Extracto
La chaperona molecular GRP78 /BIP es un regulador clave de plegamiento de proteínas en el retículo endoplasmático, y juega un papel fundamental en la supervivencia de las células del cáncer y quimio-resistencia. por lo tanto, la inhibición de su función ha sido una estrategia importante para la inhibición del crecimiento de células tumorales en la terapia del cáncer. Los esfuerzos previos para lograr este objetivo se han utilizado péptidos que se unen a GRP78 /Bip conjugado con profármacos o secuencias de células que inducen la muerte. A continuación, describimos un péptido que induce la muerte de las células tumorales de próstata sin la necesidad de ninguna secuencia de conjugación. Este péptido es una secuencia derivada de la cochaperone Bag-1. Hemos demostrado que esta secuencia interactúa con e inhibe la actividad de replegamiento de GRP78 /Bip. Además, hemos demostrado que modula la respuesta a proteínas desplegadas en el estrés ER resultante en PARP y caspasa-4 de escisión. las células del cáncer de próstata que expresan de forma estable este péptido mostraron una reducción del crecimiento y el aumento de la apoptosis en
y modelos de xenoinjertos tumorales in vivo. Las sustituciones de aminoácidos que destruyeron unión del péptido Bag-1 a GRP78 /Bip o regulación a la baja de la expresión de GRP78 comprometidos el efecto inhibidor de este péptido. Por tanto, esta secuencia representa un péptido plomo candidato para la terapia anti-tumor
Visto:. Maddalo D, Neeb A, Jehle K, Schmitz K, Muhle-Goll C, Shatkina L, et al. (2012) Un peptídico no conjugada GRP78 /Bip ligando modula la respuesta a proteínas desplegadas y la muerte celular induce el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10.1371 /journal.pone.0045690
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2012; Aceptado: 23 Agosto 2012; Publicado: 1 de octubre 2012
Copyright: © Maddalo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación Internacional para la Investigación del cáncer, Reino Unido; la Fundación Alemana de la Ciencia, la Unión Europea sexto programa marco PRIMA, y los fondos de puesta en marcha del Instituto de Tecnología de Karlsruhe. Danilo Maddalo era un beneficiario de una beca de investigación CANCURE Marie Curie en el programa 6ª marco de la Unión Europea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el GRP78 proteína glucosa regulada (también conocido como bip, immunoglobuling proteína de unión a la cadena pesada) es un miembro de la familia de proteínas de choque térmico y juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular [1]. Es el regulador clave de la respuesta de la proteína desplegada (UPR), una vía activa cuando se produce la acumulación de péptidos desplegados durante condiciones de estrés como choque térmico, la acidosis, el hambre de nutrientes y la hipoxia [2].
GRP78 regula la UPR mediante la unión de las proteínas de sensores transmembrana Perk (PKR-como retículo endoplasmático residente quinasa), ATF6 (factor activador de la transcripción 6) y IRE1α (inositol-enzima que requiere α) (revisado en [3]) que conduce por una parte a un aumento de la transcripción de chaperones moleculares como la propia GRP78, GRP94 y isomerasa proteína-disulfuro (PDI) [4], [5] y por otra parte a la proteína de cierre de la síntesis por la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eucariótico eIF2α [6]. Como consecuencia de estos dos efectos, las células superar una sobrecarga de péptidos aberrantes y sobreviven [7]. Sin embargo, la fosforilación eIF2α prolongada activa el factor de transcripción ATF4 [8], [9] conduce a un aumento de los niveles de la CHOP factor de pro-apoptóticos (proteína homóloga C /EBP) [10], [11]. La activación de ER-mediada por estrés resultados de la apoptosis en la escisión de caspsase 4, una caspasa específico ER-estrés y de la PARP (poli (ADP) -ribosome polimerasa) [12], [13].
GRP78 se sobreexpresa en varios tipos de tumores como el de próstata [14], de mama [15], [16] y el colon y su expresión a menudo se correlaciona con mal pronóstico [17], [18], [19]. Sin embargo GRP78 regulación a la baja de siRNA aumenta la apoptosis y sensibiliza a las células a los fármacos quimioterapéuticos [20], [21]. En las células transformadas generales regular al alza el nivel GRP78 [15] para sobrevivir a las condiciones adversas del microambiente del tumor [22], [23], [24]. Por lo tanto, varios agentes terapéuticos se han dirigido contra la UPR o en contra de GRP78 /BIP para frenar el crecimiento de las células tumorales [25], [26] sino que realmente están aún por identificar inhibidores selectivos [15]. En la búsqueda de nuevos inhibidores de la GRP78 /BIP que podrían ser de importancia terapéutica, se utilizó información sobre la regulación del estrés ER por el cochaperone Bag-1 [27] para identificar una secuencia de Bag-1 que se une e inhibe la acción de GRP78 /BIP.
