Extracto
El cáncer de páncreas es considerada una enfermedad letal y resistente al tratamiento. Para obtener un potente fármaco contra el cáncer, el efecto citotóxico de 2- (benzo [d] oxazol-3 (2H) -ilmetil) - 5 - ((ciclohexilamino) metil) benceno-1,4-diol, diclorhidrato de (NSC48693) en humanos células del cáncer pancreático CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3 se evaluó
en
in vitro
. La proliferación de CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3 se inhibe con IC
50 valor de 12,9 ± 0,2, 20,6 ± 0,3, y 6,2 ± 0,6 M a las 48 h, respectivamente. Este descubrimiento es seguido con un análisis adicional para demostrar que la inhibición NSC48693 es debido a la inducción de la apoptosis, incluyendo la tinción con anexina V, cromatinas tinción, y los ensayos de formación de colonias. Se revela, además, que NSC48693 induce la liberación de citocromo
c
, reduce el potencial de membrana mitocondrial, genera especies reactivas del oxígeno, y activa la caspasa. Estos resultados indican que colectivamente NSC48693 induce principalmente apoptosis de CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3 células por la vía apoptótica mitocondrial mediada. Emocionantemente, el estudio pone de manifiesto un alentador efecto de inhibición que las células de riñón embrionario humano (HEK-293) y el hígado (HL-7702) son más resistentes al efecto de anticrecimiento NSC48693 en comparación con las tres líneas celulares de cáncer. Desde esta perspectiva, NSC48693 debería ayudar a abrir una nueva oportunidad para el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas
Visto:. Liu Z, D Li, Zhao W, X Zheng, Wang J, Wang E (2012) Un potente plomo induce la apoptosis en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (6): e37841. doi: 10.1371 /journal.pone.0037841
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2011; Aceptado: 28 de abril de 2012; Publicado: 20 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China con las subvenciones de No.90713022 y 20735003. Fundación Nacional de Ciencia J. Wang y gracias Institutos nacionales de Salud de los apoyos financieros. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es considerado un cáncer agresivo, ya que por lo general no se detecta hasta que llegue a la etapa tardía [1]. En 2010, el cáncer de páncreas fue el 4
ª causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [2]. El tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas depende principalmente de la cirugía, terapia de radiación, quimioterapia o métodos terapéuticos combinados. Es bien conocido que el cáncer de páncreas a menudo tiene un mal pronóstico ya que el 80-85% de los pacientes se presentan en una fase localmente avanzado o metastásico, que excluyen la cirugía, debido a su alta tendencia a la invasión local y metástasis a distancia. La quimioterapia puede ser utilizado para mejorar la calidad de vida y obtener un beneficio de supervivencia modesta de cáncer de páncreas. Gemcitabina como agente único aprobado por la FDA en 1998, representa actualmente el fármaco quimioterapéutico más eficaz que mejora la calidad de vida y prolonga el tiempo de vida de los pacientes con cáncer de páncreas avanzado durante 5 semanas. Debido a la aparición de la quimio-resistencia a la la gemcitabina [3], que contiene combinaciones de gemcitabina, como gemcitabina-erlotinib, -placebo y -oxaliplatin, se inventaron y exhiben efectos sinérgicos y la reducción de la resistencia [4]. Es lamentable que poco convincentes resultados se encuentran en las mejoras clínicamente relevantes en la calidad de vida y la supervivencia. Para abordar esta cuestión, parece que hay una necesidad urgente para el desarrollo de nuevos medicamentos contra el cáncer.
La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de cáncer de páncreas ha proporcionado muchas esperanzas para el descubrimiento de nuevos agentes quimioterapéuticos en la terapia de cáncer de páncreas [5]. La inhibición de la apoptosis juega un papel vital en el proceso de deterioro de cáncer de páncreas como los otros tumores [6]. La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso fisiológico altamente controlada y una vía de señalización núcleo [7]. Por lo tanto, medicamentos contra el cáncer como inductor de apoptosis se ha propuesto y ampliamente aceptado en la terapia de cánceres [8]. Algunos trabajos han revelado que la terapia de apoptosis-mediación es un horizonte prometedor para la terapia en cánceres con poca toxicidad para las células normales circundantes debido a su vía de supervivencia fisiológicamente controlada [9], [10]. El inductor de apoptosis, por tanto, sigue representando una dirección importante para el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas
.
