Extracto
EMT (transición epitelio-mesenquimal) es crucial para las células cancerosas adquieren fenotipos invasivos. En las células de adenocarcinoma de pulmón A549, el TGF-β provocó EMT en Smad dependiente de la forma y el TNF-α se aceleraron este proceso, según lo confirmado por la morfología celular, la expresión de marcadores de EMT, la capacidad de lisis celular y la invasión de gelatina. TNF-α estimula la fosforilación de la región de engarce Smad2, y este efecto se atenúa mediante la inhibición de la vía MEK o JNK. Análisis de la expresión completa de genes desentrañado regulados diferencialmente por el TGF-β y TNF-α, tales como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y ECM (matrices extracelulares), lo que sugiere el cambio drástico en señales autocrina /paracrina así como las interacciones de célula a ECM. análisis integrado de microARN firma nos ha permitido identificar un subconjunto de genes potencialmente regulados por los microARN. Entre ellos, se confirmó la inducción mediada por TGF-β de miR-23a en líneas de células epiteliales de pulmón, los genes diana de los cuales fueron identificados además por perfiles de expresión génica. En combinación con los enfoques in silico, se determinó HMGN2 como objetivo abajo de miR-23a. Estos resultados proporcionan una línea de evidencia de que los efectos de TGF-β y TNF-α fueron parcialmente mediada por microRNAs, y arrojan luz sobre la complejidad de los acontecimientos moleculares provocados por el TGF-β y TNF-α.
Visto : Saito A, Suzuki HI, Horie H, Ohshima H, Morishita Y, Abiko Y, et al. (2013) Un perfiles de expresión integrado revela genes diana del TGF-β y TNF-α posiblemente mediado por los microARN en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10.1371 /journal.pone.0056587
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2012; Aceptado: January 11, 2013; Publicado: 20 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Saito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (Grants-en-ayudas a la Investigación Científica) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología y subvenciones del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el tipo de cáncer más frecuente, lo que causa la muerte de más de un millón de personas cada año. Comprensión de los eventos moleculares que gobiernan la propagación invasivo /metastático de las células cancerosas es crucial para el desarrollo de nuevos productos terapéuticos de cáncer de pulmón. Transición epitelio-mesenquimal (EMT) es el interruptor de la diferenciación de las células epiteliales dirigir para adquirir fenotipos mesenquimales, que desempeña un papel clave durante el desarrollo embrionario, así como la invasión del cáncer /metástasis. El sello distintivo de la EMT es la regulación por disminución de E-cadherina y la posterior pérdida de adherencias célula-célula, que está acoplado con el aumento de la expresión de marcadores mesenquimales incluyendo N-cadherina y vimentina. Además EMT se acompaña de cambios morfológicos de células de 'cúbico' a las apariciones de huso como ', que corresponden a la reorganización de la actina y alteraciones cytoskeltal, lo que lleva a la adquisición del fenotipo migratorio similar a fibroblastos [1], [2].
la transformación del factor de crecimiento (TGF) -β juega un papel central en la regulación de la EMT y exhibe sus efectos pleiotrópicos mediante la unión a receptores de tipo I (TβR-I) y tipo II (TβR-II). Tras la formación de complejos heteroméricos inducida por ligando entre TβR-I y TβR-II, TβR-I es fosforilada por TβR-II y media la señalización intracelular específica a través de la fosforilación de Smad regulados por el receptor (R-Smads: Smad2 y Smad3 para el TGF-β) . Fosforilada R-Smads interactuar con Smad4 y se translocan en el núcleo, donde regulan la transcripción de genes diana [3], [4]. TGF-β es a menudo sobreexpresado en los tejidos tumorales, y facilita la progresión del cáncer a través de un repertorio diverso de interacciones de células tumorales autónomos y host-tumorales, incluyendo la mejora de la motilidad celular y la invasión, que implica el proceso de EMT [5].
la acumulación de pruebas desenreda los mecanismos moleculares por los que las respuestas inflamatorias promueven la progresión tumoral [6]. factor de necrosis (TNF) -α tumor es una de las citoquinas pro-inflamatorias más potentes producidos en el microambiente tumoral. Tras la estimulación, IKK activado (I? B quinasa) fosforila inhibidor de NFkB (I? B) y desencadena su degradación rápida a través de la proteolisis del proteasoma, lo que resulta en la liberación de NFkB, que entonces se transloca al núcleo e induce una miríada de la expresión de genes implicados en la respuesta inmune [7 ]. La contribución de NFkB señalización a la iniciación y progresión del cáncer está claramente documentada, y varias líneas de evidencia demuestran que el TNF-α y /o la señalización de NFkB juega un papel clave en la regulación de la EMT [8], [9], [10 ].
