Extracto
señalización Wnt es una vía de reglamentación crítico en el desarrollo y la enfermedad. Se sabe muy poco acerca de los mecanismos de señalización de Wnt en cáncer de próstata, una causa principal de muerte en los hombres. Un análisis cuantitativo de la expresión de la proteína Wnt5A en arrays de tejido humano, que contiene 600 núcleos de tejido de próstata, mostró & gt; 50% de aumento en comparación con los núcleos maligno benignos (
p
& lt; 0,0001). En un par emparejado de cáncer de próstata y la línea celular normal, también se incrementó la expresión de la proteína Wnt5A. ondas de calcio fueron inducidos en células de la próstata en respuesta a Wnt5A con un aumento de 3 veces en la Flou-4 intensidad. La actividad de Ca
2 + /calmodulina dependiente de la proteína quinasa (CaMKII), un transductor de la no canónica de Wnt /Ca
2 + de señalización, aumentado en 8 veces en las células de cáncer; no se observó cambio en la expresión de β-catenina, se sabe que activa la vía /β-catenina canónica de Wnt. Minería de acceso público humanas de cáncer de próstata oligoarray conjuntos de datos reveló que la expresión de numerosos genes (por ejemplo, CCND1, CD44) bajo el control de la transcripción de β-catenina es regulada hacia abajo. Confocal y microscopía electrónica cuantitativo mostraron que la inhibición específica de CaMKII en células de cáncer provoca la remodelación del citoesqueleto de actina, bordes de la herida irregulares y la arquitectura intercelular suelta y un aumento de 6 y 8 veces en la frecuencia y duración de filopodios, respectivamente. Por el contrario, las células normales de la próstata sin tratar mostraron un borde de la herida irregular y la arquitectura intercelular suelta; incubación de las células normales de la próstata con Wnt5A proteína recombinante inducida por la remodelación de la actina con un borde regular de la herida y la herida aumentó la capacidad de curación. imágenes de células vivas mostró que una consecuencia funcional de la inhibición de CaMKII era 80% de disminución en la capacidad de curación de heridas y reduce la motilidad celular en células de cáncer. Proponemos que no canónica de Wnt /Ca
2 + señalización a través de actos CaMKII como nuevo regulador de la plasticidad estructural y la motilidad celular en el cáncer de próstata
Visto:. Wang Q, Symes AJ, Kane CA, Freeman A, Nariculam J, Munson P, et al. (2010) Un nuevo papel para los Wnt /Ca
2 + Señalización el citoesqueleto de actina y Remodelación de la motilidad celular en el cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (5): e10456. doi: 10.1371 /journal.pone.0010456
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 19 Noviembre 2009; Aceptado: 8 Abril 2010; Publicado: 4 Mayo 2010
Derechos de Autor © 2010 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Investigación del cáncer de próstata Centro Nacional de Investigación del cáncer del Instituto y, Reino Unido. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
sin alas /Wnt genes codifican para una familia de glicoproteínas secretadas que regulan muchos procesos celulares [1], [2]. señalización aberrante a través de vías de señalización Wnt está vinculada a una serie de enfermedades incluyendo el cáncer [3] - [6]. la señalización de Wnt se produce a través de la canónica (Wnt /β-catenina, CTNNB1) y no canónica (Wnt /Ca
2 +) las vías [3], [7]. Una vía Wnt menos bien descrito es la vía de Wnt-JNK [8]. La señalización mediante la ruta /β-catenina Wnt activa la transcripción de muchos genes, tales como la ciclina Ds y metaloproteinasas de la membrana (MMPs), a través de factores de LEF TVC /. vía Wnt /Ca
2 + conduce a un aumento en el calcio intracelular [9] y la activación de proteína dependiente de calmodulina quinasa II (CaMKII) [10] y es conocido para modular el movimiento y comportamiento [11] de células, [12] y induce cambios estructurales [11], [13], [14]. El enlace entre el aumento de la señalización de β-catenina en la tumorigénesis y aumento de la transcripción de genes implicados en la transformación y proliferación celular están documentados, sin embargo, el papel no canónica de Wnt /Ca
2 + Señalización el cáncer es sólo lentamente siendo dilucidado [15] , [16].