En el presente estudio, un potente plomo denominado como 2- (benzo [d] oxazol -3 (2H) - ilmetil) - 5 -. ((ciclohexilamino) metil) benceno-1,4-diol, diclorhidrato de (NSC48693, Fig 1) inhibe la proliferación de células de cáncer pancreático CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC -3 mediante la inducción de la apoptosis en la vía mitocondrial mediada por
en
in vitro
. Emocionantemente, el efecto citotóxico de NSC48693 en las células cancerosas es más pronunciado de lo normal y las células del hígado de riñón embrionario humano (HEK-293) (HL-7702). Estos resultados apoyan el papel de NSC48693 como inductor de apoptosis potente de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Materiales
Todos los productos químicos incluidos Ac-DEVD-FMK ( caspasa-3 inhibidor) y Ac-LEHD-FMK (inhibidor de caspasa-9) se adquirieron de Sigma (St Louis, MO), a menos que se indique lo contrario. DMEM, IMDM y suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Gibico (Isla Grand, NY). Los anticuerpos primarios contra la caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, Bcl-2, Bax, citocromo
c
y conjugado con peroxidasa anti-ratón de cabra o antirabbit anticuerpo secundario, así como IgG1 isotipo de ratón, anti- cabra IgG1 de ratón FITC se adquirieron de BD Bioscience (San Jose, CA). NSC48693 fue suministrado amablemente del NCI /DTP abierto Química de la UAB (http://dtp.cancer.gov). NSC48693 se disolvió en DMSO para obtener la solución madre (10 mg /ml) y se diluyó a diversas concentraciones con agua doblemente destilada que contiene 10% de DMSO.
Antecedentes de NSC48693
Los amplios estudios sobre el cáncer de páncreas han identificado que la señalización de Ras está implicado en la regulación de la apoptosis. El desarrollo de fármacos dirigidos a Ras y la inducción de apoptosis se mantiene con intensidad en el descubrimiento de fármacos. La unida a GTP Ras activa está en equilibrio con tres estados distintos, uno de los cuales es la conformación de no señalización abierto que es un intermedio transitorio durante la hidrólisis de GTP [11]. Esto implica que el Ras intermedio es un punto de convergencia para la señalización en el cáncer de páncreas supervivencia. En la actualidad, por lo tanto, la conformación abierta parece ser el objetivo más prometedor para el diseño de fármacos. La estructura de destino a GppNHp RasG60A-GTP (PDB ID: 1XCM [11]) se usó en los cálculos de acoplamiento. Todos los cálculos de acoplamiento se realizaron utilizando el paquete Autodock [12]. Se utilizó la base de datos del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) para el conjunto de la diversidad cribado virtual. Luego clasificamos estas pequeñas moléculas de acuerdo con la afinidad predicha y especificidad definida [13]. 2- (benzo [d] oxazol-3 (2H) -ilmetil) -5 - ((ciclohexil- amino) metil) benceno-1,4-diol, diclorhidrato de (NSC48693) se llevó a cabo a partir de la base de datos NCI demostró efecto de inhibición del crecimiento en líneas celulares de leucemia CCRF-CEM y MOLT-4 como se muestra en la pantalla del cáncer del NCI datos actuales (http://dtp.nci.nih.gov). Pequeños esfuerzos se centran en el efecto de NSC48693 sobre el cáncer de páncreas, por lo que ofrece una opción seleccionada de inductor de la apoptosis de alta calidad.
Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer de páncreas humanos CFPAC-1, MiaPaCa -2, y BxPC-3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en DMEM y medio IMDM suplementado con 10% de FBS y antibióticos (100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina), respectivamente. se obtuvieron del riñón embrionario humano 293 (HEK-293) e hígado (células HL-7702) de la Academia de Ciencias de China Type Culture Collection (Shanghai, China) y se incubaron en medio DMEM suplementado con 10% de SFB. Las células se separaron de la monocapa utilizando tripsina al 0,25% y EDTA 0,53 mM durante 5 min a 37 ° C cuando las células se cultivaron hasta cerca de la confluencia.