Noncoding microARN (miARN) de creciente atención como componentes clave de la señalización celular, que regulan los niveles de expresión de múltiples proteínas, principalmente mediante la unión a la región no traducida 3 '(UTR) de objetivos. los papeles importantes de miRNAs se han mostrado en la progresión tumoral mediante la modulación de la diferenciación celular, la proliferación, invasión y metástasis. El microARN-200 (miR-200) y miR-205 están críticamente involucradas en el mantenimiento del fenotipo de las células epiteliales y se suprimen por el TGF-β [11]. También se informa de que el miR-21 y miR-31 se inducen sinérgicamente por el TGF-β y TNF-α, que facilitan la invasión de las células del cáncer [12].
Los estudios recientes han demostrado que el TNF-α aumenta TGF EMT β mediada por las células epiteliales de cáncer de pulmón /[13], [14], [15], lo que sugiere los crosstalks potenciales entre estas señales. Sin embargo, poco se sabe acerca de los eventos moleculares de cómo se instrumentan estas señales para modular la EMT. Hemos demostrado previamente que el TGF-β induce EMT en células de adenocarcinoma de pulmón A549 [16], que alberga una mutación K-ras activar y formar un tumor con histología de adenocarcinoma bien diferenciado cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos [17], [18] . En el presente estudio, hemos explorado los mecanismos subyacentes de la EMT mediadas por TGF-β y TNF-α en células A549. En busca de los genes diana y miRNAs, hemos realizado análisis de la expresión completa en combinación con el cribado in silico. Estos datos delineados subconjuntos de genes diferencialmente o de forma cooperativa regulados por TGF-β y TNF-α, e identificado miR-23a como un objetivo miARN del TGF-β. Estos análisis implican aún más la posibilidad de que un subconjunto de los genes diana TGF-beta podría ser regulada por miRNAs, arrojando luz sobre la complejidad de los acontecimientos moleculares provocados por el TGF-β y TNF-α en células de cáncer de pulmón.
Materiales Métodos y
Reactivos y anticuerpos
TGF-β1 y TNF-α fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y el amplificador de I +; D Systems (Minneapolis, MN), y estaban utilizado a la concentración de 5 ng /ml y 10 ng /ml, respectivamente. Anti-Smad2, fosforilada (fosfo) Smad2 en la Ser 245/250/255, fosfato Smad2 en la Ser 465/467, Smad3, fosfo-Smad3 en la Ser 423/425, Smad4, Erk, fosfo-ERK, p38, fosfo- p38, fosfo-c-jun y e-cadherina anticuerpos eran de Señalización celular (Beverly, MA). anticuerpo anti-N-cadherina fue de BD Pharmingen (Transducción Laboratories, Lexington, KY). El anticuerpo anti-α-tubulina era de Sigma-Aldrich. El anticuerpo anti-HMGN2 era de Millipore (Darmstadt, Alemania). LY-364947 (TβR-I inhibidor) se utilizó a una concentración de 3 mM. U0126 (MEK 1/2 inhibidor), SP600125 (inhibidor de JNK) y SB203580 (inhibidor de p38) se utilizaron a una concentración de 25 mM.