el cáncer de próstata representa un estimado de 25% de todos los nuevos casos de cáncer y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres [17]. Ni la expresión de las proteínas Wnt ni los mecanismos de la señalización de Wnt en cáncer de próstata se entienden [18]. Los estudios anteriores se centraron en la caracterización de los receptores de Wnt, proteínas relacionadas con el receptor y la expresión de genes Wnt [5], [19] - [21], en líneas celulares de cáncer de próstata. La interacción directa entre el receptor de andrógenos (AR) y TCF para β-catenina y otros co-factores de transcripción también se sugirió [22]. Sin embargo, sólo un pequeño porcentaje de las muestras de cáncer de próstata han desregulado destrucción complejo o mutado β-catenina [18]. Es probable, por tanto, que otros mecanismos, quizás directamente relacionados con la señalización de Wnt, pueden estar involucrados
Nos mostró recientemente [23] que se incrementa WNT5A (uno de los 19 miembros de la familia Wnt) la expresión génica (& gt.; 50 veces) en las líneas de tejido de cáncer de próstata y de células de cáncer debido a la hipometilación. Sin embargo, las preguntas importantes con respecto a la expresión Wnt5A y los mecanismos de señalización mediada Wnt5A en el cáncer de próstata se mantienen. Por ejemplo, no sabemos (i) si el aumento de Wnt5A resultados de transcripción de genes en un aumento de la expresión de proteínas Wnt5A en los tumores malignos? (Ii) Si la vía de señalización canónica o no canónica se activa en el cáncer de próstata? (Iii) ¿Cuál es el papel funcional de la señalización Wnt en el cáncer de próstata? Para abordar estas cuestiones hemos probado los siguientes hipótesis: (i) Que la expresión de proteínas Wnt5A se incrementa en el cáncer de próstata humano (ii) que la señalización /β-catenina vía debe dar lugar a una mayor expresión de TCF /LEF genes diana tales como MMP y TIMP3 en cáncer (iii) la activación de próstata de Wnt /Ca
2 + señalización en las células de cáncer de próstata debería resultar en un aumento de la actividad de la enzima CaMKII provocando alteraciones en el citoesqueleto y la motilidad celular. Mostramos, por primera vez, que la expresión de proteínas Wnt5A se incrementa en la próstata humana maligno en comparación con tejido benigno y Wnt /Ca
2 + mecanismo de señalización se activa en células de cáncer de próstata. También proporcionamos novela evidencia mecanicista de un papel crítico para CaMKII como un modulador de citoesqueleto de actina y la motilidad celular en el cáncer de próstata.
Resultados
evaluación transcrito de ARN usando PCR en tiempo real
Hemos medido los niveles de mRNA de WNT5A (Tabla S1), previamente identificados a partir de nuestro análisis oligoarray que están alteradas en las células de cáncer de próstata [23]. WNT5A ARNm visualiza una magnitud similar de cambio (~ 50 veces) en 1542-CP
células cancerosas 3TX comparación con las células normales-1542 NPTX, tanto si se mide utilizando oligoarray [23] o PCR en tiempo real (Tabla S1). WNT5A transcripción se expresa también en otras líneas celulares de cáncer de próstata por ejemplo PC3 y DU145 [19], [23].
expresión de la proteína Wnt5A en benignos y malignos de próstata humano
3,3-diaminobencidina (DAB) etiqueta, que representa la expresión Wnt5A, se observó en ambos núcleos de tejido malignas y benignas (Fig. 1A y B). Se cuantificó la etiqueta, de una manera imparcial, mediante el uso de un análisis de partículas reproducibles, semi-automatizado (Analizar Partículas) de protocolo utilizando el software ImageJ [24] después de la conversión de imágenes RGB en bits de escala de grises 16 (figura 1C y D) a partir de 600 tejido de la próstata individuo núcleos (ver Materiales y Métodos). parámetros calculados de recuento, área total, y el tamaño medio de la fracción de área se dan en la Tabla S2. Integración de área bajo la curva reveló un 55%, 25% y 45% de aumento en el área total, tamaño medio y fracción de área (área total /píxeles totales), que representa la extensión y la intensidad de la tinción, en los núcleos malignos (n = 301 ) en comparación con los núcleos benignos (n = 299), respectivamente (figura 1E, F y G) que eran altamente significativa (p & lt; 0,0001, prueba t de Student). Estos resultados indican que la expresión se incrementa en Wnt5A maligno en comparación con próstata humana benigna.