Bag-1 es una familia de cuatro polipéptidos (Bag-1L, -1M, -1 y -1S) con dominios multifuncionales que interactúa con y regula las actividades de diversas proteínas celulares [ ,,,0],28]. Estas proteínas poseen secuencias divergentes N-terminales, pero un dominio de tipo ubiquitina situado en el centro común que forma un enlace para Hsc /Hsp70 para el proteasoma [29] y un dominio de unión C-terminal Hsp70 conservada (también conocido como el dominio BAG) que se une a Hsp70 /Hsc70 y funciona como un factor de intercambio de nucleótidos [30], [31]. Bag-1 también se ha demostrado que regulan retículo endoplasmático (ER) inducida por el estrés de la apoptosis [27] y de obligar GADD34, un componente del estrés ER [32], pero no se conocen los detalles de su acción.
en esta comunicación nos muestran que la Bolsa-1 se une a GRP78 /Bip a través de un péptido de la superposición de su dominio semejante a la ubiquitina. Además, muestran que la GRP78 /péptido de unión de BiP de Bag-1 inhibe la acción de GRP78 /Bip e interfiere con el examen periódico universal que conduce a la inducción de la apoptosis. Hemos reducido este péptido e identificado un motivo central de siete aminoácidos que parece esencial para la unión a GRP78 /Bip y para la regulación negativa de crecimiento de células tumorales de próstata. Esta secuencia central podría ser el punto de partida de futuras terapias dirigidas a la inhibición de la acción GRP78 /Bip y de la UPR.
benigna Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Humano línea celular de próstata hiperplasia HPB-1 se cultivaron en Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) suplementado con glutamina. células PC3 y DU145 también se cultivaron en DMEM sin glutamina pero 22Rv.1, LNCaP y PNT-2 células fueron cultivadas en RPMI 1640. Todos los medios de cultivo anteriores se complementaron con suero bovino fetal 10%. células RWPE-1 se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos. Todos los medios de cultivo se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2.
Los anticuerpos
anticuerpo monoclonal de cabra GRP78 (N20), anticuerpos policlonales de conejo contra Bag-1 (C-16), eIF2α y fosfo-PERK fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania. policlonal de conejo anti-GRP78 (ab21685), anti-GCN2 (ab37674), anti-PERK (ab65142), anti-fosfo-IRE1α (ab124945) anticuerpos monoclonales de conejo anti-phopsho-GCN2 (ab75836) de anticuerpos y monoclonal de ratón anti-β actina de anticuerpos (ab8226) fueron adquiridos de Abcam, Cambridge, Reino Unido. anticuerpo de ratón contra HA-tag (HA.11 clon 16B12) se adquirió de Covance, Munich, Alemania. anticuerpo monoclonal de rata contra la HA (3F10) se adquirió de Roche, Mannheim, Alemania. Los anticuerpos contra IRE1α, fosfo-eIF2α CHOP, PARP y ATF4 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología, Frankfurt am Main, Alemania. anticuerpo anti-ATF6 se adquirió de imgenex, Hamburgo, Alemania. anticuerpo caspasa 4 se adquirió de MBL, Munich, Alemania.
