Extracto
glicoconjugados de la superficie celular presentan alteraciones de sus estructuras en las enfermedades crónicas y epítopes de oligosacáridos diferentes se han asociado con el cáncer. Entre ellos, los glicanos presentes truncadas (GlcNAc) residuos terminales no reductores β-N-acetilglucosamina que son raras en los tejidos sanos. Las lectinas de fuentes no convencionales, tales como hongos o algi proporcionan nuevos marcadores que se unen específicamente a dichos epítopos, pero su disponibilidad puede ser un reto. Una lectina de unión GlcNAc del cuerpo fructífero del hongo
Psathyrella velutina gratis (PVL) se ha producido con un buen rendimiento en el cultivo bacteriano. Un fuerte especificidad para residuos de GlcNAc terminales se evidenció por matriz de glicanos. los valores de afinidad obtenidas por resonancia de plasmones de superficie microcalorimetrıa y demostraron una afinidad micromolar para los epítopos GlcNAcβ1-3Gal y para biantennary N-glucanos con ramificaciones GlcNAcβ1-2Man tapados. La estructura cristalina de un complejo con PVL GlcNAcβ1-3Gal estableció la base estructural de la especificidad. Etiquetado de varios tipos de células de cáncer y el uso de inhibidores del metabolismo glicano indicó que rPVL se une a GlcNAc terminal, pero también para ácido siálico (Neu5Ac). Análisis de la expresión de glicosiltransferasa confirmó la mayor cantidad de GlcNAc presente en las células cancerosas. rPVL unión es específica de tejido de cáncer y débil o no se observa ningún etiquetado para los sanos, a excepción de las glándulas del estómago que presentan mucinas únicas αGlcNAc presentadoras. En los carcinomas de pulmón, mama y colon, una delineación clara se pudo observar entre las regiones de cáncer y tejidos sanos circundantes. Por lo tanto, la LPV es una herramienta útil para el etiquetado agalacto-glicanos en el cáncer u otras enfermedades
Visto:. Audfray A, Beldjoudi M, Breiman A, Hurbin A, Boos I, Unverzagt C, et al. (2015) A recombinante por hongos lectina para el etiquetado truncadas glicanos en células de cáncer humano. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10.1371 /journal.pone.0128190
Editor Académico: Els JM van Damme, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: 28 Enero, 2015; Aceptado: April 24, 2015; Publicado: 4 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Audfray et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. LPV /complejo ligando ha sido depositado en el Protein Data Bank con el código de 4UP4
Financiación:. Agence Natioale de la Recherche: otorga NeoLect-11-BSV5 y ANR-11-LabX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología: CM1102 COST Acción (http://www.cost.eu/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
son conocidos cambios en la glicosilación de la superficie celular que se asocia con un gran número de enfermedades crónicas y los glicanos de cáncer representan un campo muy prometedor para el descubrimiento de biomarcadores [1-3]. Correlación de la inflamación o metástasis con sobreexpresión de epítopos sialilados y fucosilados, como sialil Lewis x ha sido objeto de intensa investigación. Sin embargo, en otros casos, el metabolismo muy activo y División de las células cancerosas pueden resultar en la exposición anormal de los epítopos crípticos. Esta parte interna de glicoconjugados, que han sido decoradas por otros monosacáridos en las células normales, por lo que puede estar expuesto en la superficie celular y se convierten en disponibles para la detección por anticuerpos o lectinas [4].
N-acetilglucosamina (GlcNAc ) es un residuo de hidrato de carbono que está presente en la parte interna de N-glicanos, como el núcleo quitobiosa vinculada a residuo de asparagina y más raramente como β1-4 ligado al núcleo de manosa en N-glicanos bisectados ramificado. GlcNAc también está presente en las ramas de estos glicoconjugados, ya sea-β1-2 ligada a manosa (Man) en el núcleo de trimanosa o-β1-3 vinculado a la galactosa (Gal) como parte de las ramas de polilactosamina extendido (Fig 1A). Sin embargo, debido a la actividad de galactosiltransferasas y las sialiltransferasas, estos residuos de GlcNAc no están en posiciones terminales en los tejidos normales. Del mismo modo glicoesfingolıpidos contienen GlcNAcβ1-3 o β1-6 vinculado a Gal pero no en posiciones terminales expuestos. Los epítopos son similares en mucinas con Gal, ácido siálico (Neu5Ac) o residuos de fucosa (Fuc) tapado los epítopos terminales. La única excepción es un epítopo rara que consiste en α1-4 vinculados mucinas terminados en GlcNAc a partir de células glandulares mucosas del estómago [5] (Figura 1A).