Representante maligno (A) y (B) núcleo de tejido benigno de arrays de próstata humanos utilizados para calcular expresión Wnt5A (etiqueta DAB, marrón, en gran parte en las células acinares). imágenes RGB (A y B) se convierten en imágenes de 16 bits (C y D) para la cuantificación de la señal DAB utilizando Analizar protocolo de partículas en el software ImageJ para obtener Área Total manchado (E) y tamaño medio de la partícula medido (F) , en píxeles, y la zona Fracción (G, área total dividida por el total de píxeles de la imagen). expresión 5A Wnt se incrementó en núcleos benignos v malignas (p & lt; 0,0001). Cada contenedor es de datos para un individuo, maligno (rojo, n = 301) o benigno (verde, n = 299) de núcleo.
Mecanismos de señalización de Wnt-en cáncer de próstata
La expresión de la proteína Wnt5A también más alto fue en 1542-CP
células cancerosas 3TX comparación con las células normales emparejados 1542-NPTX (Fig. 2A). También hubo una disminución concomitante (2,5 veces) en transcrito de ARNm de CTNNB1 y otros elementos de señalización /β-catenina Wnt (por ejemplo, axina, DVL1, GSK3) en las células de cáncer en comparación con las células normales (Tabla S1). El antagonismo de la β-catenina debido a la sobreexpresión de Wnt5A, que conduce a la regulación negativa de la diana /β-catenina Wnt se ha propuesto anteriormente en el melanoma [25] y embriones de Xenopus [11]. β-catenina expresión de la proteína, usando transferencia Western mostraron una sola banda (~94kDa) de una manera dependiente de la concentración de proteínas, en los lisados de células tanto de 1542-CP
3TX y 1542-NPTX células (Fig. 2B). El análisis densitométrico mostró que no hubo ningún cambio en la proteína β-catenina en el cáncer en comparación con la línea celular normal (Fig. 2C). Además, de acuerdo con nuestros datos oligoarray [23] un número de Wnt /β-catenina mediada por TCF genes diana transcripción mostraron disminución de la expresión de ARNm en las células cancerosas (Tabla S3). Un examen detallado de la proteína y el nivel funcional de objetivos seleccionados de TCF /LEF transcripción (por ejemplo, la MMP-2, MMP14 y TIMP3) [26] confirmaron estas observaciones. la expresión de mRNA de estos genes era 3-10 veces menor en las células de cáncer en comparación con las células normales (Tabla S1) soportados por inmunofluorescencia indirecta (Fig. S1). la actividad de MMP-14 debe reflejar el equilibrio entre MMP-14 catalítico y TIMP3 actividades reguladoras. la actividad de MMP fue de 3 ± 0,06 veces menor en las células cancerosas utilizando zimografía de gelatina (Fig. S2). Estos resultados confirmaron que numerosos objetivos de la vía de señalización /β-catenina vía se redujeron regulado en el gen, la proteína o el nivel funcional
.
Western blot de (A) expresión de la proteína Wnt5A que indica los niveles más altos en 1542-CP
3TX células (CP) en comparación con el 1542-NPTX células (NP). β-actina se utilizó como control de carga. (B) β-catenina (94 kDa) expresión en lisado celular de 1542-CP
3TX y 1542-NPTX líneas celulares (GAPDH, 35 kDa, que se utiliza como control de carga de proteína en el mismo blot). análisis (C) densitométrico se realizó utilizando el software comercial (GeneTools, cuadros sinópticos, Reino Unido). NP (barra rellena) = 1542-NPTX y CP (barra hueca) = 1542-CP
3TX.
Análisis de la expresión génica de los objetivos CTNNB1 y TCF /LEF transcripción, utilizando Oncomine [27 ] y software GeneSpring y accesibles al público de microarrays conjuntos de datos para normal (no neoplásico o benigno)
vs tejido de la próstata
cáncer, mostraron que la expresión de casi todos Wnt /β-catenina /TCF objetivos analizados, excepto c-myc , se redujo en el cáncer de próstata (Fig. S3). Estos resultados son similares a los de las líneas celulares de próstata y demuestran que el aumento mediado por β-catenina en TCF transcripción no era probable que sea el mecanismo de la señalización de Wnt en el cáncer de próstata. Por lo tanto, hemos probado la hipótesis de que en el cáncer de próstata, la señalización de Wnt es transducida a través de Wnt /Ca vía
2 +. Hemos realizado experimentos para establecer si Wnt5A directamente induce la liberación de calcio en las células de la próstata. Además de los péptidos inducida por las ondas de calcio Wnt5A, que dura hasta 100s, en la línea celular de cáncer de próstata con un aumento de 3,1 ± 0,1 (n = 12) veces en la intensidad de Flou-4 desde la línea de base (figura 3 y la película S1).