vectores de expresión y plásmidos
El vector de expresión pcDNA3.1-HA-Bag-1 codifica Bag-1 ha sido descrito previamente por [ ,,,0],33]. La construcción que codifica Bag-1Δ68mer (Bag-1 carece de los aminoácidos 202-269) fue creado por la sustitución del fragmento Sac II-Xba I de la Bolsa-1 cDNA en una construcción de pcDNA3-Bag-1. La construcción de pcDNA3-HA-1 bolsa de péptido (202-269 Bag1-L), N-terminal (Bag-1L 202-241), C-terminal (Bag-1L 241-269), 19-mer (Bag-1L 202 -220), ΔUbi (Bag-1L 220-269) y 19-mer mutante (Bag-1L 202-220) péptidos fueron creados mediante amplificación por PCR con una secuencia de HA. Como control, se introdujo la secuencia de HA en el vector pcDNA3 para generar el vacío vector de expresión pcDNA3.1-HA. pcDNA3.1 Bag-1ΔC47 (Bag-1 que carece de los últimos 47 aminoácidos) se clonó en los sitios Bam HI-Xho I de pcDNA3.1-HA vector después de la amplificación por PCR usando pcDNA3.1-HA Bag-1 como plantilla. Para los experimentos GST-pull-down, pGEX4T.1-Bag-1 de secuencia 68mer, péptido-terminal pGEX4T.1-N, péptidos pGEX4T.1-C-terminal, pGEX4T.1 Bag-1Δ Ubi, y pGEX4T.1-19mer mutantes pGEX4T.1-19mer fueron creados por la fusión de los productos de amplificación de PCR de la respectiva secuencia de Bag-1L en el marco con GST en el vector pGEX4T.1. plásmidos que codifican GST para fusionada GST-GRP78, GRP78-ATPasa (GRP78 1-408), GRP78-SBD (GRP78 409-651) y Bag-1 isoformas se generaron por PCR y se clonaron en pGEX4T.1 después de la digestión BamHI-XhoI. El plásmido pCMV6-GRP78 [34] se adquirió de OriGene Technologies (Darmstadt, Alemania).
La transfección celular, siRNA de la precipitación y transferencia Western
A menos que se indique lo contrario, la transfección estable se llevó a cabo en 22Rv.1 o células con 10 g de ADN de plásmido utilizando Fugene 6 1 BPH-™ (Roche Diagnostics Mannheim, Alemania) transfectadas de forma estable se seleccionaron 22Rv.1 células con 0,8 mg /ml mientras que los clones-1 BPH células se seleccionaron con 1,2 mg /ml G418. LNCaP, PC3, DU145, se seleccionaron clones PNT-2 y RWPE-1 de células con G418 1 mg /ml. regulación a la baja de la expresión específica de GRP78 se consiguió mediante la transfección de ARNsi dúplex (GRP78:5'-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ') dos veces en 72 h utilizando HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Alemania). siRNA contra GFP (5'-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 ') se utilizó como control. Se realizó un análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [35].
Co-inmunoprecipitación
22Rv.1 células se utilizaron para estudios de interacción de endógena Bag-1 y GRP78 /BIP, mientras que para el
in vivo
interacción del péptido Bag-1 y GRP78 /bip, células HEK-293 fueron transfectadas con un plásmido que codifica HA-etiquetados Bag-1 péptido. Veinticuatro horas antes del experimento, las células en ambos casos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se trataron con 20 mM ditiobis (succinimidil propionato) (DSP) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con Tris 20 mM y las células se lisaron en 50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, 0,4% de NP40 y un 1% de cóctel inhibidor de proteasa. La inmunoprecipitación de GRP78 /Bip se llevó a cabo durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-GRP78 acoplado a Sepharose granos (Abcam, ab21685). La unión de la Bolsa endógena-1 o de HA-péptido se determinó por Western Blot utilizando una Bolsa-1 o un anticuerpo específico de HA.
Protein Expression and Preparación de muestras
Un TEV GB1 proteasa escindible -fused Bag-1 péptido se expresa en el
Escherichia coli cepa BL21
etiquetado uniforme (DE3) pLys S. con
15N para la espectroscopia de RMN se logró haciendo crecer las bacterias en medio mínimo suplementado con 0,5 g /l
15nH
4Cl. El GB1-His
proteína 6-tagged se purificó sobre una columna Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania), posteriormente digerido con proteasa TEV recombinante y pasar sobre una segunda columna de Ni-NTA para eliminar tanto la etiqueta de fusión y la su
6-etiquetados proteasa. Finalmente, el tampón de proteína se cambió a fosfato de potasio 20 mM, NaCl 100 mM, pH 6,8. La concentración de proteína se estimó mediante la comparación de la intensidad de un espectro 1D de RMN con el de una sustancia de referencia (ácido DSS, 2,2-dimetil-2-silapentane-5-sulfónico).