Hoechst 33342 tinción
Los tres pancreática humana las células de cáncer (1 × 10
5 células /placa) fueron sembradas respectivamente en 6 pocillos de placa con fondo de vidrio y dejó que se unieran durante la noche. Las células cultivadas en 135 l de medio DMEM que fueron tratados mediante el uso de cualquiera de 15 l 250 mg /ml NSC48693 (concentración final 25,0 mg /ml) como grupos experimentales o 15 l de agua doblemente destilada que contiene 10% de DMSO como grupos de control, y después se cultivaron durante 48 h a 37 ° C y 5% de CO
2 condiciones. A continuación, las células se fijaron en MeOH-HOAc (03:01, v /v) durante 10 min a 4 ° C y luego teñidas utilizando Hoechst 33342 kit (keygen Biotech, Nanjing, China). Las células teñidas se analizaron por confocal de barrido láser microscopio (TCS SP2, Heidelberg, Alemania).
Ensayos de citotoxicidad
La viabilidad celular de las tres células de cáncer de páncreas y dos células normales humanos (1 x 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos) después de ser tratado por el agua doblemente destilada que contiene 10% de DMSO como grupos de control o varias concentraciones de NSC48693 como grupos experimentales fue evaluada por tiazolilo ensayo de azul de tetrazolio bromuro (MTT). Las células fueron tratadas durante 48 horas y luego se la densidad óptica (DO) a 490 nm se leyó con un lector automático de 96 pocillos MultiScanner (Biotech Instruments, Nueva York). MTT no interfiere con NSC48693 y causa una respuesta positiva.
Soft Agar Ensayos
se realizaron ensayos de agar blando esencialmente como se describe anteriormente [14]. Las suspensiones de células individuales de células de cáncer pancreático que contienen 1 × 10
4 células en 0,3% de agar se colocaron en placas de 3,5 cm en la parte superior de una capa gelificada, de 1% de agar en un medio (DMEM o IMDM con 10% de FBS) y se cultivaron con agua doblemente destilada que contiene 10% de DMSO como grupos de control o varias concentraciones de NSC48693 como grupos experimentales a 37 ° C. Las colonias se fijaron con glutaraldehído al 2,5% y se contaron anotar sólo las colonias que eran más grandes de 10 células de diámetro bajo Olympus X71 microscopio de fase invertida (Dr. Schumann Optik OHG, Hessen, Alemania). Porcentaje de la eficiencia de formación de colonias se calculó como el número de colonias /100 células sembradas.
Apoptosis ensayos
La apoptosis de las tres células de cáncer de páncreas (1 × 10
6 células /pocillo en placa de 24 pocillos) después de ser tratado por agua doblemente destilada que contenía 10% de DMSO como grupos de control o varias concentraciones de NSC48693 como grupos experimentales se midió por Anexina V-FITC /yoduro de propidio (PI) kit de detección de apoptosis (keygen Biotech, Nanjing, china ). La cuantificación de las señales de PI y FITC se realizó mediante fluorescencia clasificador de células activadas FACSAria (BD Bioscience, San José, CA) y el porcentaje de células teñidas en cada cuadrante se cuantificó usando el software de la diva 6,0 (BD Bioscience, San José, CA). En total, 10.000 eventos fueron analizados en cada muestra.
Ensayo de la actividad de caspasa
Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (5% de CO
2, 37 ° C) a una densidad de siembra de 2 × 10
6 células /pocillo. Las placas se preincubaron durante la noche antes de añadir las soluciones de fármaco a cada pocillo. Después de un período de exposición (24 o 48 h) con varias concentraciones NSC48693, células recolectadas por tripsinización con solución de tripsina /EDTA se lavaron por disolución de PBS y la actividad de la caspasa-3, caspasa-8, y la caspasa-9 se determinó por la caspasa kit de ensayo de actividad (keygen Biotech, Nanjing, china), respectivamente. DEVDasa, IETDase, y LEHDase actividad se midió mediante la medición de la escisión proteolítica de sustratos cromogénicos Ac-DEVD-pNA, Ac-IETD-pNA, y Ac-LEHDpNA, que se utilizaron como sustratos para la caspasa-3, caspasa-8, y la caspasa proteasas -9-como, respectivamente [15]. La absorbancia de liberado enzimáticamente-pNA se midió a 490 nm en un lector automático MultiScanner.