Cultivo celular
células de adenocarcinoma de pulmón A549 [19] fueron dotados desde el Centro Móvil de recursos para la Investigación Biomédica, Instituto de Desarrollo, Envejecimiento y cáncer de la Universidad de Tohoku (Sendai, Japón). NCI-H441 (H441) células de adenocarcinoma de pulmón y células HEK293T fueron de la American Type Culture Collection. Las células transformadas humanas bronquiales epiteliales (células BEAS2B) fueron adquiridos de Summit Pharmaceuticals International (Tokio, Japón). Las células se fotografiaron usando un microscopio de contraste de fases (Olympus, Tokio, Japón). circularidad celular se midió por el NIH Image software J.
se utilizó Transfección
reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) para siRNA transfección en células A549, y concentración final de ARNsi fue 20 nM. Smad4 humano siRNA (RNAi sigilo VHS41118) y ARNsi de control negativo se compraron de Invitrogen. Las células transfectadas se cultivaron durante 48 h y se sembraron a la misma densidad de células, seguido de incubación con TGF-β1 y /o TNF-α. Para evaluar el efecto de miR-23a, 10 nM de precursor sintético miR-23a (pre-miR-23a) o un control negativo marcado con Cy3 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se transfectó en células A549 usando el reactivo Lipofectamina RNAiMAX. La eficiencia de transfección se juzga por fluorescencia Cy3 fue de más de 95% como se confirma por citometría de flujo. Para el análisis de microarrays, se recogió muestra de ARN de 48 h después de la transfección.
análisis de inmunotransferencia
Las células se pusieron en hielo y se enjuagaron con PBS, después se lisaron en tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,5% Nonidet P-40) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa para inmunotransferencia. Después de centrifugar a 15.000 rpm durante 15 min, los lisados celulares se cuantificaron para el contenido de proteína por BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) y cantidades iguales de proteínas totales fueron procesadas para SDS-PAGE, seguido de la transferencia semiseca de las proteínas a membrana de nitrocelulosa. La unión no específica de proteínas a la membrana se bloqueó por incubación con Amersham ECL Primer Agente bloqueador (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) en tampón TBS-T (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,05% Tween- 20). Las proteínas inmunotransferencia se detectaron con el sistema ECL secante y sistema de imagen /Ez-Captura LightCapture (ATTO, Tokio, Japón).
Aislamiento de RNA y RT-PCR
El ARN total fue aislado utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La síntesis de ADNc se realizó utilizando el Sistema de superíndice III primer capítulo de síntesis (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Quantitative análisis RT-PCR se realizó con Mx-3000P (Stratagene, La Jolla, CA) y QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). El nivel de expresión se normalizó a la de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
). Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla S1. MicroARN fue aislado utilizando el Kit miRNeasy Mini (Qiagen). Madura miR-23a se transcripción inversa y la PCR cuantitativa se realizó mediante ensayos TaqMan microARN (Applied Biosystems). El nivel de expresión se normalizó a la de U6.
Gelatina Zymography
El medio condicionado sin FBS se recogieron y cantidades iguales de proteína se mezclaron con 4 x tampón de muestra no reductor SDS-PAGE. Las muestras se aplicaron a un 10% (w /v) en gel de poliacrilamida impregnada con 1 mg /ml de gelatina (Sigma-Aldrich). Después de la electroforesis, SDS se retiró del gel por lavado 3 veces durante 20 min en una solución de 2,5% de Triton X-100. A continuación, los geles se incubaron durante la noche con agitación suave a 37 ° C en tampón (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, mM CaCl 5
2, NaCl 200 mM, 0,02% Brij35). El gel se tiñó con azul de Coomassie R250 en 50% de ácido acético 0,5% de metanol y 5% de 2 h a temperatura ambiente, y posteriormente se destiñó con solución de ácido acético metanol-10% 40% hasta que las bandas se hicieron evidentes.
invasión ensayo
ensayo de invasión de las células se realizó mediante cultivo celular con inserciones de 8 micras de tamaño de poro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). La superficie superior de la cámara se recubrió con el factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences). células A549 (4 × 10
5 células /pocillo) se resuspendieron en medio libre de suero fueron sembradas en el lado superior de la cámara. En el lado inferior de la cámara, el medio de crecimiento suplementado con se añadió 10% de FBS. TGF-β1 y /o TNF-α se añadieron en ambos lados de la cámara. Después de 24 h, se tripsinizaron las células en la superficie inferior de la cámara, se resuspendieron en PBS y se contaron con un hemocitómetro. Los experimentos se realizaron con triplicado, y se repitieron 3 veces. Los datos se presentan como la media de la relación de comparación con el control, a partir de 3 experimentos independientes.
perfiles de expresión
perfiles de expresión de genes se realizó utilizando un gen GeneChip® Human 1,0 ST Array (Affymetrix , Santa Clara, CA). El procesamiento de microarrays se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de los genes se controló 19,734, y los datos se ha importado al software de GeneSpring GX (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para la selección de genes inducidos y reprimidos.