un gráfico representativo de la liberación de calcio en la línea celular de cáncer de próstata (PC3) como una función de Fluo-4 cambio de intensidad en el tiempo utilizando imágenes de células vivas confocal. La línea verde representa el cambio en la intensidad de Fluo-4 (línea verde) en el control (A) (después de la adición de vehículo de PBS) o (B) péptido Wnt5A recombinante (100 ng /ml). Hubo un aumento pliegue 3.1 ± 0.1 en Fluo-4 intensidad después de la adición de Wnt5A (n = 12). En algunos experimentos Fura Rojo (línea roja) se cargó con Fluo-4. La relación de cambio de Fluo-4 y Fura-rojo se representa en (C).
actividad CaMKII y su papel en la plasticidad estructural de células de la próstata
CamKII es un transductor de gran de Wnt /Ca
2 + señalización. En todas las líneas celulares de próstata actividad de la enzima CaMKII era Ca
2 + dependiente, por lo menos en 1542-NPTX, mayor en 1542-CP
3TX y DU145 y pronunciado en la línea celular PC3 (Fig. 4). Hubo un aumento de 4 y 8 veces en el Ca
2 + -dependiente de la actividad de CaMKII-in1542 NPTX y 1542-CP
células 3TX (Fig. 4), respectivamente. Más importante aún, el Ca
2 + dependiente de la actividad de CaMKII se incrementó en ~ 4 veces en 1542-CP
3TX en comparación con 1542-NPTX (
inserción
Fig. 4). Estos resultados indican un aumento en la actividad de CaMKII en células de cáncer en comparación con las células normales.
La actividad fosfotransferasa de CaMKII en los lisados celulares se midió mediante el uso de un [γ-
32P] ensayo CaMKII basado ATP ( Upstate, Reino Unido) con Ca
2 + (barras rayadas) o sin Ca
2 + (barras huecas).
El recuadro
: Ca
2 + -dependiente de la actividad de CaMKII se calculó como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son la media ± SE de 3 experimentos. NP-is1542 NPTX, CP-CP is1542
3TX, el uranio empobrecido es DU145 y PC es PC3 línea celular de próstata.
Para investigar el papel de la señalización de Wnt en el citoesqueleto de actina de las células normales y cancerosas de la próstata , se utilizó un ensayo de herida /cero en combinación con microscopía electrónica y confocal de barrido y de imágenes de células vivas. En primer lugar, se observó el borde de ataque de la herida para la actina-remodelación, utilizando microscopía confocal después de la tinción con faloidina marcada con fluorescencia. En 1542-CP
células 3TX el borde delantero de la herida, a las 4 h después de la herida, mostraron tinción de actina suave y regular, con células que aparecen en un lamelipodia como la formación (Fig. 5A). En 1542-NPTX células del borde de ataque de la herida era irregular con morfología de las células individuales, algunas de ellas con filopodios bien como estructuras visibles a las 4 h (Fig. 5B).
Las células fueron heridos y se tiñeron con fluoresceína phalloidin- -5-isotiocianato (FITC, verde) para visualizar los filamentos de actina utilizando un microscopio confocal Leica SP2. A, B y G son tratadas las células 1542-CP
3TX de 1542-NPTX y PC3, respectivamente. C, D y H son AIP (10 M) tratada 1542-CP
3TX, 1542-NPTX células y PC3, respectivamente. E y F son 1542-CP
3TX y 1542-NPTX tratados con Wnt5A recombinante (100 ng /ml). Irregular herida borde de ataque y suelta de las conexiones intercelulares y finos filamentos de actina (filopodios como salientes), flechas blancas, son visibles en 1542-NPTX células normales y después del tratamiento en AIP
células de cáncer PC3 3TX y 1542-CP. yoduro de propidio se utilizó para teñir ácido nucleico (rojo). Barra de escala = 10 micras
Estamos próximos a prueba las siguientes hipótesis: (i) la inhibición de la CaMKII debería interrumpir la herida borde de ataque en líneas celulares de cáncer de próstata (ii) la activación de la señalización en Wnt5A 1542-NPTX células debe promover la remodelación de la actina de la herida como se observa en 1542-CP
células 3TX. Se utilizó péptido myristoylated relacionados con autocamtide-2 inhibitoria (AIP), un inhibidor de CaMKII, y la proteína recombinante Wnt5A (para activar la señalización de Wnt) en células normales y cancerosas para probar estas hipótesis (Fig. 5). La microscopía confocal de monocapa heridos /rayado de 1542-CP
células 3TX incubadas con AIP (10 mM) que aparecen interrumpidas, irregular herida borde de ataque con una multa de filopodios (Fig. 5C, flechas) en comparación con el borde de la herida regular en las células no tratadas (Fig . 5A). El borde delantero de heridos células 1542-NPTX con o sin AIP mostró un borde irregular, con células sueltas de contacto celular y salientes finos filamentos de actina (Fig. 5B y D). Estas micrografías indican que la inhibición de la CaMKII en 1542-CP
células cancerosas 3TX inducen filopodios como salientes. A la inversa, herido 1542-NPTX células normales, se incubaron con proteína Wnt5A recombinante (100 ng /ml), se muestra un borde de ataque regular (Fig. 5E) de la herida en comparación con el control sin tratar (Fig. 5B). No se observó ninguna diferencia aparente en el borde de la herida sin tratar líder para la proteína vs Wnt5A incubó 1542-CP
células 3TX (Fig. 5A y F).