Después de 24 h la adherencia, las células (1 × 10
5 células /placa) fueron tratados con 25,0 mg /ml de NSC48693 durante 48 h. Luego, las células fueron examinadas mediante microscopía confocal de barrido láser.
Análisis de citocromo
c
estreno
Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos (5% de CO
2, 37 ° C) a densidad de siembra de 5 × 10
4 células /pocillo. Las placas se preincubaron durante la noche antes de añadir las soluciones de fármaco a cada pocillo. Después de un período de exposición (6 o 12 h) con varias concentraciones NSC48693, las células se cosecharon por tripsinización con solución de tripsina /EDTA y se lavaron con solución salina equilibrada de Hanks suplementada con 2% de albúmina de suero bovino y 0,2% de azida. Posteriormente, las células se fijaron y permeabilizaron usando kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience, San Jose, CA). La unión no específica de anticuerpos anti-citocromo
c
anticuerpo fue bloqueada con IgG1 de ratón. Anti-citocromo
c gratis (7H8.2C12) se añadió durante 30 minutos adicionales a 4 ° C. A continuación, las células se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG1 de ratón FITC (1:20) durante 30 min a 4 ° C. Después de lavar con solución de Perm /Wash, las células se analizaron inmediatamente por citometría de flujo (FCM). En total, 10.000 eventos por muestra fueron adquiridas y analizadas.
Medición del potencial de membrana Las mitocondrias (ΔΨm)
Los cambios en ΔΨm se midieron por Rodamina-123 (Rho-123) de tinte [16] . Las células se cultivaron en 24 pocillos de placas (5% CO2, 37 ° C) a una densidad de siembra de 5 × 10
4 células /pocillo. Las placas se preincubaron durante la noche antes de añadir las soluciones de fármaco a cada pocillo. Después de un período de exposición (48 h) con varias concentraciones NSC48693, células recolectadas por tripsinización con solución de tripsina /EDTA se lavaron por disolución de PBS y se incubaron con Rho-123 (10 mg /ml). A partir de entonces, la fluorescencia Rho-123 se midió por FCM. El porcentaje de células Rho-123- representa el efectivo se derrumbó ΔΨm; la reducción de la Rho-123 indica la pérdida de ΔΨm en las células [16]. En total, 10.000 eventos fueron analizados en cada muestra.
La detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) guía
detección de citometría de flujo de ROS se realizó como se describió anteriormente [17]. Brevemente, las células fueron cultivadas en placa de 24 pocillos (5% de CO
2, 37 ° C) a una densidad de siembra de 5 × 10
4 células /pocillo. Las placas se preincubaron durante la noche antes de añadir las soluciones de fármaco a cada pocillo. Después de un período de exposición (2 h) con varias concentraciones NSC48693, las células se cosecharon por tripsinización con solución de tripsina /EDTA y, posteriormente, la intensidad de fluorescencia ROS se determinó por FCM. los niveles de ROS se expresaron como porcentaje, que se calculó por software Diva 6.0. En total, 10.000 eventos fueron analizados en cada muestra.
Después de 24 h la adherencia, las células (1 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos o 1 × 10
4 células en 3,5 cm plato) se trataron con varias concentraciones de NSC48693 como se indica para 48 h. Entonces, la inhibición del crecimiento se evaluó por el método MTT (A) y los ensayos de crecimiento independiente de anclaje (B), respectivamente. Cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
Western Blot
Las células (2 × 10
6 células) fueron la semilla hasta 10 cm de placa y se cultivaron en incubadora durante la noche. A continuación, las células se expusieron con 1 ó 2 × IC
50 concentración de NSC48693 y el 10% de DMSO (control) durante 24 h. proteínas de células enteras y fracciones mitocondriales Se aislaron utilizando el kit de extracción de proteínas (keygen Biotech, Nanjing, China). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando BCA kit de ensayo de proteínas (keygen Biotech, Nanjing, China). Igual cantidad de proteínas se fraccionaron utilizando 12% SDS-PAGE y se transfirieron a continuación a la difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra la caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, el citocromo
c
, Bcl-2, Bax y, después de haber sido bloqueada con 3% de BSA en TBS. Las membranas se incubaron con conjugado con peroxidasa anti-ratón de cabra o de anticuerpo secundario anticonejo. Actina se utilizó para la carga de control. En el ensayo de inhibición de la caspasa-3 y caspasa-9, las células se trataron previamente por 20 M Ac-DEVD-fmk o Ac -LEHD-fmk durante 2 h después de la adhesión, y se cambió el medio por el cultivo que contiene 2 × IC
50 concentración de NSC48693 o 10% de DMSO.