A. Ejemplos de oligosacáridos normales y truncadas que se pueden encontrar en los tejidos normales o de cáncer. Codificación para la representación esquemática de monosacáridos está en la parte inferior de la figura. El heptasacárido utilizado en experimentos de unión se indica como "hepta". B. Síntesis de heptasacárido azida 2 correspondiente a oligosacáridos "hepta" en el panel A.
La aparición de epítopos βGlcNAc de terminación aberrantes se ha observado en un número limitado de tipos de cáncer, incluyendo células de leucemia humana [6 ]. IgG con truncados N-glicanos se han reportado en el suero de pacientes con cáncer de próstata [7]. Se propusieron mucinas alterados con motivos GlcNAc terminales para formar el epítopo Tk, un antígeno asociado a tumor de colon [8]. La caracterización más precisa de las alteraciones de la glicosilación con la exposición de GlcNAc interna se realizó por análisis de glicoma carcinoma diferente, que apunta a la ocurrencia de corto truncados N-glicanos terminados por GlcNAβ1-2Man tanto en la antena y de lineal terminado-GlcNAc y glicoesfingolípidos ramificados , particularmente en carcinoma de pulmón de células pequeñas y adenocarcinoma, sino también en riñón, mama y carcinoma de ovario [9] (Fig 1A).
Las lectinas, generalmente derivado de las plantas, se ha demostrado ser muy eficaz para la detección de glicosilación aberrante en muestras biológicas. Una nueva tecnología es el uso de matrices de lectina que puede contener lectinas con gran espectro de especificidad y, por tanto, caracterizar la variación de la glicosilación [10]. El uso de lectinas extraídos de organismos naturales puede llevar mucho tiempo y puede generar problemas de contaminación o variaciones entre lotes. Por lo tanto, la tecnología lectina recombinante está empezando a desarrollarse [11]. Las lectinas que se utilizan clásicamente para GlcNAc-unión son extraídos de plantas como el trigo (WGA), tomate (SLT) y
Griffonia simplicifolia gratis (GSL-II). Una nueva lectina-GlcNAc específico (PVL) se purificó a partir de los cuerpos de fructificación y el micelio de un hongo,
Psathyrella velutina
[12] y luego estructuralmente caracterizado [13]. Una proteína estrechamente relacionada, la lectina de setas 2
Agrocybe aegerita gratis (AAL-2) ha sido recientemente clonado y demostrado que se unen a las células de hepatoma [14]. La estructura PVL presenta un novedoso veces entre las lectinas, con siete beta hojas dispuestas en un pliegue β-hélice. Por consiguiente, la lectina adopta una forma de rosquilla con seis sitios de unión GlcNAc, y se espera que presente una fuerte avidez por la superficie de las células que presentan una elevada densidad de los residuos de GlcNAc terminales
.
El objetivo del presente trabajo fue producir una forma recombinante de PVL y caracterizar su especificidad fina hacia los diferentes epítopos GlcNAc-terminado que podrían estar presentes en formas truncadas relacionados con la patología de glicoconjugados humanos. La avidez de la lectina de superficie decorada-GlcNAc se evaluó en matrices. Por último, también se ha descrito la capacidad de la lectina para etiquetar las células cancerosas y tejidos de carcinoma.