El GST-HA-etiquetados péptidos N-terminales y C-terminales se produjeron utilizando el protocolo estándar. El resto GST se escinde por digestión con trombina de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Roche, Mannheim, Alemania). La preparación de péptidos en bruto resultante se purificó adicionalmente por HPLC de fase inversa (columna C18; 250 × 10 mm, Grace) con un gradiente lineal de agua /acetonitrilo. La identidad y la pureza de las fracciones recogidas se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (Bruker Autoflex III). El pH se neutraliza antes de la liofilización. El péptido se disolvió en KPO 20 mM
4, pH 6,8. La concentración de proteína se calculó a partir de la densidad óptica a 275 nm utilizando la absorbancia de las tirosinas en el HA-tag.
CD Spectroscopy
Los espectros de CD de los péptidos se registraron en un Jasco J- 810 espectropolarímetro (Jasco Co., Tokio, Japón) a 20 ° C, utilizando un soporte de cubetas termostatizado-agua. Las concentraciones de los péptidos Bag-1, N-terminales y C-terminales fueron 17 mM, 12 mM y 11 mM, respectivamente. Los espectros de CD son promedios de tres exploraciones a una velocidad de barrido de 10 nm min
-1, 4 s tiempo de respuesta y 1 nm ancho de banda, y fueron alisado por el método de suavizado de adaptación que es parte del software Jasco Análisis Spectra . La contribución de amortiguación se restó.
Los experimentos de RMN
La concentración de proteína para el experimento de RMN fue de 0,5 mM. Para la calibración del desplazamiento químico y comparar las intensidades de señal relativas, se añadió DSS 0,2 mM (2,2-dimetil-2 silpentane-5-sulfónico).
espectros HSQC-15N fueron adquiridas a 23 ° C en un espectrómetro Bruker Avance 600 II (Bruker, Karlsruhe) equipado con un cabezal de sonda triple resonancia de banda ancha con 4 barridos por incremento y un total de 128 incrementos en la dimensión indirecta. Los datos se procesaron con NMRPipe [36] y se analizaron mediante RMN VISTA.
Ensayos de polarización de la fluorescencia
ensayos de polarización de fluorescencia se llevaron a cabo utilizando un lector Infinito F-200 (Tecan) con excitación a 490 nm y emisión a 535 nm.
xenoinjertos de tumores Estudios
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la normativa legal europea y alemana. Para la generación de modelos de xenoinjerto 5 × 10
6 células LNCaP se resuspendieron en una solución de 50% Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Alemania) en PBS o 5 × 10
6 22Rv.1 células en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de 6-8 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos. El tamaño del tumor se midió con un calibrador cada semana. Los tumores derivados de la inyección de clones estables que sobreexpresan el péptido Bag-1 se analizaron durante un período de 9 semanas mientras que los tumores de células transfectadas con el vector de expresión vacío o expresar el N-terminal, se analizaron el C-terminal y el Delta N-péptido más de 5 semanas. El tamaño del tumor se evaluó midiendo tres diámetros perpendiculares de acuerdo con la fórmula: V = (1/6) [π] (d1d2d3), donde π es una constante matemática y d1, d2 y d3 representan las tres dimensiones espaciales (anchura, profundidad y altura ). Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los tumores retirados para su posterior análisis.
Experimentos
GST-pull-down
Expresión de proteínas de fusión GST para experimentos GST-pull-down se realizaron esencialmente como se describe anteriormente [37].
la inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en formalina al 10% durante 16 horas a temperatura ambiente, almacenados en etanol (50%), parafina y se seccionó 5 micras de espesor con una Leica RM 2155 microtomo. Se detectaron células apoptóticas a través de fin de etiquetado nick desoxiuridina trifosfato-biotina ensayo de transferasa mediada por desoxinucleotidil terminal (TUNEL) utilizando la fragmentación del ADN ApopTag® peroxidasa
in situ
kit de detección de apoptosis (Millipore, Schwalbach, Alemania).
viabilidad celular ensayo
CellTiter-Blue® (Promega) se utilizó para la determinación de la viabilidad celular. Brevemente 22Rv.1 células que sobreexpresan de forma estable el péptido Bag-1 se sembraron en dos placas de 96 pocillos (4500 células /pocillo) y las mediciones se realizaron por triplicado. Una placa se analizó en el día 0 y la otra placa, 2 días más tarde. Tres horas después de la siembra, se añadieron 20 l de medio de contraste para cada pocillo que contiene 100 l de medio de cultivo y se incubaron durante 4 horas a 37 ° C. Se midió la fluorescencia por el fluorómetro de placa de leer Fluostar Optima (2001, BMG Labtechnology, software versión 1,10-0) y se presentó como la relación entre el valor de la longitud de onda de excitación (560 nm) sobre la longitud de onda de emisión (590 nm). La proliferación celular se determina a partir de la diferencia entre la intensidad de fluorescencia en el punto de tiempo final y el valor obtenido en el día de la siembra de las células (día 0).