Análisis estadístico
se expresaron todos los datos como medias ± SD de tres experimentos, y la reproducibilidad fue confirmada en al menos tres experimentos separados. El análisis estadístico se realizó mediante el SPSS 11,5 software estadístico.
Después de 24 h la adherencia, las células (1 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos) fueron tratados con diferentes concentraciones de NSC48693 como se indica para 48 h. Entonces, los ensayos de inhibición de crecimiento se evaluaron por el método MTT. Cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
La extensión de la apoptosis inducida en células cancerosas (1 × 10
6 células /pocillo en placas de 24 pocillos) tratados por 25,0 mg /mL de NSC48693 en MiaPaCa-2, 12,5 g /ml de NSC48693 en CFPAC-1, y 6,25 g /ml de NSC48693 en BxPC-3 de 24 o 48 h se midió mediante FCM, respectivamente. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran; y cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
Resultados
Cell NSC48693 Los cambios de morfología
La morfología celular se puede utilizar como un parámetro para medir el efecto de un compuesto de la toxicidad celular. Desde la condensación nuclear se produce en esta etapa de la apoptosis, la morfología apoptótica del núcleo será evidente en la tinción de [18]. La tinción nuclear con Hoechst 33342 muestra que las células en los grupos de control son proporcionales y bien distribuida (Fig. 2). En comparación con la morfología nuclear normal cambios morfológicos típicos, incluyendo colapso del citoesqueleto, la formación de cuerpos apoptóticos y la fragmentación nuclear, se observan en las células tratadas como se muestra con flechas en la Fig. 2. Estas características consistentemente se produjeron durante esta forma de muerte celular, que eran todos los caracteres comunes de muerte celular [19].
Las células (2 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos) fueron tratados con NSC48693 a las concentraciones indicadas para 24 (a, B, C) o 48 h (D, E, F), entonces examinado. Cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
Las células (5 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos) fueron tratados en las dosis indicadas para 6 (CFPAC- 1 y BxPC-3) o 12 h (MiaPaCa-2). citocromo intracelular
c
fue detectado por el anticuerpo 7H8.2C12 en células fijadas y permeabilzed. Los porcentajes representan la proporción de células con c
señal de citocromo rebajado
. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran; y cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
NSC48693 inhibe la proliferación celular
Además de un análisis comparativo detallado de los cambios morfológicos, se detectó la citotoxicidad de las células a NSC48693 a través de la pérdida de viabilidad celular utilizando el ensayo MTT [20]. Como se muestra en la Fig. 3A, la viabilidad de las células de cáncer se reduce significativamente por NSC48693 con la dosis de exposición incrementado. NSC48693 inhibe la proliferación de las células cancerosas con IC
50 valor de 12,9 ± 0,2 M durante CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 M durante MiaPaCa-2, y 6,2 ± 0,6 M durante BxPC-3 a las 48 h, respectivamente. Esto fue apoyado además por la capacidad de NSC48693 de bloquear el crecimiento independiente de anclaje de células cancerosas en agar blando. Cuando se compara con los grupos de control, las células cancerosas forman colonias más pequeñas y menos cuando se cultivan en presencia de NSC48693. Como se indica en la figura. 3B, esta respuesta se produce de una manera dependiente de la dosis. Combinado con los resultados, se concluye que NSC48693 disminuye la proliferación de células cancerosas en una forma dependiente de la dosis.
los efectos citotóxicos de NSC48693 en HEK-293 y HL-7702
Como se mostró en la figura . 4, la viabilidad de las células de HEK-293 y HL-7702 es 63,4 ± 4,1% y 91,2 ± 2,9% a una dosis de 25,0 mg /ml de NSC48693, respectivamente. NSC48693 inhibe HEK-293 y las células HL-7702 de proliferación con un CI
50 valor de 144,5 ± 8,8 M y 198,6 ± 11,3 M a las 48 h, respectivamente. Obviamente, los efectos citotóxicos de NSC48693 en células humanas normales son menos sensibles que las células de cáncer CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3 en comparación con la Fig. 3.