Para validar que la remodelación de actina fue mediada por CaMKII y no a través otras quinasas (por ejemplo, CaMKIV, PKA, PKC, Raf o MAPK1, JNK1α1, o RAF), que utilizan tatCN21a, un inhibidor específico de CamKII [28]. 1542-CP
células 3TX tratados con 5 M de tatCN21a mostró bordes de la herida irregulares, células sueltas de contacto celular y la formación de filopodios (Fig. S4) que el observado con AIP (Fig. 5). La inhibición de la CaMKII también indujo, borde de la herida irregular, aflojando de célula para el contacto celular y filopodios en otras líneas celulares de cáncer de próstata incluyendo PC3 (Fig. 5G y H y la Fig. S5), DU145 (Fig. S6) y de andrógenos línea celular LNCaP sensible (Fig. S7).
El mecanismo por el que la inhibición de la CaMKII causó la formación de filopodios en células de cáncer de próstata fue considerada siguiente. Se utilizó la microscopía electrónica de barrido para cuantificar la filopodios como las estructuras (Fig. 6). Bajo microscopio electrónico de barrido de ampliación de 1542-CP
células 3TX muestran bordes regulares e irregulares de la herida sin tratar (líderes en
inserción
Fig. 6A) y células tratadas AIP (
inserción
Fig. 6B ). Las imágenes de alta magnificación muestran claramente numerosos y extendidos bien filopodios como proyecciones de la membrana celular (Fig. 6B) en el AIP tratada 1542-CP
células 3TX en comparación con las células no tratadas (Fig. 6A). La inhibición de la CaMKII con AIP causó un efecto similar en la línea celular PC3 (Fig. 5H y la Fig. S5B). La frecuencia y la longitud de la filopodios se midió de forma manual utilizando el software ImageJ. Un ajuste de Gauss del histograma de distribución de longitud de tratados y no tratados 1542-CP
células 3TX reveló un aumento de 8 veces en la longitud y un aumento de 6 veces en la frecuencia global de filopodios como protuberancias en AIP tratados en comparación con no tratados 1542-CP
células 3TX (Fig. 6C y Tabla 1). El histograma se podría caber por lo menos dos longitudes de filopodios como protuberancias en 1542-CP
células 3TX: largo (hasta 2 m) y muy largo (& gt; 2 micras). Un análisis posterior mostró que había un aumento de 5 veces en la longitud, pero un aumento mucho mayor (15 veces) en la frecuencia de las muy largas protuberancias en las células tratadas AIP en comparación con las células no tratadas (Tabla 1). Estos resultados confirman un papel importante para CaMKII mediada por la señalización de Wnt en la remodelación de la actina en el cáncer de próstata por la disminución de la longitud y la frecuencia de filopodios.
principales imágenes son imágenes representativas (barra de escala 1 m) de no tratado (A) y AIP (10 M) células tratadas (B). Inserción es la imagen de bajo aumento (barra de escala de 10 micras) de la imagen principal. borde de la herida irregular y filopodios bien que es una protuberancia son visibles después del tratamiento con AIP (B, imagen principal). Longitud de filopodios como salientes se midió utilizando software Image J y se convierte en células histograma de distribución (C) para tratar AIP (barras huecas) y sin tratar (barras rayadas). Se observó un aumento de 8 veces en el área bajo la curva de tratados en comparación con las células no tratadas utilizando un ajuste de Gauss.
