado la efectos antiproliferativos de la terapia combinada, gefitinib y DIM-C, en comparación con cada fármaco por separado en el crecimiento de células de cáncer de vejiga
in vitro
. El crecimiento y la proliferación celular se controlaron mediante ensayos de MTT y llevaron a cabo en dos líneas de células relativamente EGFR-resistentes (KU7 y UM-UC13). Las células se trataron durante 72 hs y se usan una razón fija de diferentes fracciones de GI50 (0.25, 0.5, 1.0 y 2.0) de cada fármaco solo según el método de la mediana del efecto. La inhibición máxima de la proliferación celular se demostró en el tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los fármacos solos (Figura 2). DIM-C rindió las células resistentes sensibles a la inhibición del EGFR.
El crecimiento se controló mediante ensayos de MTT. Las células se trataron con gefitinib 5 M y DIM-C 3 M y se compararon con cada fármaco solo. Rojo: gefitinib; Amarillo: DIM-C; Azul: gefitinib + DIM-C
Efecto de la combinación en la señalización corriente abajo del EGFR y PTEN expresión
La unión de EGFR a su ligando conduce a la activación de varias señales, incluyendo las Ras. /Raf /vía activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) [21]. Por lo tanto, se investigó el efecto de la combinación en el estado de fosforilación de p42 /44 MAPK (Erk1 /2). Como se ve en la Figura 3A, se observó una significativa desactivación curso de tiempo de la vía de Erk, en comparación con el control, entre las células tratadas con gefitinib 5 M y DIM-C 3 M. Además, como se mencionó anteriormente, la expresión de PTEN aumentos en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tratados con los agonistas de PPAR, rosiglitazona [17]. Por lo tanto, también se investigó el efecto del tratamiento de combinación en la expresión de PTEN. Como se muestra en la Figura 3B, no se observó diferencia en la expresión de PTEN, comparado con el control, cuando las células se trataron con gefitinib combinado y DIM-C durante 24 hs.
(A) patrón de fosforilación de p42 /44 MAPK (Erk1 /2) en las células tratadas con gefitinib 5 M y DIM-C 3 M durante 5, 15 y 30 minutos. T0 es el control sin tratar. lisados de células enteras fueron a inmunotransferencia con phosho-p42 /44 MAPK y p42 /44 MAP. GAPDH se utilizó como control de carga en el Western Blot. (B) Comparación de la expresión de PTEN en líneas celulares tratados con gefitinib 5 M y C-DIM 3 M durante 24 hs. T0 es el control sin tratar.
Efectos del tratamiento en la vejiga crecimiento tumoral in vivo
Para evaluar si estos resultados pueden traducirse
in vivo
, ratones desnudos eran por vía subcutánea inoculado con células de cáncer de vejiga relativamente resistentes (KU-7 células). Los ratones fueron tratados con agentes dirigidos a través de una sonda nasogástrica (PPAR-activa DIM-Cs que recibieron 60 mg /kg 3 veces por semana, gefitinib dio 2 mg /día 5 veces por semana, o ambos) durante 4 semanas. Como se muestra en la Figura 4, pesos de los tumores se redujeron marcadamente en el grupo combinado, en contraste con cada fármaco por separado en comparación con el control (
p
& lt; 0,02). Estos hallazgos sugieren que el tratamiento combinado tiene una mejor actividad antitumoral. Además, la expresión de genes análisis de los xenoinjertos de tumores de vejiga de perfiles, demostró que varios genes implicados en el ciclo celular, la muerte celular, el crecimiento celular y la proliferación se expresan de forma diferente en el grupo de tratamiento combinado, en comparación con el grupo control. (Tabla 1). Sorprendentemente, inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (p21 CDKN1A o), que funciona como un regulador de la progresión del ciclo celular en G1, se upregulated significativamente (doble cambio 2,6,
p
valor & lt; 0,02) y esto fue validado por inmunohistoquímica que muestra mayor porcentaje de células positivas de p21 en el brazo combinado
in vivo
(66% vs 15%, p & lt; 0,001) (Figura 5A) así como
in vitro
(Figura 5B) . Curiosamente, se ha informado que PPAR juega un papel importante mediando la expresión cascada dependiente de la diferenciación de los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, proporcionando así una detención del crecimiento de acoplamiento mecanismo molecular y adipocito diferenciación [22].