La expresión de microRNAs maduros 1223 se perfila usando matriz miRCURY LNA de Exiqon, 6ª generación (Filgen, Nagoya, Japón). Brevemente, las muestras de ARN se comprobó la integridad del ARN en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Wilmington, DE), etiquetados con HY3, y se hibridaron. Las láminas fueron escaneados utilizando GenePix®4000B (Molecular Devices, Union City, CA), y las imágenes se digitalizaron con matriz-Pro Analizador Ver. 4.5 (Media Cibernética, Silver Spring, MD). Por último, los datos se normalizaron y se expresaron como aumento veces con la herramienta de análisis de datos de microarrays Ver. 3.2 (Filgen).
Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA) fue utilizado para el mapeo de datos de expresión de genes en las vías pertinentes en base a la anotación funcional de los genes y las interacciones moleculares conocidos. Para el análisis integrado de miARN y firmas de ARNm, se empleó el filtro miRNA Target en IPA, que extrae las posibles interacciones miARN-mRNA en función de las bases de datos como TarBase, miRecords y TargetScan.
luciferasa reportero de ensayo
vector de expresión Pri-miR23a se generó por clonación del fragmento corto de pri-miARN que contiene pre-miARN y la secuencia de acompañamiento en pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR (Invitrogen). Para el constructo indicador, el segmento 3'UTR del gen HMGN2 humano se clonó en el vector indicador de luciferasa. Las secuencias de los cebadores utilizados se dan en la Tabla S2. células HEK293T fueron transfectadas con cada constructo indicador con o sin vector de expresión pri-miR23a utilizando FuGENE6 (Roche, Basilea, Suiza). La relación de Renilla a luciferasa de luciérnaga se midió usando el Dual-Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega, Madison, WI).
Resultados
Mejora de TNF-α TGF-β mediada EMT en el A549 las células del cáncer de pulmón
en primer lugar se caracterizó el efecto de TGF-β y /o TNF-α en la EMT en las células de cáncer de pulmón A549. En la confluencia, las células A549 muestran las apariencias de adoquines similares y el tratamiento de TGF-β llevaron a la celda cambio morfológico de forma alargada. TNF-α también fue potente en la inducción de células cambio morfológico a las apariencias de huso como. Como se informó anteriormente, la coestimulación de TGF-β y TNF-α resultó en un cambio dramático de la forma celular de tipo fibroblasto apariencias [14], que era claramente distinguible de los observados en las células tratadas con TGF-β o TNF-α por sí sola ( la Figura 1A, paneles superiores).
(células A549) a se trataron previamente con LY-364947 (TβR-I inhibidor) o el control de DMSO durante 60 min, se cultivaron adicionalmente con 5 ng /ml de TGF-β1 y /o 10 ng de TNF-α /ml durante 48 h, y se analizaron por microscopía de contraste de fase. Bar: 50 micras. circularidad (B) celular se midió utilizando el software Image J para cuantificar el cambio morfológico de células después del tratamiento descrito. análisis (C) inmunotransferencia de E-cadherina y N-cadherina en células A549 estimuladas con TGF-β1 y /o TNF-α durante 48 h en presencia o ausencia de LY-364947. a-tubulina se utilizó como control de carga. (D) zimografía de gelatina. A549 células tratadas como se describe se cultivaron con medio libre de suero durante 48 h adicionales. Se recogieron los medios acondicionados y se sometieron a electroforesis la misma cantidad de proteínas. la digestión de gelatina por activa MMP-2 y MMP-9 se visualizó mediante tinción con azul de Coomassie. (E) ensayo de invasión de la célula. Las células que migraron a través de los insertos de cultivo recubiertas con Matrigel se trataron con tripsina y se contaron. Cada experimento se realizó por triplicado y se presentaron las proporciones relativas promediados a partir de 3 experimentos independientes. Las barras de error: SD. *
P
. & Lt; 0,05 (prueba t de Student)
A continuación se examinó el efecto de la TβR I-quinasa inhibidor, LY-364947. El bloqueo de la señalización de TGF-β endógeno por LY-364947 dio lugar a la morfología celular uniformemente cuboidal, y el efecto de TGF-β exógeno estaba claramente abrogada en presencia de LY-364947. Por otra parte, se observó aún celular mediada por TNF-α cambio morfológico, aunque en menor medida, en las células pretratadas con LY-364947, indicativo de los efectos de TNF-α solo ejercida en ausencia de endógeno TGF-β de señalización (Figura 1A, paneles inferiores)
.