In vivo
replegamiento Ensayo
En ensayo in vivo de replegamiento se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con el método descrito por [38]. HEK-293 en un plato -confluent 70% 10 cm se transfectaron con la construcción de β-actina del fuego de la mosca de la luciferasa (2 g), pCMV6-GRP78 (3 g), Bolsa-1 o Bag-1 péptidos en pcDNA3.1-HA (6 g) y Renilla constructo de luciferasa (0,5 mg) para el control de la igualdad de la transfección. Dos días después de la transfección las células se dividieron en dos y se incubaron en tampón de choque térmico (MOPS 20 mM y cicloheximida 20 g /ml) durante 30 min a 37 ° C. Un medio de las células transfectadas era calor conmocionado durante 30 min a 45 ° C y se dejó recuperar a 37 ° C durante 30 min. La otra mitad se dejó sin tratar y se usó como control. Al final de los experimentos, las células se recogieron, se lisaron y se midió la actividad de luciferasa. La actividad medida por la no-calor conmocionado células se fijó como 100% de luciferasa replegada y las mediciones de la actividad del calor sorprendieron células se expresaron en relación a este valor.
Análisis estadístico
A menos que se indique lo contrario cálculos de significación estadística en este trabajo se realizó de acuerdo a la prueba de la t de Student.
resultados
Bag-1 interactúa con GRP78 /Bip
Como se informó Bag-1 para mediar ER-estrés y de interactuar con uno de los componentes de la UPS [27], [32], se investigó si también se une a la GRP78 /bip, un componente clave en la ruta estrés ER. Se determinó en primer lugar si Bag-1 interactúa con GRP78 /BIP en un ensayo de GST pull-down usando lisado de células de cáncer de próstata 22Rv.1. El análisis de transferencia de Western usando un GRP78 /Bip anticuerpo específico mostró que todos los miembros de la familia Bag-1 de proteínas interactuado con GRP78 /de BiP (Figura 1A).
In vivo
interacción también se demostró en un ensayo de co-inmunoprecipitación en el que se muestra Bag-1 para unirse a GRP78 /Bip en 22Rv.1 células (Figura 1B). Por otra parte, hemos podido demostrar una localización perinuclear de Bag-1 y GRP78 /BIP en un ensayo de inmunofluorescencia utilizando 22Rv.1 células (Figura 1C) que impliquen una ER localización de Bag-1. Este hallazgo fue confirmado en otro experimento de inmunofluorescencia donde pudimos mostrar colocalización de Bag-1 con un rastreador de ER (Figura S1).
Para determinar el dominio de GRP78 /Bip implicado en su unión a Bag-1, se constructos de fusión GST usado de las dos regiones principales de GRP78 /BIP (la ATPasa y la unión del sustrato de dominio-SBD) (Figura 1D) en tirar abajo los experimentos con células HEK-293 que sobreexpresan Bag-1. El análisis de transferencia Western mostró que Bag-1 interactuaba no sólo con la longitud completa GRP78 /Bip sino también con su ATPasa y SBD (Figura 1E). Como se informó Bag-1 para unirse al dominio de unión de la ATPasa de la chaperona molecular Hsp70 /Hsp70 [39] y GRP78 /Bip pertenece a esta familia de chaperones [40], nuestro hallazgo de que el SBD de GRP78 /Bip está también obligado por Bag-1 es bastante intrigante e identifica un sitio de interacción novela de Bag-1 en la familia chaperona molecular. Por ello, utilizó el SBD de GRP78 /BIP en la caracterización adicional de la interacción de GRP78 /BIP con el bolso-1.