Materiales y Métodos
Materiales
GlcNAc se han comprado de Sigma-Aldrich. Disacárido GlcNAcβ1-3Gal, lacto-N-tetraosa (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), lacto-N-triosa (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) quitobiosa (GlcNAcβ1-4GlcNAc), quitopentaosa (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) han sido comprados a Elicityl (Crolles, Francia). Sialidasa de
Clostridium perfringens
ha sido comprados de Sigma-Aldrich (Ref. N2876) o New England Biolabs (Ipswich, MA). ß-D-N-acetil-hexosaminidasa
f de
Streptomyces plicatus
se adquirió de New England Biloabs. La lectina-ácido siálico específico marcado con biotina MAH se adquirió de Vector Labs (Burlingame, CA):
Síntesis de N-glicano 2
Nonasaccharide azida 1 (Fig 1B) se preparó a partir de yema de huevo seguido de hidrólisis enzimática y azidación [15, 16]. 5,1 mg (3,1 mmol) de nonasaccharide 1 se disolvió en 203 l de tampón de fosfato (100 mM, pH 6,8, 1 mM de MgCl
2). 10 unidades de liofilizado β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) se añadieron a la solución. La mezcla se incubó a 37 ° C durante 3 días (TLC: 2-propanol, 1 M de acetato de amonio, 2: 1). Después de la liofilización, el residuo se purificó por filtración en gel (Superdex 30, 1,6 x 60 cm, 0,1 m NH
4HCO
3, 0,9 ml min
-1). El pico, que eluye a 86 min, se liofilizó y se desaló por filtración en gel (Sephadex G-25, 2,5 x 15,5 cm, 5% de etanol en agua, 0,6 ml min
-1). El pico, que eluye a 75 min, se liofilizó dando 2,9 mg (2,2 mmol) de heptasacárido 2 (70%). [Α]
D
22 = -9,0 (c = 0,5, H
2O). La pureza fue confirmada por 360 MHz
1H NMR en D
2O (S1 figura)
1 H-RMN (360 MHz, D
2O): δ = 5,03 (d,
J
1,2 & lt; 1 Hz, 1H, H-1
4), 4,83 (d,
J
1,2 & lt; 1 Hz, 1H, H- 1
4 '), 4,68-4,64 (m, 2H, H-1
1, H-1
3), 4,53 (d,
J
1,2 = 7,7 Hz, 1H, H-1
2), 4,47 (d,
J
1,2 = 8,3 Hz, 2H, H-1
5, H-1
5 '), 4.18 a 4.15 (m, 1H, H-2
3), 04/12 a 04/09 (m, 1H, H-2
4), 4.4 a 4.1 (m, 1H, H- 2
4 '), 1,99 (s, 3H, NAc), 1,97 (s, 9H, NAC). ESI-MS: m /z calculado para C
50H
83N
7O
35: 1.341,49; encontrado 1342,62 (M + H)
+, 1365.86 (M + Na)
+
Producción de
PVL recombinantes
Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica de la lectina de fructificación el cuerpo de la seta
P
.
velutina gratis (GenBank, número de acceso DQ232759) [13] complementado en la posición N-terminal con los aminoácidos MSVVVIS fue sintetizado después de la optimización de codones para la expresión en
Escherichia coli gratis (GenScript, Piscataway, NUEVA JERSEY). Se introdujo en el vector de expresión pET25b utilizando sitios de restricción NdeI y XhoI. El vector PET25-rPVL se transformó en
E
.
coli
BL21 (DE3) (Novagen), y las células que albergan el plásmido PET25-rPVL se cultivaron en caldo LB que contiene 100 mg ml
-1 ampicilina a 37 ° C hasta que A600 alcanzó 0,7. Las células se cultivaron a continuación durante 16 h después de la adición de 0,5 mM isopropil-β-D-tiogalactopiranósido. Después de la centrifugación (7000 x g durante 15 min), las bacterias se resuspendieron en tampón de equilibrado (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM) y se rompieron por disrupción celular a una presión de 1,7 kilobars (Constant Systems Ltd). Después de la centrifugación (50.000 x g, 30 min a 4 ° C) y la filtración, cromatografía de afinidad en una columna de GlcNAc-agarosa (laboratorios EY inc.) Se realizó en el sobrenadante. rPVL se le permitió unirse a GlcNAc inmovilizado en tampón de equilibrio, y después de lavar (20 mMTris /HCl pH 7,5, 1 M NaCl), se eluye con 200 mM de GlcNAc libre en tampón de equilibrio. La proteína purificada se dializa extensamente contra agua ultrapura durante 7 días, se liofiliza y se almacena a 4 ° C.
array glicanos
purificada rPVL fueron etiquetados con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) de acuerdo con instrucciones del fabricante y se purificaron de nuevo en una columna de poliacrilamida desalación D-sal (Pierce). Alexa marcado con rPVL se utilizó para la matriz de glicanos cribado con el procedimiento estándar de la interacción proteína-glicanos Core (H) del Consorcio para Funcional Glycomics.