Las células (5 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos) fueron tratados en las dosis indicadas durante 48 h. A continuación, los experimentos fueron objeto de FCM. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran; y cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
NSC48693 induce la apoptosis
Para descartar la posibilidad de que la inhibición del crecimiento celular se debió a los efectos citotóxicos, se realizó ensayo de apoptosis . Las células positivas para anexina V-FITC y negativos para PI están en etapa temprana de la apoptosis, como se muestra en el cuadrante Q4, mientras que las células positivas para ambos Anexina V-FITC y PI están en la etapa tardía de la apoptosis o necrosis, como se muestra en el cuadrante Q2 [21 ]. Por lo tanto, el grado de apoptosis correlacionada con la cantidad de células V-FITC Anexina positivo. Y la integridad de la membrana intacta evaluado por tinción con PI negativo sugiere que la apoptosis pero no necrosis es el carácter de la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 5, hay poca unión de Anexina V-FITC a las células de control, mientras que la unión después del tratamiento con NSC48693 se aumenta como se muestra en el cuadrante Q4. En cuanto a MiaPaCa-2 células tratadas a una concentración de 25,0 mg /ml de NSC48693, la unión se aumenta de 73,1 ± 1,0% a 82,7 ± 2,8% a 24 h y 48 h. La unión se incrementó de 37.1 ± 2.0% a 50.5 ± 3.1% a las 24 y las 48 horas, después de las células CFPAC-1 son tratados por 12,5 mg /ml de NSC48693. Si bien se aumenta de 46,4 ± 2,4% a 55,0 ± 1,1% a las 24 h y 48 h, después de BxPC-3 células la unión son tratados por 6,25 g /ml de NSC48693. En combinación con estas observaciones, es evidente que el efecto de NSC48693 en las células cancerosas está mediada principalmente por la inducción de la muerte celular apoptótica.
activación de la caspasa
Como principales mediadores de la apoptosis, la activación de la caspasa depende de la escisión proteolítica de la procaspasa. Para mejorar nuestra comprensión de si la caspasa estuvo involucrado en la apoptosis inducida por NSC48693 en las células cancerosas, se examinaron las actividades enzimáticas de las caspasas con un ensayo spectrofluorometric utilizando sus correspondientes sustratos [22]. Como se muestra en la Fig. 6A, C, D, F, la actividad de la caspasa-3 y caspasa-9 se incrementa de una manera dosis-y dependiente del tiempo en comparación con las células no tratadas en tres células de cáncer; la actividad de la caspasa-8 vinculado a los receptores de muerte no ser aumentado en CFPAC-1 y BxPC-3 células (Fig. 6B, E). Sin embargo, la actividad de la caspasa-8 en MiaPaCa-2 células se incrementa de una manera dosis-y dependiente del tiempo en comparación con las células no tratadas. Estos resultados implican que NSC48693 activa la vía apoptótica intrínseca mitocondrias mediada conduce a la activación de caspasas para inducir la apoptosis en las células CFPAC-1 y BxPC-3. Para las células MiaPaCa-2, NSC48693 activa tanto la muerte del receptor vía mitocondrial de apoptosis y la membrana.
Las células (5 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos) fueron tratados en las dosis indicadas para 2 h. A continuación, los experimentos fueron objeto de FCM. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran; y cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
Igual cantidad de proteínas celulares se fraccionaron en geles al 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Actina se utilizó para controlar la carga.