Estos cambios morfológicos se cuantificaron mediante la medición de la circularidad celular (Figura 1B). En las células costimulated con TGF-β y TNF-α, la circularidad de células se reduce notablemente, lo que sugiere el efecto sinérgico sobre la morfología celular. En presencia de LY-364947, sus efectos eran en su mayoría inhibido, lo que implica la contribución fundamental de TGF-β al efecto sinérgico observado.
El proceso de la EMT se acompaña de regulación a la baja de E-cadherina y la regulación positiva de N -cadherin, que se denomina como interruptor de cadherina [1], [2]. En los siguientes experimentos, se analizó la expresión de E-cadherina y N-cadherina, como marcadores epiteliales y mesenquimales, respectivamente. E-cadherina expresión fue abrogada en su mayoría por el tratamiento de TGF-β, mientras que solo el TNF-α muestran un efecto marginal sobre la regulación a la baja de E-cadherina en el nivel de proteínas (Figura 1C). De acuerdo con el cambio en la expresión de E-cadherina, N-cadherina se upregulated por el tratamiento con TGF-β o TNF-α. Además, de acuerdo con el cambio dramático en la morfología celular, TNF-α aumentó el efecto de TGF-β en marcadores epiteliales /mesenquimatosas. El efecto de TGF-β en la expresión de E-cadherina /N-cadherina fue inhibida por LY-364947, mientras que también se observó la regulación al alza mediada por TNF-α de N-cadherina independientemente del tratamiento LY-364947.
EMT se acompaña con el aumento de las actividades de la proteasa que facilitan la degradación de la membrana basal y matrices extracelulares (ECM) células tumorales circundantes, que es crítica para la invasión tumoral /metástasis. Para analizar las actividades proteolíticas de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) en las células tratadas con TGF-β y /o TNF-α, se realizó zimografía de gelatina (Figura 1D). TGF-β potenció la actividad de MMP-2, mientras que TNF-α mejorada que de MMP-9. En particular, la coestimulación con TGF-β y TNF-α promovido drásticamente las actividades tanto de MMP-2 y MMP-9, lo que sugiere el efecto sinérgico para mejorar las actividades de MMP. En presencia de LY-364947, el efecto de TGF-β estaba claramente inhibida, mientras que el efecto de TNF-α para mejorar la actividad de MMP-9 se observó aún aunque en menor medida, en ausencia de señalización de TGF-β endógeno.
Para examinar el aspecto funcional de la EMT, se realizó un ensayo de invasión, que utiliza cámaras recubiertas con Matrigel, imitando la membrana basal. TGF-β o tratamiento TNF-α como resultado modestamente aumento del número de células invasoras en la cara inferior de las cámaras, mientras que la coestimulación con TGF-β y TNF-α llevó a capacidad invasiva mejorado, de acuerdo con los cambios antes observado (Figura 1E). el tratamiento de TGF-β no invasiva para mejorar la capacidad tan robusto como los cambios en los marcadores de EMT, lo que sugiere que los cambios en los marcadores no están directamente vinculados a los teléfonos invasividad. El proceso de invasión incluye la motilidad celular mejorada y actividades proteolíticas. Junto con los resultados de zimografía de gelatina, aumento de la capacidad invasiva en las células costimulated con TGF-β y TNF-α parece estar relacionado con las actividades de MMP mejoradas.