desplazamiento térmico en el análisis
ensayos de cambio térmico fueron realizado utilizando un Mini Opticon, máquina de PCR en tiempo real (Bio-Rad Laboratories) con 0,5 mg ml
-1 de proteína diluida en NaCl 100 mM, 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM CaCl
2, con o sin oligosacáridos en un volumen total de reacción de 25 l. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) se utilizó como una sonda fluorescente detectada a 530 nm. La temperatura se elevó utilizando pasos de 1 ° C /hora de 25 ° C a 100 ° C y lecturas de fluorescencia se tomaron en cada intervalo. Un valor ΔTm positivo indica que el ligando estabiliza la proteína a partir de la desnaturalización, y por lo tanto se une a la proteína. Un mínimo de dos mediciones independientes se realizaron para cada condición
Microcalorimetría
rPVL liofilizado recombinante se disolvió en tampón (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 mM CaCl
2) y desgasificada. La concentración de proteínas se comprobó mediante la medición de A280 usando un coeficiente de extinción molar teórico de 65.890 M
-1 cm
-1. ligandos de carbohidratos se disolvieron en el mismo tampón, se desgasificó, y se cargan en la jeringa de inyección. ITC se realizó con un microcalorímetro ITC200 (GE Healthcare). La solución rPVL se colocó en una celda de muestra 200 l a 25 ° C. La titulación se realizó con 20 inyecciones de 2 l ligandos de carbohidratos cada 120 s. Los datos experimentales se ajustaron a una curva de valoración teórica utilizando software Origen suministrado por GE Healthcare, con? H (variación de entalpía), Ka (constante de asociación) y n (número de sitios por monómero de unión) como parámetros ajustables. cambio de energía libre (? G) y la entropía contribuciones (TΔS) se obtuvieron a partir de la ecuación? G =? H - TΔS = -RT ln Ka (con T la temperatura absoluta y R = 8,314 J mol
-1 K
- 1). Dos titulaciones independientes se realizaron para cada ligando probado.
Superficie de resonancia de plasmón
Todos los experimentos de SPR se realizaron en un instrumento Biacore X100 (GE Healthcare) a 25 ° C en HBS (Hepes 10 mM /NaOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%) suplementado con 100 mM de CaCl
2 a un caudal de 30 l min
-1. La unión se mide como unidades de resonancia con el tiempo después de la sustracción en blanco y, a continuación, los datos fueron evaluados utilizando el software de evaluación Biacore X100, versión 2.0. Las constantes de disociación se determinaron mediante el trazado de la respuesta en el equilibrio (Req, 10 s antes del final de la inyección) contra la concentración del analito. Para el chip recubierto con proteína, 3500 unidades de resonancia de rPVL (100 mg ml
-1, 10 mM de tampón de acetato de pH 6,2) se han inmovilizado en el canal de flujo 2 de un chip CM5 de calidad para investigación usando procedimientos de acoplamiento de amina estándar. canal de flujo 1 se ha activado /desactivado. Los experimentos consisten en la inyección de asociación (360 s, 400 s de disociación) de varias concentraciones de oligosacáridos (2 diluciones en cascada de plegado, de 0 a 10 mM) en ambos canales.
Cristalografía de Proteínas
Los cristales de rPVL complejado con GlcNAcβ1-3Gal se obtuvieron por la gota colgante a 20 ° C. proteína liofilizada se disolvió en 2,5 mg ml
-1 en tampón 10 mM Hepes /NaOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 mM CaCl
2 y se incubaron con GlcNAcβ1-3Gal 1 mM durante 1 hora a temperatura ambiente antes de su co-cristalización. Una gran cristal rectangular como se obtuvo de 20% PEG3350, 0,2 M formiato de sodio y 0,1 M de fosfato de diamonio después de varios meses. Una pieza se monta directamente en una cryoloop y flash congela en nitrógeno líquido. Los datos de difracción se recogieron a 100 K en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (Grenoble, Francia) en la estación de BM30A usando un detector CCD Q315r ADSC [17]. Los datos se procesaron utilizando XDS [18]. El resto de la informática se realizó utilizando la suite CCP4 [19] estadísticas de calidad de datos se resumen en la Tabla S1. La técnica de reemplazo molecular se utilizó para resolver la estructura con PHASER [20] y las coordenadas de los nativos (código 2C4D Protein Data Bank) PVL [13]. La estructura fue refinada por el refinamiento de máxima verosimilitud restringida utilizando REFMAC 5.8 [21] itera con la reconstrucción manual Coot [22]. La incorporación del ligando se realizó después de la inspección de los mapas MFO-DFC ponderados. Las moléculas de agua, introducido de forma automática utilizando la focha, se inspeccionaron manualmente. La calidad estereoquímica de los modelos se evaluó con el programa Molprobity [23], y las coordenadas fueron depositadas en el Protein Data Bank bajo los códigos 4UP4.