implicaciones funcionales de Wnt /Ca
2 + señalización en la próstata las células cancerosas
citoesqueleto juega un papel integral en la motilidad celular. Para investigar las posibles manifestaciones de alteraciones del citoesqueleto se prueba la hipótesis de que la inhibición de CaMKII disminuirá la motilidad celular en líneas celulares de cáncer de próstata. Se utilizó el ensayo cero herida y imágenes de células vivas con Incucyte (Essen Instruments) para calcular la tasa de cierre de la herida como una medida de la motilidad celular. La velocidad de cierre de la herida se redujo en un 80% en líneas celulares de cáncer PC3 tratadas con AIP (Fig. 7 y la película S2, S3 de control y de la película, AIP).
Resultaron heridos
líneas celulares de cáncer de próstata PC3 confluentes y fotografiada durante la noche a intervalos de 1 hora. Las imágenes fueron compuestas (ver Películas S2, S3 y el control, AIP) y los datos importados en una hoja de cálculo. La adición de AIP (10 M, barra rayada) redujo la tasa de cierre de la herida por 80% en comparación con el control (barra hueca, * p & lt; 0,001) o Wnt5A (100 ng /ml, barra sólida). Los datos se presentan como medias ± SE, significación de la diferencia entre el control y AIP se obtuvo mediante ANOVA. Velocidad de cierre de la herida se determinó mediante la realización de regresión lineal para calcular la pendiente de la línea (
El recuadro
, representante de n = 6-7) para el control sin tratar (triángulos rellenos,
R
= 0,99) , Wnt5A (cuadrados rellenos,
R
= 0,99) o AIP (círculo relleno,
R = 0,97)
células PC3 tratadas.
Discusión
Wnt expresión y los mecanismos de señalización de Wnt sigue siendo un ámbito poco investigado en la próstata. Se demuestra que la expresión de (i) la proteína Wnt5A se incrementa en comparación con el tejido maligno de la próstata humana benigna y en el cáncer de líneas celulares en comparación con el normal. (Ii) Wnt5A es importante transductor de señalización de Wnt a través de la activación de Wnt /Ca
2 + vía y no vía Wnt /β-catenina en las células de la próstata. (Iii) La activación de CaMKII es una novela y regulador crítico de citoesqueleto en el cáncer de próstata. (Iv) la inhibición CaMKII disminuye significativamente la motilidad celular y la capacidad de curación de heridas en líneas celulares de cáncer de próstata.
Una comprensión de la base molecular de cáncer de próstata, y el papel desempeñado por las redes tales como Wnt-vía de señalización, requiere no sólo una descripción completa de genes y la expresión de la proteína en el tejido de próstata humano, sino también un sistema celular con la que investigar los mecanismos de señalización y sus consecuencias funcionales en la enfermedad. Nuestras investigaciones de la matriz de tejido de próstata muestran que hubo una diferencia altamente significativa (p & lt; 0,0001) aumento tanto de la superficie total (medida) y el tamaño promedio de las partículas marcadas (intensidad) y la fracción de área (Fig 1E, F y G y la Tabla S2) . Estos resultados apoyan las observaciones anteriores de aumento en la expresión de genes en el cáncer de próstata Wnt5A debido a la hipometilación [23] y también un informe muy reciente por Yamamoto
y un
l [29] que utiliza convencional, no Cuantitativo , el examen histológico para evaluar Wnt5A expresión de próstata. Estos datos también está de acuerdo con la obtenida para el normal (1542-NPTX) y el cáncer (1542-CP
3TX) las líneas celulares (Figura 2). Tomados en conjunto los datos de tejido y línea celular humana sugieren que la proteína Wnt5A se expresa en el tejido normal (o benigno), pero su expresión se incrementa dramáticamente en (cáncer) tejido prostático maligno y este cambio se refleja en las líneas celulares utilizadas en este estudio.