A. La familia Bag-1 de proteínas se une GRP78 /BIP. desplegable ensayo GST se llevó a cabo la incubación de 5 mg cada una de GST-fusionados Bag-1 proteínas con 400 g de lisado de células 22Rv.1. Western Blot con un antibodiy específica contra GRP78 /Bip se utilizó para detectar la unión y se usó un anticuerpo anti-GST para determinar la cantidad de proteína en bacterias purificado empleado en el ensayo. B. Bag-1 y GRP78 interactúan
in vivo
. GRP78 se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-GRP78 /Bip o IgG como control en 22Rv.1 células. Se realizó la transferencia Western con un anticuerpo anti-Bag-1 y anti-GRP78 para determinar GRP78-Bag-1 interacción. C. Bag-1 y GRP78 /Bip muestran una colocalización perinuclear. análisis microscópico confocal se llevaron a cabo en 22Rv.1 células que han sido paraformaldehído-fijaron y tiñeron con un anticuerpo Bag-1 para detectar Bag-1 (canal verde) y un anticuerpo específico GRP78 /Bip para detectar GRP78 /Bip (canal rojo) . La tinción de color naranja en la combinación de los dos canales indica el grado de co-localización de las dos proteínas. Todas las imágenes (40x) fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica TCS SPE (Leica Microsystems; Escala barras indican 25 micras). D. Representación esquemática de los dominios de la GRP78. E. Bag-1 se une a múltiples sitios en GRP78. GST-tirar hacia abajo ensayo realizado incubando 500 mg de lisado de células HEK-293 células transfectadas con un GST-fusionado Bag-1 y 10 g GRP78 de longitud completa marcada con HA y su dominio de unión a ATPasa y sustrato (SBD). El análisis de transferencia Western se llevó a cabo utilizando un anticuerpo HA para detectar la proteína marcada-Bag-1. Se muestra una tinción con azul de Coomassie de las proteínas purificadas GST en bacterias para demostrar la igualdad de carga de las proteínas GST.
análisis GST-pull down se llevaron a cabo con el SBD de GRP78 /Bip y lisado de células HEK293 que expresan el tipo salvaje Bag-1, Bolsa-1ΔC47, un C-terminal supresión mutante o Bag-1Δ68mer, un mutante de deleción interna. Estos estudios identificaron una secuencia interna de 68 aminoácidos como un objetivo de la interacción de Bag-1 con GRP78 /Bip (Figuras 2A y B). La supresión de esta secuencia (Bag-1Δ68mer) abolió la interacción de Bag-1 con GRP78 /BIP (Figura 2B carril 11), mientras que la expresión de la secuencia de 68 aminoácidos sola mostró que sí es necesaria para la unión del SBD de GRP78 /BIP ( Figura 2B carril 12). Este hallazgo se confirmó además en un
in vivo
experimento co-inmunoprecipitación donde un HA-etiquetados péptido Bag-1 expresado en células HEK 293 interactuado con GRP78 endógeno /proteína de BiP (Figura 2C carril 3).
A. Representación esquemática de Bag-1 y sus mutantes de deleción se utiliza para la identificación de secuencias requeridas para la unión de la SBD de GRP78 /Bip. Representado en azul y rojo son el dominio semejante a la ubiquitina y el dominio BOLSA respectivamente. B. Identificación de la Bolsa-1 vinculante para GRP78 /Bip péptido. GST-tirar hacia abajo ensayo realizado incubando 500 mg de lisados de células HEK-293 transfectadas con las construcciones Bag-1 se indican y 10 g de GST-GRP78 (SBD) o GST como control. se muestra el análisis de transferencia Western con un anticuerpo HA a los mutantes detectados Bag-1. Tinción con azul de Coomassie se realizó para demostrar igualdad de carga de las proteínas de fusión GST. C. Los Bag-1 68 aminoácidos del péptido se une el ácido
in vivo
a GRP78. células HEK 293 fueron co-transfectadas con-HA-etiquetados pcDNA péptido Bag-1. Las células transfectadas se trataron con Ditiobis mM 2 (succinimidilpropionato) para reticular las proteínas y los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA o IgG como control, seguido de transferencia Western con un anticuerpo anti-GRP78 /Bip. D. La Bolsa-1 péptido de 68 aminoácidos inhibe la actividad de replegamiento /Bip GRP78.
In vivo
de ensayo de luciferasa de replegamiento se llevó a cabo en las células HEK-293 transfectadas en 70% de confluencia con 2 g β-actina-fuego constructo mosca luciferasa, 3 g pcDNA3 vector vacío como control o pCMV6-GRP78 /Bip, 6 g de la pcDNA3.1-Bag-1 o construcciones mutantes y 0,5 g Renilla luciferasa constructo indicado para determinar la eficiencia de transfección. Las células transfectadas se dividieron en dos. Una mitad se dejó sin tratar y el otro medio se sorprendió calor a 45 ° C durante 30 min. A partir de entonces se midió la actividad luciferasa. Los resultados se expresan como porcentaje de replegamiento actividad relativa a las células no-calor conmocionado y presentan como gráficos de barras de la media de tres experimentos independientes ± SEM. * P & lt;.