Células líneas
Humano cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (H358, A549, H441 y H322), epitelio bronquial (HBEC-3kT), cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-231), cáncer de ovario (OVCAR3), cáncer de próstata (DU-145), piel carcinoma de células escamosas (A431), melanoma (A375, Colo829 y SKMel28), y cáncer de colon (HT-29) líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). La línea celular de melanoma M119 fue un regalo del Dr Nathalie Labarrière (INSERM U892, Nantes, Francia). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Gibco, Cergy Pontoise, Francia), a excepción de MDA-MB-231 y HT-29, que se hicieron crecer en DMEM 4,5 gl
-1 glucosa (Gibco), y HBEC-3kT , que se mantuvieron en medio de queratinocitos-SFM (Gibco). Todos los medios de cultivo se complementaron con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (5% de MDA-MB-231) y las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2, a 37 ° C.
Flow citometría de
Las células se trataron con tripsina, se dividió en alícuotas, a continuación, se lavaron dos veces en PBS (con Ca
2 + y Mg
2 +). Después de la incubación con rPVL-Alexa488 (5 y 10 mg ml
-1), las células se lavaron dos veces y el análisis se realizó en un citómetro de flujo Accuri C6 utilizando el Software Cflow-Plus (BD Biosciences). Alternativamente, rPVL biotinilado o MAH se utilizaron, seguido por estreptavidina-ficoeritrina (BD) y el análisis se realizó en un FACSCalibur con el software Cellquest (BD). Donde se indique, las células se pre-teated con sialidasa (Sigma) o ß-DN-acetil-hexosaminidasa durante 4 h a 37 ° C.
La inhibición de la glicosilación
células A549 se sembraron en 6 así placas y tratados con diferentes inhibidores de la glicosilación: un inhibidor de la fucosiltransferasa, fucosa 2-fluoro-peracetil (2FF) y un inhibidor de sialil-transferasa, ácido 3-fluoro-peracetil-neuramínico (3F-Neu5Ac) que se han descrito recientemente [24] . El tratamiento se realizó durante 4 días con 400 mM y 100 mM de 2FF y 3F-Neu5Ac respectivamente. El medio se reemplazó y se añadieron inhibidores de nuevo después de 2 días.
A fin de investigar el tipo de ligandos glicosiladas que son reconocidos por rPVL, se utilizó Kifunensin (Sigma) que bloquea ER α-manosidasa I y en consecuencia el procesamiento de N-glicanos; bencil-2-acetamido 2 deoxi-alfa-D-galactopiranósido (bencil-GalNAc; Sigma) que bloquea el proceso de O-glicosilación y 1R, 2R - (+) - 1-fenil-2-palmitoilamino-3-N-morpholine- 1-propanol (PPMP; Avanti Polar Lipids, Alabaster, EE.UU.), que inhibe la síntesis de glicolípidos. Las células se trataron con 5 mM Kifunensin durante 4 días como anteriormente. Para bencil-GalNAc y PPMP, las células se dejan en contacto con los inhibidores, en 6 mM y 10 mM, respectivamente, durante un período de 24 horas, a continuación, se cambió el medio y se incubaron las células durante 1 día más antes del análisis. Como 2FF, 3F-Neu5Ac y PPMP se diluyen en DMSO, se añadió DMSO puro para el medio de los pocillos de control con el fin de tener la misma concentración de DMSO en cada pocillo.