Casi todos los objetivos de transcripción conocidos activadas por la vía /β-catenina vía, por ejemplo, CTNNB1, CCCNDs, MMP, PITX2, CD44, APCDD1 JUN [30] - [32], permanecen sin cambios o están reguladas en los tejidos o líneas celulares de cáncer de próstata en comparación con el tejido normal o línea celular (Fig. S3 y el cuadro S1) . Estos resultados indican que el conjunto de datos la línea celular refleja en gran medida el patrón de expresión génica de TCF /LEF genes regulados tanto en la línea celular y el tejido de cáncer. Además, no hubo aumento en la expresión de proteína o actividad funcional de abajo objetivos de Wnt-señalización canónica (por ejemplo, MMP-14). Esto sugiere que 1542-NPTX y 1542-CP
3TX y líneas celulares PC3 pueden ser un modelo útil para investigar los mecanismos de la señalización de Wnt en cáncer de próstata como la integridad de Wnt elementos en el cáncer de próstata de señalización se conservan en estas líneas celulares en el gen, la proteína y los niveles funcionales.
CaMKII es un mediador clave de Wnt /Ca
2 + señalización aunque se propone un subconjunto adicional de la señalización de Wnt no canónica a través de Wnt5A ser un β-catenina vía de degradación que no requiere la activación de CaMKII [33]. Se observó un aumento de 3 veces en la concentración de calcio libre intracelular después de la adición de Wnt5A en células de la próstata (Fig 3 y de la película S1). Además, no hemos visto una disminución en la expresión de la proteína β-catenina y la actividad de CaMKII fue encontrado para aumentar en líneas celulares de cáncer de próstata, lo que indica que Wnt /Ca
2 + vía era probable que sea operativa a través de la CaMKII en la próstata cáncer
se conocen las múltiples funciones de los CamKII en la remodelación de la actina, la motilidad celular y la migración de los queratinocitos normales, los músculos y las células nerviosas [34] -. [36]. Sin embargo, la participación de CaMKII mediada por Wnt /Ca
2 + señalización en la enfermedad ha sido tan bien caracterizados. Pukrop
et al
[37] sugiere que la vía no canónica puede estar implicada en la migración aumento /invasividad de las líneas celulares de cáncer de mama MCF7 cuando se añade Wnt5A recombinante para el cultivo celular. Sin embargo, los mecanismos o si Wnt5A mediadas su efecto a través de la activación de CaMKII, no fueron investigados. la motilidad de la célula requiere dos tipos principales de estructuras basadas actina en la membrana celular, lamellipodia y filopodios. Se ha propuesto, en los fibroblastos, que la formación de filopodios de lamellipodia es un proceso estrechamente regulado que está parcialmente controlada por proteínas de unión a actina, tales como habilitado fosfoproteína estimulada por vasodilatador (ENA) /(VASP) la limitación de los filamentos de actina [38]. Los fibroblastos se mueven mediante la ampliación de lamelipodia en el borde delantero y la formación de las estructuras de actina finas en el borde anterior produce el movimiento retrógrado [39]; secuestro de Ena /VASP a las mitocondrias aumenta mientras que su orientación a la membrana celular reduce la motilidad [38]. El papel de la señalización mediada por Wnt5A en la motilidad celular [37] y otras proteínas intermediarias (por ejemplo Ena /VASP, Arp2 /3) en la formación de filopodios se ha investigado en [14], [40] y de ratón [41] células de melanoma humano. Weeraratna y colegas [40] sugirieron que Wnt5A aumento de la motilidad celular en líneas celulares de melanoma humano por la activación de la proteína quinasa C (PKC). Witze
et al
[14] demostraron que la respuesta aguda de líneas celulares de melanoma a Wnt5A implica el reclutamiento de las principales proteínas del citoesqueleto (actina y myoxin IIB) y Frizzled 3 y el melanoma molécula de adhesión celular en una estructura intracelular a través de la regulación de Wnt5A Rab4 y guanosina trifosfatasa RhoB. En otro estudio se investigó el papel de ROR2 cinasa en la migración celular inducida Wnt5A [42]. A diferencia de los datos presentados aquí, estos estudios [40], [42] investigado y manipulado directamente la actividad de CaMKII en sus experimentos o investigado su papel en la formación de filopodios. Utilizamos tatCN21a, un inhibidor específico de la CaMKII (pero no CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1, o Raf). El tratamiento de células de cáncer de próstata con tatCN21a también causó una relajación de célula para el contacto celular y la formación de filopodios inducida (Fig. S4), similar a los resultados obtenidos con AIP (Fig. 5). Estos resultados indican que la inhibición directa de CaMKII (y no CaMKIV, PKC, PKA y otras quinasas) resulta en la pérdida de célula para el contacto celular y la formación de filopodios en células de cáncer de próstata.