0,05
A. modulación de la UPR en Bag-1 sobreexpresión de péptidos. clones agrupados de células transfectadas con pcDNA3.1 22Rv.1-HA-Bag-1 péptido de 68 aminoácidos o un vector de expresión vacío fueron tratadas con 300 nM thapsigargin (TG) para los puntos de tiempo indicados. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos indicados o anticuerpos fosfo-específicos. B. El péptido Bag-1 sensibiliza a las células a la apoptosis inducida 22Rv.1 ER-estrés. clones agrupados de 22Rv.1 transfectadas con el péptido Bag-1 o el vector de expresión vacío se trataron con tapsigargina (TG) o glucosa-hambre (GS) por 24 h. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia de Western usando anti-PARP y caspasa 4 anticuerpos específicos. El anticuerpo anti-HA se utilizó para detectar el péptido HA-Bag-1. El anticuerpo anti-β-actina se utilizó para demostrar igualdad de carga de las muestras de proteína. C. GRP78 regulación a la baja aumenta la escisión de PARP. clones agrupados de 22Rv.1 que expresan HA-etiquetados Bag-1 péptido o un vector de expresión vacío se transfectaron con GRP78 /Bip siRNA o control GFP siRNA. Las células se lisaron y Western blot se llevó a cabo con anticuerpos anti-HA anti-PARP, anti-GRP78 y. β-actina anticuerpo se utilizó para determinar el nivel de proteína cargada en el gel.
Varios estudios han demostrado que GRP78 /Bip coopera con PDI en el replegamiento de proteínas desnaturalizadas
in vitro
[ ,,,0],41], [42]. Para determinar si GRP78 /BIP también posee la capacidad de plegar proteínas desnaturalizadas
in vivo
, hemos adoptado un ensayo de replegamiento utilizado anteriormente para determinar la actividad chaperona Hsp70 de
in vivo
[43] En este ensayo, las células HEK-293 fueron transfectadas con un plásmido que codifica un gen de luciferasa y un plásmido de expresión para GRP78 /Bip. Las células fueron brevemente térmicamente sorprendidos y a partir de entonces la actividad de luciferasa de las células transfectadas que expresan GRP78 /Bip se comparó con la de las células que expresan no GRP78 /BiP. Este estudio mostró que la sobreexpresión de GRP78 /Bip mejora de forma significativa la actividad de luciferasa después del choque térmico (Figura 2D) que demuestra la capacidad de GRP78 /Bip replegar luciferasa desnaturalizada
in vivo
. Si las células se transfectaron adicionalmente con Bag-1 o el ácido 68 amino Bag-1 péptido que se une GRP78 /bip, la actividad replegamiento de GRP78 /Bip se redujo al nivel de control (Figura 2D). Este no fue el caso cuando Bag-1Δ68mer que no se une GRP78 /BIP se cotransfectaron. Estos estudios demuestran que el péptido Bag-1 interfiere con la actividad de replegamiento de GRP78 /Bip. Sin embargo, el péptido Bag-1 no tiene ningún efecto sobre la actividad de ATPasa de GRP78 /Bip aunque Bag-1 aumentó esta actividad enzimática (Figuras S2A y S2B). Esto indica que la bolsa-1 péptidos funciona diferente de la longitud completa Bag-1. Por lo tanto, nos embarcamos en la caracterización de este péptido como un ligando para GRP78 /BIP para uso terapéutico futuro.