La liberación de citocromo
c
La liberación de citocromo
c
es un paso crucial controlando el apoptosome camino. Clon 7H8.2C12 ha sido elegido especialmente para detectar citocromo intracelular
c
. Por lo tanto, la reducción de citocromo
c
señal detectada por el anticuerpo 7H8.2C12 refleja citocromo mitocondrial
c
liberación y de inicio temprano de la apoptosis [23]. Como se muestra en la Fig. 7, BxPC 3-células en los grupos de control tienen un bajo nivel de citocromo
c gratis (11,8 ± 1,7%), mientras que el tratamiento mejora la NSC48693 citocromo mitocondrial
c
liberación del 32,9 ± 1,3% a 36,9 ± 1,4% a las concentraciones de 25,0 y 50,0 mg /ml durante 6 h. CFPAC-1 células no tratadas por NSC48693 tienen citocromo mitocondrial normal de
c
nivel (7.9 ± 1.9%), mientras que el citocromo mitocondrial
c
niveles de liberación se incrementaron de 35,9 ± 1,2% a 47,6 ± 0,6 0,9% a las concentraciones de 25,0 y 50,0 mg /ml durante 6 h. Además, las células MiaPaCa-2 tratados por NSC48693 tienen un citocromo mitocondrial mejorada
c
liberación de 4,6 ± 1,8% en el grupo de control a 19,0 ± 1,3% y 29,3 ± 2,8% a la concentración de 25,0 y 50,0 g /ml durante 12 h, respectivamente.
Pérdida de ΔΨm
ΔΨm se pueden producir cuando los protones se bombean desde la matriz mitocondrial al espacio inter-mitocondrial [24]. Y la disipación de ΔΨm se ha relacionado con algunas vías de apoptosis, incluyendo vía mitocondrial de apoptosis [25]. Absolutamente la mayoría de las células no tratadas tienen membrana plasmática intacta y ΔΨm normal, sin embargo, la pérdida de ΔΨm exhibe un aumento dependiente de la dosis después de las células se trataron con NSC48693 a 12,5 y 25,0 mg /ml durante 48 h (Fig. 8). Después de MiaPaCa-2 células tratados con NSC48693, el porcentaje de colapso ΔΨm llega a 13,3 ± 1,9% y 24,7 ± 1,8%, respectivamente. Y el porcentaje de ΔΨm colapso de células CFPAC-1 llega a 18,9 ± 1,1% y 34,2 ± 2,9%, respectivamente. Mientras que el porcentaje de colapso ΔΨm en BxPC-3 células es evidente y llega a 24,9 ± 2,4% y 92,9 ± 8,9%, respectivamente. Los experimentos proporcionan una base suficientemente preciso para la conclusión de que las células cancerosas tratadas por NSC48693 pierden ΔΨm.
Igual cantidad de proteínas celulares se fraccionaron en geles al 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Actina se utilizó para controlar la carga.
Generación de ROS
La generación de ROS está directamente relacionada con la mitocondria [16]. Como se demuestra en la Fig. 9, el análisis de citometría de flujo revela que MiaPaCa-2 células no tratadas tienen un bajo nivel de ROS endógeno (18,0 ± 0,3%), mientras que el tratamiento NSC48693 mejora significativamente intracelular niveles de ROS de 58,0 ± 2,3% a 68,0 ± 4,4% en las concentraciones de 50,0 y 100,0 g /ml durante 2 h. CFPAC-1 células no tratadas por NSC48693 tienen nivel de ROS endógeno normal (2,5 ± 1,6%), mientras que los niveles de ROS se aumentaron de 74,0 ± 2,8% a 81,4 ± 0,5% a las concentraciones de 12,5 y 25,0 mg /ml durante 2 h. Además, los niveles de ROS se aumentó de 9,8 ± 1,3% a 16,4 ± 2,7% después de BxPC-3 células son tratadas por NSC48693 a las concentraciones de 25,0 y 50,0 mg /ml durante 2 h.
Efecto de NSC48693 en Las proteínas apoptosis-relacionados
El efecto de NSC48693 en las proteínas relacionadas con la apoptosis se confirmó por transferencia de Western como se muestra en la Fig. 10. NSC48693 tratamiento aumentó la escisión de la caspasa-9 y la caspasa-3 en una forma dependiente de la dosis. La expresión de escindido-caspasa-8 era casi indetectable en las células CFPAC-1 y BxPC-3. Sin embargo, la escisión de la caspasa-8 era evidente en las células MiaPaCa-2, que fue de acuerdo con la actividad de la caspasa como se muestra en la Fig. 6. Al mismo tiempo, la expresión de la proteína Bcl-2 se redujo reguladas y Bax fue hasta regulado. El citocromo
c Hoteles en citosol se mejoró concomitante con la atenuación relacionada de citocromo
c Hoteles en las mitocondrias. Además, los inhibidores específicos de la caspasa-9 y la caspasa-3 suprimieron casi completamente la escisión inducida por NSC48693 de la caspasa-9 y la caspasa-3, respectivamente (Fig. 11).