crecimiento del tumor de vejiga del brazo de tratamiento de combinación en comparación con el brazo de control (P & lt; 0,02). Diez ratones por grupo se trataron con placebo; DIM-C se le dio 60 mg /kg 3 veces por semana; Gefitinib se le dio 2 mg /día, 5 veces por semana. Todos los fármacos se administraron por sonda oral. El tratamiento se continuó durante 4 semanas.
(A) La inmunohistoquímica (IHC) tinción para p21 en los tejidos de xenoinjerto de tumor. Los ratones fueron tratados con la terapia de combinación o placebo (Gefitinib 2 mg /día, 5 veces por semana y DIM-C 60 mg /Kg, 3 veces por semana). Gráfico en el lado derecho representa la cuantificación de células de tinción positiva. (B) la expresión in vitro de p21 en células de Western blot de lisados tratados con gefitinib 5 M y DIM C-3 M durante 24 hs. Gráfico en el lado derecho, representa la cuantificación de la expresión de p21 en relación con GAPDH.
EGFR induce la inhibición de la expresión genética de PPAR de Manera dependiente de la dosis
Se evaluó el efecto de gefitinib en los miembros de los ejes de señalización de PPAR. Dos células resistentes (KU-7 y UM-UC13) se trataron con diferentes concentraciones de inhibidor de EGFR durante 24 hs. expresión de PPAR se determinó mediante análisis por transferencia Western como se describió previamente. Como se muestra en la Figura 6A, se observó una inducción drástica de la expresión de PPAR en ambas líneas celulares, de una manera dependiente de la dosis, seguido de inhibición de EGFR. Curiosamente, una acumulación nuclear de PPAR también se observó siguiendo su regulación por incremento, que es, de hecho, la forma activa del receptor. (Figura 6B). Estos resultados fueron confirmados
in vivo
, como se ve en la Figura 7, que muestra la expresión de PPAR es mayor entre los tumores de xenoinjertos tratados con gefitinib, en comparación con el grupo placebo. Es de destacar, también se observó una tinción nuclear, lo que sugiere una translocación nuclear de PPAR después de la inducción de su expresión.
(A) Las veces de aumento en relación al control se determinó después de la normalización con β-actina como control de carga externa. (B) Regulación al alza y la acumulación nuclear de PPAR después del tratamiento con gefitinib (24 hs).
El mensaje en el nivel inferior representa la cuantificación de células de tinción positiva. Las flechas negras indican la tinción nuclear.
Eficacia-horario específico de la terapia combinada
Si las células son sensibles a la inhibición del EGFR través de la inducción de la expresión de PPAR, entonces uno esperaría que la eficacia de la terapia combinada también puede verse significativamente afectada y mejorado por la secuencia de administración de gefitinib y DIM-C. De hecho, se observó marcado efecto sobre la proliferación de los tres relativamente resistente y una líneas sensibles de células a gefitinib (KU-7, UM-UC3; UM-UM13) cuando las células fueron pre-tratados con gefitinib durante 24 hs para permitir la inducción de PPAR? expresión en comparación con cuando las células eran la exposición simultánea a gefitinib y DIM-C (Figura 8). Estos resultados sugieren fuertemente PPAR agonista podría sensibilizar significativamente las líneas celulares de la UC, en particular aquellos que eran resistentes a la inhibición del EGFR, de una manera-horario específico y proporcionar un excelente potencial para la terapia de combinación.