A. clones estables de células 22Rv.1 muestran una viabilidad celular reducida
in vitro
. clones estables se sembraron en una placa de 96 pocillos y el número de células en cada pocillo se calculó mediante la medición de la relación entre la longitud de onda de excitación y emisión 560/590 nm utilizando el ensayo de proliferación de CellTiter-Blue ™. Los gráficos de barras representan la media de al menos cuatro experimentos independientes ± SD (* p & lt; 0,05). B. Determinación del nivel de la bolsa-1 expresada en las 22Rv.1 clones. Los extractos celulares de 22v.1 clones estables se sometieron a análisis de transferencia Western. Un anticuerpo anti-HA se utilizó para detectar el péptido y un anticuerpo anti-β-actina para el control de carga igual. DISCOS COMPACTOS. El péptido Bag-1 reduce 22Rv.1 crecimiento de células tumorales de próstata
in vivo
. Seis semanas de edad ratones desnudos atímicos se les inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos con 5 × 10
6 células de cada clon estable. El tamaño del tumor se midió una vez por semana usando un calibrador y se expresa como el volumen del tumor en mm
3. Se muestra (C) los volúmenes tumorales de los clones transfectados con el vector de expresión vacía y clones (D) que expresan el péptido Bag-1. Cada punto representa el volumen medio y la desviación estándar de al menos 5 a 10 tumores. E. Los xenoinjertos de clones estables que expresan el péptido muestre Bag-1 aumentó la apoptosis. secciones de cinco micras de tejidos tumorales, incluidas en parafina fijadas con formalina se sometieron a técnicas de inmunohistoquímica. Los núcleos se tiñen de azul-púrpura con hematoxilina mientras que las células apoptóticas detectadas con el ensayo de TUNEL se tiñen de color marrón. secciones representativas de xenoinjertos obtenidos a partir de cada clon estable 22Rv.1 fueron adquiridas con un microscopio Axioscop (Zeiss). V: es sinónimo de vacío de vectores que expresan el clon y P:. Péptido que expresan el clon
Utilización de una Bolsa-1 péptido para inducir la apoptosis y reducir el cáncer de próstata el crecimiento celular
Durante estrés ER, se desarrolló péptidos se acumulan en la sala de emergencia y GRP78 /Bip juega un papel fundamental para ajustar la capacidad de plegamiento de proteínas mediante la activación de tres vías de señalización (Perk, IRE1α, y ATF6) [44], [45]. PERK se autophosphorylated conduciendo a la fosforilación de la subunidad alfa de eIF2 y la síntesis de proteínas de apagado. Fosforilada eIF2α aumenta selectivamente la traducción del factor de transcripción ATF4 que aumenta la expresión del gen diana UPR como GRP78 /Bip [44], [45] y también se IRE1α autophosphorylated conduce a la activación de la síntesis de chaperona través de la activación Xbp1. ATF6 se escinde de manera proteolítica para participar en la regulación positiva de la expresión de los genes diana de la UPR [44], [45]. Sin embargo la apoptosis es inducida si la homeostasis no se puede establecer [46]. Por lo tanto, determinar si la unión del péptido-1 Bolsa de GRP78 /BIP, el componente clave de estrés ER, afecta a las vías de señalización de la UPR.
A. Diagrama esquemático de la bolsa de péptido-1 y sus mutantes de deleción. El dominio semejante a la ubiquitina se representa en azul y el dominio BAG en rojo. Los números se refieren a las posiciones de aminoácidos de los diferentes dominios. Los residuos de aminoácidos se numeran siguiendo la numeración para Bag-1L. B. Predicción de la estructura secundaria del péptido Bag-1, que muestra una β-horquilla N-terminal del dominio semejante a la ubiquitina (azul) y un C-terminal α-hélice del dominio BAG (rojo). C. normalizaron los espectros de dicroísmo circular de los péptidos Bag-1. 30 M del péptido Bag-1 se midieron en KHPO mM 20
4 buffer, pH 6,8 (línea de color negro). Su contenido en α-helicoidal se estimó en aproximadamente el 25% en la deconvolución de los espectros (línea roja). 12 M del péptido N-terminal (línea verde) y 11 M de C plazo (línea azul) se midieron en las mismas condiciones. D.
1 H
15 N-HSQC espectro de RMN de
marcada con 15N-1 bolsa de péptido (202-269) en 20 mm KHPO
4, pH 6,8, a 23 ° C. La dispersión espectral estrecha indica que el péptido no presenta una estructura globular plegada. El H
δ y H
señales de las cadenas laterales varepsilon de la asparagina y la glutamina están conectados por las líneas finas. E. La región N-terminal del péptido Bag-1 es importante para la unión GRP78. 400 g de lisado de células 22Rv.1 se incubaron con perlas de glutatión-agarosa que llevan 15 g GST-N-término péptido (carril 2), GST-C-término péptido (carril 3), péptido GST-ΔUbi (carril 4), GST (* P & lt; 0,05). [48]. * P & lt; 0,05.