Inmunofluorescencia análisis
Células fueron sembradas en portaobjetos de cultivos de 4 cámaras (4x10
4 células por cámara). Después de 24 h, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 10 min a 4 ° C. Antes y después de la incubación con 1% de BSA /PBS (w /v), las células se lavaron con PBS frío tres veces durante 5 min cada uno. Las células se sometieron a continuación a tinción de inmunofluorescencia con rPVL-Alexa488 durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron con PBS frío tres veces durante 3 minutos cada uno. Las células fueron examinadas utilizando un microscopio BX41 equipado con un sistema de DP-70 cámara digital (Olympus, Tokio, Japón) y un microscopio confocal de pseudo-ApoTome equipado con AxioCam MRm (N /B).
Muestras de tejido
fijados con etanol tráquea humana, esófago, unión duodenal, yeyuno, colon, páncreas, hígado, ovario, útero y la vagina muestras se obtuvieron de donantes de órganos. 18 muestras de tejidos de 10 individuos diferentes se utilizaron para preparar un microarray de tejido (TMA) de los tejidos sanos. secciones de tumor colorrectal fijados con etanol se obtuvieron después de la cirugía del cáncer. muestras de NSCLC humanos incluidos en parafina fijados con formalina (n = 3 carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas n = 3) también fueron obtenidos. Un tumor de mama y un tumor de pulmón TMA (fijado en formol; 40 tumores, 10 y 10 metástasis emparejado emparejado adyacentes del tejido "normal") fueron comprados a SuperBiochip (Seúl, Corea del Sur). tumores mamarios caninos fijados en formalina se obtuvieron de "laboratorio de histopatología de los animales de la Facultad de Veterinaria de Nantes, ONIRIS) La inmunotinción se realizó un análisis en secciones de tejido de 3 micras de espesor.
histoquímica
El tejido secciones se desparafinaron, a continuación, las peroxidasas endógenas se bloquearon por incubación de las secciones con PBS que contenía 3% de peróxido de hidrógeno (v /v), para 5 mn. las secciones fueron bloqueadas con BSA al 5% (w /v) durante 30 min a temperatura ambiente , seguido de incubación con 0,7-1 g ml
-1 1h rPVL biotinilado a temperatura ambiente (secciones fijados con etanol) o 2 mg ml
-1 de rPVL biotinilado en PBS a 4 ° C durante 18 h ( para fijado en formol secciones). Después de lavar las secciones dos veces con PBS, un sistema de biotina-estreptavidina indirecta y DAB (Ventana Medical Systems) o AEC (vector Laboratories) kits de detección se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. las diapositivas desarrollados se lavaron dos veces con PBS y se contratiñeron con hematoxilina. Después de lavar con agua, las secciones se deshidrataron y se montaron. Se observaron las secciones con un microscopio BX41 equipado con un sistema de cámara digital DP-70 (Olympus, Tokio, Japón) o fotografiado con una NanoZoomer deslizable escáner (Hamamatsu, Hamamatsu City).
Para el tratamiento con glicosidasas, secciones se incubaron (después de desparafinación y peróxido de hidrógeno de bloqueo) con 50 u de sialidasa (New England Biolabs) o 25 u de ß-DN-acetil-hexosaminidasa durante 2 horas a 37 ° C. A continuación se añadieron enzimas frescas y las diapositivas se incubaron durante la noche a 37 ° C. portaobjetos de control se prepararon en paralelo con los tampones de enzimas correspondientes (citrato de sodio de pH 6 y 4,5, respectivamente). Después de la incubación durante la noche, los portaobjetos se lavaron dos veces en PBS, se bloquearon con PBS-BSA al 5% (w /v), se tiñeron con rPVL y la imagen como se describe anteriormente.