En conjunto, EMT mediada por TGF-β estaba claramente mejorada por TNF-α como se juzga por la morfología celular, marcadores de EMT, la lisis de gelatina y la invasión celular. TNF-α por sí sola también podría inducir parte de estos cambios, incluso en presencia de LY-364947, tales como la regulación positiva N-cadherina y la activación de MMP-9. Estas observaciones nos llevó a explorar las posibles crosstalks entre el TGF-β y TNF-α, y los eventos moleculares que regulan la EMT en células A549.
EMT mediada por TGF-β es Smad dependiente
Smads son la principal transductor de la señalización de TGF-β; Smad2 y Smad3 son fosforilados por formar complejos con Smad4 TβR-I, y. Estos complejos se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana [20]. Además de la transcripción mediada por Smad, el TGF-β activa otras cascadas de señalización, incluyendo MAPK (mitogen-activated proteína quinasa) vías [21].
Para examinar si la señalización mediada por Smad está implicado en la regulación de la EMT en el A549 células, que derribaron endógena Smad4, que comúnmente se requiere para la regulación transcripcional mediada por Smad. Transfección de ARNsi silenció Smad4 expresión (Figura 2A, izquierda), y suprimió aún más la expresión de genes regulados objetivo-Smad de TGF-β, como Smad7 y PAI-1 (activador de plasminógeno inhibidor-1, también conocida como
SERPINE1
) (Figura 2B). En esta configuración, el TGF-β no regular a la baja la E-cadherina, a juzgar por RT-PCR cuantitativa (Figura 2A, derecha), lo que sugiere que el TGF-β EMT mediada está regulada principalmente por la vía Smad. Estos efectos fueron confirmados por inmunotransferencia. TGF-β no regular a la baja la E-cadherina o regular positivamente la N-cadherina eficientemente como las células transfectadas siRNA de control cuando endógena Smad4 fue silenciado (Figura 2C).
(A-B) células A549 fueron transfectadas con siRNAs para Smad4 ( si Smad4), o siRNAs control negativo (NTC) si y se cultivaron durante 48 h. Las células se cultivaron adicionalmente con 5 ng /ml de TGF-β1 y /o 10 ng /ml de TNF-α por 2 h (B) o 24 h (A), y se recogió el ARN. PCR cuantitativa se realizó para Smad4, E-cadherina, Smad7 y PAI-1 en el momento indicado. La expresión se normalizó a la de GAPDH. Las barras de error: SD. (C) Los lisados celulares se recogieron 48 h después de TGF-β1 y /o tratamiento de TNF-α. Immunoblotting se realizó para E-cadherina, N-cadherina y Smad4. α-tubulina se utilizó como control de carga.
TNF-α fosforila Smad2 Enlazador Región
R-Smad y Smad4 contienen dominios conservados MH2 N-terminales MH1 y C-terminal, flanqueando el segmento enlazador. la interacción ligando-inducida de R-Smads activado con resultados TβR-I en la fosforilación directa de C-terminal motivo SSXS [20], que es el evento clave de la activación de Smad. Por otra parte, otras vías de quinasas regulan más Smad señalización a través de la fosforilación de la región de unión de R-Smads [21], [22]. Además de la señalización de NFkB, TNF-α se conoce para provocar vías de MAPK, que se componía de tres subfamilias, es decir, señal extracelular regulada quinasa (ERK) 1 y 2, MAPK p38 y la quinasa c-Jun N-terminal (JNK).
Para explorar el potencial de la modulación de la señalización Smad por el TNF-α, se determinó la fosforilación de las regiones C-terminales de engarce o de R-Smads. TGF-β suscitó fuertemente la fosforilación de Smad2 y Smad3 regiones C-terminales mientras que TNF-α no mostraron ningún efecto. Por otro lado, la estimulación de TNF-α llevó a la fosforilación de la región linker de Smad2, independientemente de la estimulación de TGF-β (Figura 3A).
células A549 (A) fueron estimuladas con TGF-β1 y /o TNF-α por 60 min y la inmunotransferencia se realizó para el total de Smad2, fosforilados Smad2 (región de engarce: Ser 245/250/255), fosforilados Smad2 (C-terminal región: Ser 465/467), el total de Smad3, fosforilados Smad3 (C- terminal de la región: Ser 423/425). (B) células A549 se pretrataron con DMSO o inhibidores químicos (LY-364947, U0126, SP600125 y SB203580) durante 60 min, seguido por la estimulación de TNF-α. Los lisados de células se recogieron en los puntos de tiempo indicados, y la inmunotransferencia se realizó para Smad2, fosforilados Smad2 (región de engarce: Ser 245/250/255), Erk, fosforilada Erk, p38, p38 fosforilada y fosforilada c-jun. α-tubulina se utilizó como control de carga.