Discusión
a pesar de que los fármacos quimioterápicos no cubiertas aún no han logrado ningún progreso real en la terapia clínica hasta el momento, la quimioterapia sigue siendo la columna vertebral en el tratamiento del cáncer de páncreas avanzado en la actualidad [25]. De este modo, los nuevos fármacos quimioterapéuticos con diferentes modos de acción son siempre en la necesidad para el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas. El mecanismo de la muerte celular inducida por fármacos quimioterápicos se cree que es un mecanismo apoptótico endógeno. Así, la inducción de la apoptosis en células de cáncer ha sido reconocida como una innovadora estrategia de descubrimiento de fármacos para la terapia del cáncer [26] - [28]
inductores de apoptosis potenciales deben eliminar las células cancerosas en vez de causar una toxicidad excesiva a los normales.. En el presente estudio, se centró en evaluar el efecto de NSC48693 sobre la muerte mediante la inducción de la apoptosis de las células del cáncer de páncreas humanos CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3
In
in vitro
. Parece que las células cancerosas y normales reaccionan de manera diferente a la exposición NSC48693 en ensayos de MTT. Los resultados de la viabilidad celular indican que la viabilidad de las células del cáncer es inhibida significativamente por NSC48693 con IC50 de 12,9 ± 0,2 M durante CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 M durante MiaPaCa-2, y 6,2 ± 0,6 M durante BxPC-3, respectivamente. Sin embargo, la sensibilidad de las células normales a NSC48693 es considerablemente diferente. Por el contrario, no se detecta ninguna citotoxicidad obvia en las células normales con IC
50 144,5 ± 8,8 M durante HEK-293 y 198,6 ± 11,3 M para HL-7702, respectivamente. Estos resultados proporcionan evidencia directa de que las células normales HEK-293 y HL-7702 son más resistentes a los efectos anti-crecimiento de NSC48693 en comparación con las células de cáncer de CFPAC-1, MiaPaCa-2, y BxPC-3. Con base en el efecto inhibidor del crecimiento causada por NSC48693 en las células cancerosas como se muestra en la Fig. 3, se investigó la apoptosis celular en respuesta a NSC48693. Higo. 5 sugiere que NSC48693 desencadena la muerte celular apoptótica de las células de cáncer de páncreas, lo que implica que NSC48693 tiene mayor citotoxicidad a través de inducción marcada muerte celular por apoptosis en células de cáncer. Además, diferentes tipos de células varían profundamente en su susceptibilidad a la inducción de apoptosis, que de arrendamiento a umbrales celulares distintos existentes para la inducción de la apoptosis [29]. La cuestión fundamental es que rodea los tejidos o células normales pueden hacer una pausa y reparar el daño, mientras que las células tumorales mueren por apoptosis. NSC48693 parece ser menos tóxico para las líneas de células normales, que pueden atribuir a esta posibilidad de que las células normales tienen algunos mecanismos de protección contra NSC48693 [30]. Durante la reducción celular normal, peróxido de hidrógeno genera y produce radical hidroxilo. Estos se pueden perder a través de desacoplamiento o expulsados, lo que lleva al daño oxidativo. Las células normales tienen mecanismos de protección para desintoxicar excesiva de ROS, lo que lleva a la reducción del efecto tóxico de NSC48693 en HEK-293 y HL-7702.
La apoptosis puede ser desencadenada por varios estímulos, y se consideran las mitocondrias para jugar un papel central tanto en la caspasa-dependiente y la caspasa-independiente apoptosis [31]. Las mitocondrias inician dos vías de la apoptosis distintas, a saber la vía mitocondrial intrínseca y extrínseca vía del receptor de muerte de membrana [32]. Para el mayor de los fármacos quimioterapéuticos, la apoptosis es iniciada por la vía mitocondrial intrínseca [27], [28]. Por lo tanto, la comprensión de la regulación de la vía apoptótica intrínseca mitocondrial es importante para el desarrollo de nuevos inductor de la apoptosis y la verificación de la inducción de la apoptosis.