declaraciones Ética
Todo el tejidos humanos fijados con etanol tejidos fueron recogidos y almacenados antes de la ley 88-138 del 20 de diciembre de 1988 relativo a la resección de tejidos humanos después de la muerte para las investigaciones científicas. Por esta razón, ninguna aprobación por un Comité de Ética de la Investigación se aplica. Las muestras se obtuvieron del Centro Hospitalario de la Universidad de Nantes de Recursos Biológicos (http://relib.fr), en el marco del programa de Cancerología aprobado por el Ministerio de Investigación (aprobación DC-2011-1399). los bancos de tejidos y realizar investigaciones de los tejidos humanos fijados con formalina fueron aprobados por el Ministerio de Investigación (aprobación de CA-2010-1129) y por el Comité de Revisión Institucional Comité de Protección de Personnes regionales (CPP) 5-Sud Est (junta regional) . Todos los pacientes incluidos en este ensayo escrito el consentimiento informado. Estas muestras específicos se utilizaron previamente como se describe en la literatura [25, 26]. En cuanto a los microarrays de tejidos obtenidos a partir de Superbiochips Laboratories Ltd (Seúl, Corea), la empresa certifica que el "material humano se han eliminado o recogidos con el consentimiento previo del donante y que ningún pago en absoluto se ha hecho a este último". tejidos fijados con formalina de los tumores de mama caninos fueron obtenidos de "laboratorio de histopatología animal" de la Escuela de Nantes Veterinaria (ONIRIS). Los casos procedentes del Laboratorio de Patología del Hospital Clínico Veterinario de Oniris se utilizaron en este estudio. consentimiento por escrito de los propietarios y la aprobación del Colegio Oniris del Comité de Bienestar Animal local de Medicina Veterinaria se obtuvieron antes de la inclusión. el cuidado de los animales y el protocolo utilizado conforme con el número de la Directiva europea 2010/063 y la reglamentación francesa nacional (Decreto N ° 2013-118 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux Emplea à des fins scientifiques).
resultados
Producción y caracterización de rPVL
PVL se ha producido de forma recombinante (rPVL) en
e
.
coli
y purificada en un solo paso en una columna de GlcNAc-agarosa con un rendimiento final de 1 mg l
-1 de la cultura. Cuando se ensayó en eritrocitos de conejo, la lectina muestra fuerte hemaglutinación actividad a la concentración de 2,3 nM. La proteína recombinante es estable y muestra una temperatura de desnaturalización de 56 ° C mediante el análisis de desplazamiento térmico (S2 Fig). Además la estabilización de rPVL se puede obtener en la presencia de GlcNAc que contienen ligandos como GlcNAcβ1-3Gal o quitobiosa, con una Tm de 60 ° C para ambas, pero no en la presencia de hidratos de carbono no vinculante, como galactosa y sacarosa, confirmando la la actividad de unión GlcNAc.
rPVL es específico para la terminación de oligosacáridos con restos GlcNAc
la especificidad de la FPV recombinante se ensayó en la versión impresa de matriz de mamíferos 5.1 con 610 glicanos, en su mayoría de origen mamífero. La concentración rPVL fue variando de 0,2 mg ml
-1 a 0,2 mg ml
-1 y los cuatro conjuntos de datos están disponibles en el sitio CFG con primscreen_codes 5693, 5695, 5696 y 4697 (http: //www.functionalglycomics .org). La señal de fluorescencia era excelente y la concentración más baja era suficiente para la determinación de la fuerte preferencia por oligosacáridos que llevan un GlcNAc en su extremo no reductor (Fig 2).
Cada golpe se ha coloreado de acuerdo con el disacárido de terminales . oligosacáridos representativos se han mostrado esquemáticamente. Peaks indicados por un * corresponden a menor etiquetado de los oligosacáridos terminados siálico-ácidos. La lista completa de los oligosacáridos con intensidades de fluorescencia se encuentra disponible en el sitio web CFG (http://www.functionalglycomics.org).
La lectina unida de manera eficiente para GlcNAc presente en dos posiciones diferentes en N- truncada glicanos: GlcNAcβ1-2Man en los pentasacáridos núcleo e incluso en mayor medida en GlcNAcβ1-3Gal en la antena que se extendió por motivos polilactosamina. Debido al efecto de multivalencia, la señal fue máxima para las estructuras multiantennary (de 2 a 5 de la antena) con repeticiones de lactosamina, la ocurrencia de que se relaciona con la progresión del cáncer [27]. Polilactosamina bi o multi-antenarios N-glicanos con terminal de GlcNAcβ1-3Gal fueron atados con señales de fluorescencia superior a 1500 RU, mientras que los que tienen Galβ1-4GlcNAc terminales están en el ruido de fondo, por debajo de 150 RU. No se observa unión al motivo GlcNAcβ1-4Man presente en bisectados N-glicanos, pero la presencia de esta GlcNAc de bisección no obstaculizar la unión de PVL a la vecina antena terminado en GlcNAc. La lectina también obligado a mucina motivos que llevan βGlcNAc en la posición 3 y 6 de un residuo de GalNAc (tipo 4). Se une sólo débilmente al motivo quitobiosa (GlcNAcβ1-4GlcNAc) de la quitina. La lectina no es selectiva para la configuración anomérica de la GlcNAc y varios oligosacáridos con restos αGlcNAc terminales también fueron etiquetados. Tales epítopos están presentes en el heparán sulfato humana (GlcNAc α1-4IdoA) y en las mucinas de glándulas gástricas (GlcNAc α1-4Gal) [5], pero también en la clase III de mucina de tejidos de carcinoma que expresan un fenotipo gástrico [28]. La matriz de glicanos contiene una variedad de oligosacáridos con GalNAc terminal, pero PVL se observó unión sólo para el disacárido GalNAcβ1-3GalNAc (# 97) con una intensidad menor
.