En líneas celulares de cáncer de próstata (1542 -CP
3TX y PC3) un borde liso y regular la herida se observa con cerca de célula a célula de contacto que precede a la lamelipodia como borde de ataque (Figs. 4 y 5). En contraste, el tratamiento con AIP induce un aumento en filopodios como salientes con una relajación de célula a célula de contacto anterior a la borde de la herida (Fig. 5 y 6 y en la Tabla 1). De hecho, la tasa de cierre de la herida se redujo en un 80% después de la inhibición de la CaMKII en línea celular de cáncer (PC3). Por el contrario, la adición de Wnt5A a la línea celular normal (1542-NPTX) aumentó la tasa de cierre de la herida (m /h) en comparación con las células no tratadas en un 25 ± 4%. Sugerimos que la activación de CaMKII a través de señalización Wnt5A es ventajoso para la movilidad de las células cancerosas, ya que suprime la formación de filopodios bien que inducen el movimiento retrógrado reduciendo así la movilidad celular.
La expresión proteica de Wnt5A en el cáncer de próstata humano y los mecanismos de señalización de Wnt en líneas celulares normales y de cáncer de próstata, que se describen aquí, proporcionar el primer marco en el que la participación exacta de los receptores de Wnt y secretora rizado proteínas relacionadas [20], [21] y varias proteínas de unión a actina y moléculas de señalización intermedias tales como Ena /VASP y ERK1 [34], [38], podría ser investigado en el cáncer. Otras investigaciones para identificar el receptor (s) para la unión Wnt5A y otras proteínas implicadas en la señalización aguas abajo a través de CaMKII en la motilidad celular en el cáncer de próstata ayudará a elucidar el nuevo papel de CaMKII en la supresión de la formación de filopodios para aumentar la motilidad celular en el cáncer de próstata . En conclusión, a partir de los resultados presentados aquí y nuestro estudio reciente [23] que muestra la hipometilación como regulador de Wnt5A transcripción de genes en la próstata, podría preverse la siguiente secuencia: (i) La expresión de genes de Wnt5A se incrementa en el cáncer en comparación con las células normales debido a hipometilación de la región promotora del gen (ii) aumento de genes resultados de la expresión en una mayor expresión de la proteína de Wnt5A en el cáncer de próstata humano (iii) Wnt /Ca
2 + vía (y no vía de β-catenina) se activa en el cáncer de próstata células (iv) la señalización a través de Wnt /Ca
2 + vía activa CaMKII (v) la actividad de CaMKII, muy probablemente a través de la señalización de intermediación con proteínas de unión a actina, provoca una importante reorganización del citoesqueleto de las células cancerosas en que disminuye la duración y la frecuencia de multa , filopodios como las estructuras de actina. (Vi) la remodelación del citoesqueleto debido a CaMKII provoca un aumento de la motilidad celular. La focalización de Wnt /Ca
2 + de señalización, en particular CaMKII puede proporcionar una herramienta útil en la terapia del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
La próstata humana células epiteliales line1542-NPTX y línea celular de cáncer de próstata 1542-CP
3TX [43] (derivadas de tejido normal y cáncer de próstata del mismo paciente [43]) se obtuvieron de SL Topalian, Instituto Nacional del cáncer, NIH, EE.UU., creadores de estas líneas celulares. El carcinoma de próstata PC3 línea celular se obtuvo de M E Kaighn los autores de esta línea celular [44]. DU145 se obtuvo del banco de células mantenida por Jørgen Fogh en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, EE.UU., a partir de un depósito hecho por el autor de esta línea celular [45]. PC3 y DU145 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) que contenía 5 mM de L-glutamina y suero bovino fetal (FBS) y 1542-NPTX y 1542-CP
3TX se mantuvieron en queratinocitos-SFM (KSFM) medio y los suplementos ( Invitrogen) con 5% de SFB y suplementos KSFM (Invitrogen).
PCR cuantitativa en tiempo real
Fluorescent-PCR en tiempo real (TaqMan, Applied Biosystems, Reino Unido) se utilizó para verificar la expresión de genes en 1542 -NPTX y 1542-CP
3TX originalmente identificadas a partir de los experimentos de microarrays [23]. el aislamiento de ARN se describe en otra parte [23]. sondas TaqMan y cebadores para PCR en tiempo real fueron comprados como un sistema de ensayo pre-desarrollado; Applied Biosystems identificadores de ensayo para las sondas utilizadas y un breve protocolo se dan en la Tabla S4.