A continuación trató de dilucidar aún más, que la quinasa está implicada en la fosforilación mediada-TNF-α de la región conectora Smad2, el uso de inhibidores químicos tales como LY-364947, U0126 , SP600125 y SB203580 (Figura 3B). estimulación TNF-α llevó a la fosforilación de Erk, p38 y c-Jun, un sustrato de JNK. estimulación TNF-α también provocó la fosforilación del enlazador de Smad2 en 30 a 120 min, alcanzando un pico a 60 min. LY-364947 no logró abolir este efecto, que muestra el efecto de TNF-α independiente de TβR-I quinasa actividad. De los inhibidores de la prueba, mediada por TNF-α fosforilación de Smad2 enlazador ha sido abrogada por U0126, un inhibidor de MEK, que también podría abolir la fosforilación de Erk, un sustrato aguas abajo de MEK. El inhibidor de JNK, SP600125 suprimió la fosforilación de c-Jun, un sustrato aguas abajo de JNK, y inhibió parcialmente la fosforilación de Smad2 enlazador. El inhibidor p38 MAPK, SB203580 no afectó la fosforilación Smad2 enlazador a la concentración demostrado ser eficaces en los informes anteriores.
Estos resultados sugieren que el TNF-α induce la fosforilación de Smad2 región de engarce, que puede modular de genes regulados-Smad la transcripción [22]. Este efecto parece estar mediado en gran parte por vía MEK-ERK y JNK, probablemente, también podría desempeñar un papel, aunque en menor medida (Figura 3B).
Análisis de microarrays Muestra Diferencial regulación de genes de TGF-β y TNF α
Para obtener conocimientos integrales sobre los cambios que se producen en la transcripción de TGF-β y /o tratamiento con TNF-α, se llevó a cabo perfiles de expresión génica. muestras de ARN total se prepararon a partir de células A549 tratadas con TGF-β y /o TNF-α durante 2 h o 24 h, y se analizaron adicionalmente mediante análisis de microarrays (Figura 4A). Las transcripciones inducidos & gt; 1,5 veces o reprimidos. & Lt; 0,67 veces, incluidos los que no anotado, se enumeran en el archivo S1 y File S2 (los datos en 2 h y 24 h, respectivamente)
(A ) la representación gráfica de dispersión de los transcritos en las muestras tratadas con TGF-β1 y /o TNF-α durante 2 h o 24 h (eje y), en comparación con los de control de no estimulada (eje X). Las transcripciones se trazan a partir de datos normalizados log2. El umbral de los niveles de transcripción se estableció como inducida & gt; 2,0 veces o reprimida & lt; 0,5 veces, y se indica en cada diagrama de dispersión. diagrama (B) de Venn que ilustra la superposición entre genes upregulated (Arriba) o downregulated (hacia abajo) por el TGF-β1 y /o tratamiento de TNF-α por 2 h o 24 h. El umbral de los niveles de transcripción se estableció como inducida & gt; 2,0 veces o reprimida & lt; 0,5 veces. Las cifras indican el número de genes anotados. representación parcela (C) de la dispersión de miRNAs maduros en las muestras tratadas con TGF-β1 y /o TNF-α por 24 h (eje X), en comparación con los de control de no estimulada (eje Y). El umbral de los niveles de miARN se estableció como inducida & gt; 2,0 veces o reprimida & lt; 0,5 veces, y se indica en cada diagrama de dispersión. (D) RT-PCR cuantitativa para pieles maduras miR-23a. A549, las células H441 y BEAS2B se trataron con TGF-β1 durante 24 h. Expresión se normalizó a la de U6. . Las barras de error: SD
Para el análisis posterior, que establece el umbral de los niveles de transcripción como inducida & gt; 2,0 veces o reprimida & lt; 0,5 veces, y excluidos transcripciones anotadas. Por lo tanto hemos identificado los genes con expresión alterada en comparación con el control no estimulado, en 3 series comparativas, es decir, estimulada por TGF-β, TNF-α-estimulado y grupos TGF-β /TNF-alfa estimulada (Figura 4B).