Desde inmovilizado de tipo salvaje PVL se informó que se unen a glicoproteínas sialiladas [29], la unión a oligosacáridos con las estructuras sialiladas se comprobó. En efecto, una unión débil puede ser observado por biantennary N-glicanos con la terminación de epítopos Neu5Acα2-3Gal (# 603 en la figura 2). El nivel de fluorescencia estaba cerca del nivel de ruido (12% de maxium). No obstante, al comprobar los datos de la matriz de glicanos obtenida con una concentración más alta de la FPV (0,1 mg ml
-1), la unión a sialil oligosacáridos se convirtió claramente visible.
La afinidad de rPVL para diversos contiene GlcNAc oligosacáridos se puso a prueba para ambos libres y superficiales proteínas unidas utilizando microcalorimetrıa titulación y la resonancia de plasmones superficiales, respectivamente (Tabla 1 y figura S3). La afinidad por GlcNAc está en el mismo rango que previamente medido por el CCI con PVL nativa aislada de setas (Kd ≈200 M) [13]. Las mediciones cuantitativas confirmaron una afinidad más fuerte para las estructuras terminadas en GlcNAcβ1-3Gal que para GlcNAc y chitooligosaccharides, con la constante de disociación de aproximadamente 70 micras para el trisacárido lacto-N-triosa. Se observó una buena concordancia entre los valores medidos por ambos métodos. Sólo el heptasacárido N-glicanos que presenta dos epítopos GlcNAcβ1-2Man terminales mostró mayor afinidad hacia los rPVL en solución (Kd de 34 micrómetros) que en el chip de SPR. Esto puede ser debido al carácter bivalente de esta interacción particular que puede ser más fácil de establecer con la proteína en solución que fija en un chip. La unión de ambos residuos GlcNAc terminales de la heptasacárido biantenario se confirmó mediante la comparación de la estequiometría de GlcNAcβ1-3Gal lineal (cinco ligandos por rPVL) y de heptasacárido biantenario (dos ligandos por rPVL). La termodinámica de la unión también fue diferente ya que el glicano biantenario es la única a presentar una entropía favorable de la unión (Tabla 1), que podría explicarse por la preorientación de los dos residuos de GlcNAc en el espacio.
estructura cristalina de rPVL /disacárido
rPVL se cristalizó en complejo con GlcNAcβ1-3Gal, el disacárido que limita polilactosamina truncada N-glucanos. La estructura se resolvió en 1,95 Å resolución (S1 Tabla) y visualiza la espera de siete palas β-hélice de plegado (Fig 3). Dos ß-hélices están presentes en la unidad asimétrica, pero dado que son muy similares, sólo se describe la cadena A a continuación. La estructura global de la proteína recombinante fue muy similar a la descrita previamente para la de tipo salvaje PVL [13]. La diferencia principal fue la presencia de un ion de calcio adicional desde rPVL presenta calcio en tres bucles. Se observó densidad electrónica claro para el GlcNAcβ1-3Gal en cinco sitios de unión, mientras que el sitio 2 fue ocupada solamente por un residuo de GlcNAc (Figura 3A y 3B).
A. β-hélice pliegue de rPVL con la cadena peptídica representada como cinta de color de azul (N-terminal) a verde (C-terminal). Los disacáridos son representados como palo con mapas de densidad de electrones 2mFo-DFC contorneadas en 1 σ (ε 0,4 Å
-3). Los iones de calcio son representados como esfera de color rosa. B. La misma hélice con superficie accesible al disolvente de la proteína. C y D, los detalles de la interacción en el sitio 1 con las moléculas de disacáridos y de agua.