Tres líneas celulares resistentes a gefitinib relativamente (UM-UC3, UM-UC13, y KU-7) y una sensible (UM-UC6). Crecimiento (ensayos MTT) después del tratamiento de 48 hs. Gefitinib: 2 M. DIM-C:. 2 M
C /EBPb Expresión Después de gefitinib expresión inducida por PPAR
Una considerable evidencia indica que CCAAT /potenciador de la proteína de unión beta (C /EBPb) actúa como un activador transcripcional de genes PPAR [23], [24]. Esta creencia se apoya en el hecho de que el próximo de sus promotores poseen elementos reguladores C /EBP que son esenciales para la transactivación de PPAR transgenes promotor-indicador. Aquí se presenta evidencia convincente de que la inducción secuencial de la expresión de PPAR por la inhibición del EGFR está mediada por C /EBPb (Figura 9). Cuando las células fueron pre-tratados con gefitinib en las mismas concentraciones que se utilizan para inducir la expresión de PPAR, un aumento en C /EBPb también se observó que sugiere gefitinib inducida por PPAR expresión puede estar mediada por C /EBPb.
(A ) RT-PCR de las células tratadas con gefitinib (B) Western blot de la expresión CEBPβ en UM-UC-13 líneas celulares KU-7 y en respuesta a diferentes concentraciones de gefitinib.
Discusión
Los resultados de un amplio conjunto de estudios preclínicos y ensayos clínicos sugieren que la orientación de EGFR representa una contribución significativa a la terapia del cáncer. Sin embargo, la cuestión de la resistencia constitutiva en un gran número de pacientes y el desarrollo de resistencia adquirida en los respondedores sigue siendo un tema de investigación inexplorada. resistencia de las células del cáncer a los antagonistas de EGFR podría ser debido a varias razones, tales como alteraciones genéticas, lo que les permite tener una resistencia intrínseca a los medicamentos contra el cáncer. Además, varios cambios moleculares diferentes importantes en las vías de señalización celular dependientes o -independiente EGFR podrían ser responsables para el desarrollo de resistencia a estos inhibidores. Por ejemplo, hemos demostrado anteriormente desacoplamiento del EGFR con rutas mitogénicas puede causar resistencia a los antagonistas de EGFR [7]. Actualmente, la terapia combinada se ha convertido en un gran avance en el tratamiento del cáncer. En una serie de entidades tumorales, tal enfoque ha producido resultados impresionantes. La terapia de combinación de agonistas de PPAR y otros agentes ha demostrado ser más eficaz que el uso de cualquiera de los agentes solo. [25], [26]. En las células del cáncer de vejiga
in vitro Opiniones y en el tumor de vejiga
in vivo
, hemos demostrado que PPAR activa DIM-Cs mostró significativa actividad anti-tumorigénico y eran más potentes inhibidores del crecimiento del cáncer de vejiga en comparación con rosiglitazona, el PPAR agonista sintético usado actualmente [16]. Tomados en conjunto, combinado focalización de los receptores EGFR y ejes de PPAR pueden revelar moléculas prometedoras para apuntar en el cáncer de vejiga. Sin embargo, nuestros resultados han demostrado que las líneas celulares de cáncer urotelial humanos muestran marcada heterogeneidad hacia sensibilidad a inhibidores de EGFR. De gran interés, los niveles de expresión de EGFR y PPAR variaron significativamente entre las diferentes líneas celulares, pero no se correlacionaron con la etapa de la enfermedad (rango de papilar superficial con invasivos para tumores metastásicos). Por otra parte, esta correlación no era perfecto, así que la sensibilidad sea para inhibidor de EGFR o agonista PPAR con excepción de UM-UC5 que muestra altos niveles de expresión de EGFR y muestra una alta sensibilidad al inhibidor de EGFR. Estos resultados corroboran los resultados de otros grupos que han informado, en un panel de 17 líneas celulares de cáncer de vejiga humana, que a pesar de la fuerte correlación entre gefitinib-respuesta, la expresión superficial de EGFR y la expresión de la proteína p27Kip1 en las líneas más sensibles, gefitinib respuesta no fue tan estrechamente vinculada a la expresión