Como una tendencia general, el TGF-β-regulados y genes de TNF-a-regulada eran en gran parte exclusiva, mostrando la regulación diferencial de la transcripción génica. Además, los genes regulados positivamente fueron identificados mucho más que los downregulated. Los genes inducidos por TNF-α fueron más prominentes de TGF-β en 2 h, mientras que el número de genes regulados positivamente por el TGF-β era mucho mayor a las 24 h en comparación con los de 2 h, o los de TNF-α. A las 24 h, hubo una fracción de los genes que estaban arriba o downregulated por el TGF-β y TNF-α coestimulación, pero no a ninguno de ellos.
A continuación se emplearon los conjuntos de datos publicados de microarrays, que eran realizado en células A549 estimuladas con TGF-β [23], [24]. Teniendo en cuenta la inducción & gt;. 2,0 veces tan significativa, se extrajeron los posibles genes diana TGF-β inducida comúnmente en tres estudios independientes, es decir, 17 genes en 2 h, y 129 genes a las 24 h, que se muestran en S3 File
subconjuntos de genes diferencialmente o Cooperativamente regulados por TGF-β y TNF-α
Hay varios factores de transcripción han estado implicados en la represión transcripcional de la e-cadherina, incluyendo
Snai1 gratis (Caracol),
SNAI2 gratis (Slug),
ZEB1
,
ZEB2
y
TWIST1
[25], [26]. De éstos,
Snai1
fue inducida rápidamente por el TGF-β a las 2 horas, mientras que el TNF-α y no lo suprimió, lo que implica los mecanismos diferenciales para regular la EMT. A las 24 h, E-cadherina (
CDH1
) fue claramente downregulated de TGF-β (0,27 veces), mientras que el efecto supresor de TNF-α fue modesto (0,78 veces). De conformidad, el TGF-β y TNF-α upregulated la expresión de N-cadherina (
CDH2
) hasta 2,32 veces y 1,47 veces, respectivamente. El efecto sinérgico de TGF-β y TNF-α también se observó con respecto a la regulación transcripcional de
CDH1
y
CDH2
, en consonancia con los resultados de la Figura 1.
Además, los genes regulados por incremento más de 3,0 veces a 2 h o 24 h, se subclasifican y se enumeran en la Tabla 1 y 2, de acuerdo con las funciones conocidas. Como una respuesta aguda a las 2 h, el TNF-α inducida potentemente una serie de citocinas /quimiocinas como
CCL2 gratis (MCP-1),
CCL5 gratis (RANTES),
CCL20
,
CXCL1
,
CXCL8 gratis (IL-8),
IL1A
,
IL1B
y
IL6
. Señalización componentes de la vía de TNF-α-NFkB también se upregulated incluyendo
TNF
,
TRAF1
,
NFKB1
,
NFKBIA
y
NFKBIE
. Además, las moléculas de adhesión celular como
VCAM1
y
ICAM1
fueron inducidos. A las 2 h después de la estimulación, el TGF-β induce número limitado de genes incluyendo los blancos directos conocidos como
SMAD7
y
HEY1
. En 24 h, la estimulación de TGF-β condujo a una mayor expresión de diversos genes clasificados como (i) regulador de la pequeña GTPasa, (ii) la molécula de adhesión celular, y (iii) ECM, mientras que la estimulación de TNF-α sólo mostró efectos menores sobre ellos.
Reguladores de pequeña GTPasa incluyen factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) como
RASGRP1
,
RASGRP3
,
RASGRF2
,
DOCK2
y
DOCK4
, que activan Ras, Rac y Rap1, así como los miembros de la familia Rho GTPasas como
RND1
y
RHOU
. la motilidad celular y los cambios morfológicos son regulados por GTPasas pequeñas, como las familias Ras, Rac, Cdc42 y Rho, que pueden ser modulados aguas abajo de TGF-β de señalización [27].