de EGFR en el panel de líneas celulares de superficie en su conjunto [27]. Estos resultados son notables, pero siguen siendo poco claro si la expresión basal podría predecir el crecimiento dependiente de EGFR en cáncer de vejiga. Por el contrario, cuando dos líneas de células resistentes (KU-7 y UM-UC13) se trataron con de razón fija de diferentes fracciones de GI50 de cada fármaco solo (gefitinib o DIM-C), la terapia de combinación potencialmente ejerce inhibición aditiva de la proliferación de células UC. Estos resultados proporcionaron una mayor comprensión del potencial de la terapia combinada para superar la resistencia a cualquier fármaco solo, sobre todo al inhibidor de EGFR. De hecho, nuestros
in vivo
hallazgos, demostraron positivamente los efectos de los inhibidores de EGFR combinados y los agonistas PPAR sobre el crecimiento de los tumores uroteliales humanos. De hecho, xenoinjertos ratones desnudos con las células de cáncer de vejiga relativamente resistentes (células KU-7) mostró un peso tumor marcadamente reducida en el grupo combinado, en contraste con cada tratamiento solo cuando se compara con el control. Estos resultados indican que las células aún relativamente resistentes,
in vitro
, demostraron sensibilidad
in vivo
en el tratamiento combinado, lo que sugiere PPAR agonista potencialmente podría utilizarse para sensibilizar a las líneas celulares de cáncer de vejiga que eran resistentes a la inhibición del EGFR.
Recientemente, la curcumina ha demostrado inducir la expresión de PPAR en células estrelladas hepáticas y potencialmente inhibir la proliferación celular
a través de la inhibición de la activación del EGFR
[28]. En este estudio, Zhou et al, informaron que la interrupción de la PDGF y EGF vías de señalización por la curcumina, estimula la expresión del gen de PPAR en células estrelladas hepáticas activadas (HSC), que conduce a la reducción en el crecimiento celular, incluyendo la inducción de la detención celular y la apoptosis . Del mismo modo, se observó una inducción de la expresión de PPAR a la inhibición de EGFR en las células KU-7 y UM-UC13 resistentes. Este fue un resultado atractivo, ya que se observó la inducción de la expresión de PPAR en una forma dependiente de la dosis, y fue seguido por una acumulación nuclear de PPAR, que es, de hecho, la forma funcional del receptor. Nuestra novela de observación refleja que la eficacia de la terapia de combinación también puede verse afectada de manera significativa y mejorado por la administración secuencial de gefitinib y agonista de PPAR. En realidad, PPAR agonista notablemente sensibilizado líneas celulares de cáncer de vejiga, en particular los que eran resistentes a la inhibición del EGFR, de una manera-horario específico, lo que sugiere que puede ser una excelente alternativa cuando las células son resistentes a las monoterapias mencionadas. El mecanismo de inducción de la expresión del gen PPAR por gefitinib todavía no está claro. Durante la adipogénesis, evidencias considerables indican que CEBP /β actuar como un activador transcripcional de genes PPAR [23]. Esta creencia se apoya en el hecho de que los promotores proximales de PPAR poseen elementos reguladores C /EBP esenciales para su transactivación. Por otra parte, se ha demostrado que CEBP /β se expresa en una etapa temprana posteriormente al tratamiento con inductores de la diferenciación [29], seguido de la expresión de PPAR. De hecho, nuestros resultados muestran la inhibición del EGFR expresión inducida CEBP /β y de manera interesante, su regulación por incremento se observó también en una etapa temprana después del tratamiento gefitinib, un proceso muy similar a la activación de genes adipogénicos en la diferenciación, y que precede a la inducción de la expresión del gen de PPAR. Sin embargo, se necesitan estudios futuros para determinar el papel directo de la C /EBPb en la inducción de la expresión de PPAR mediada por gefitinib. En la interpretación de los resultados, es importante reconocer las limitaciones de los estudios preclínicos.