Extracto
El lactato se venía entre y dentro de las células, jugando metabólico y papeles en los tejidos sanos de señalización. El lactato es también un precursor de metabolismo alterado y participa en la patogénesis de la inflamación, hipoxia /isquemia, neurodegeneración y cáncer. Muchas células tumorales muestran altas tasas de producción de lactato en presencia de oxígeno, un fenómeno conocido como el efecto Warburg, que tiene implicaciones de diagnóstico y posiblemente terapéuticos. En este artículo presentamos Laconic, basado en un sensor de lactato codificado genéticamente-Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), diseñado en el factor de transcripción LldR bacteriana. Laconic lactato cuantificado a partir de 1 mM a 10 mM y no se vio afectada por la glucosa, piruvato, acetato, betahidroxibutirato, glutamato, citrato, α-cetoglutarato, succinato, malato o oxalacetato en concentraciones que se encuentran en el citosol de los mamíferos. Expresado en astrocitos, células HEK y células de glioma T98G, el sensor permite la estimación dinámica de los niveles de lactato en las células individuales. Usado en combinación con un bloqueador de la MCT transportador monocarboxilato, el sensor fue capaz de discriminar si una célula es un productor de lactato neto o un consumidor neto de lactato. La aplicación del protocolo de MCT-bloque mostró que la tasa basal de la producción de lactato es 3-5 veces mayor en células de glioma T98G que en astrocitos normales. En contraste, la tasa de acumulación de lactato en respuesta a la inhibición mitocondrial con azida de sodio fue 10 veces más baja en glioma que en los astrocitos, en consonancia con el metabolismo del tumor defectuoso. Una relación entre la tasa de producción de lactato y la tasa de acumulación de lactato azida inducida, que se puede estimar de forma reversible y en células individuales, se identificó como un parámetro muy sensible del efecto Warburg, con valores de 4,1 ± 0,5 para las células de glioma T98G y 0,07 ± 0,007 para astrocitos. En resumen, este artículo se describe un sensor codificado genéticamente para el lactato y su uso para medir la concentración de lactato, flujo de lactato, y el efecto Warburg en células de mamíferos individuales
Visto:. San Martín A, Ceballo S, I Ruminot , R Lerchundi, Frommer WB, Barros LF (2013) Un sensor de lactato FRET codificados genéticamente y su uso para detectar el efecto Warburg en células de cáncer individual. PLoS ONE 8 (2): e57712. doi: 10.1371 /journal.pone.0057712
Editor: Mika Jēkabsons, Universidad de Mississippi, España Estados Unidos
Recibido: 24 Septiembre, 2012; Aceptado: 24 Enero 2013; Publicado: 26 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 San Martín et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Apoyado en parte por Fondecyt subvención 1100936. el Centro de Estudios Científicos (CEC) está financiado por el Gobierno de Chile a través de los centros de excelencia basal Programa de Financiación de CONICYT y el Gobierno regional de los Ríos. FMB fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de la Salud (NIDDK; 1RO1DK079109). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el lactato es un anión orgánico que participa en el metabolismo intermedio de las células eucariotas y procariotas. En células de mamíferos, el lactato se produce a partir del piruvato por la enzima citosólica lactato deshidrogenasa (LDH) y se intercambia con el espacio intersticial y entre compartimentos subcelulares a través de transportadores de monocarboxilato (MCT). tejidos y tumores hipóxicos liberan grandes cantidades de lactato, y que una vez se pensó que la liberación de lactato fue siempre patológica, pero ahora se está volviendo evidente que, además de su papel en la hipoxia, lactato tiene funciones importantes en los tejidos sanos oxigenados. Intercelular y los intercambios subcelulares de lactato, un servicio de transporte de lactato denominadas, son una parte integral de la energía del metabolismo normal de los músculos y el cerebro [1], [2]. En tejido cerebral, a pesar de niveles normales o elevados de tejidos de oxígeno, la actividad neural se acompaña de un aumento agudo de lactato tejido. Si y cuando las neuronas producen o consumen lactato durante la actividad neuronal sigue siendo un tema controvertido [3] - [7], lo que beneficiaría en gran medida a partir de mediciones de lactato en las células individuales. Además, lactato apoya el proceso de mielinización [8], puede comportarse como una señal intercelular en el acoplamiento y sodio detección neurovascular [9], [10], controla su propia producción [11] y es necesaria para la formación de la memoria a largo plazo [12 ], [13]. papeles fisiopatológicos de lactato incluyen inflamación, cicatrización de heridas, infección microbiana, la neurodegeneración y el cáncer [14] - [18].
Los métodos estándar para medir el lactato se basan en reacciones enzimáticas que son seguidos por fotométrico o procedimientos amperométricos. Estos métodos están limitados ya que necesitan para consumir sustrato y /o exigir la destrucción de la muestra; ninguno de ellos es capaz de detectar lactato intracelular no invasiva en tiempo real o con la resolución de una sola célula. El presente artículo describe un reportero codificado genéticamente para el lactato, el uso de este reportero para la determinación de transporte de lactato y el flujo metabólico con una mejor resolución espacial y temporal, y el diseño de un parámetro sensible del metabolismo del cáncer.
LldR Flanqueado por el par de FRET MTFP-Venus informes [lactato]
codificado genéticamente Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) nanosensores se han desarrollado para medir los cambios dinámicos en la concentración de varias moléculas de interés biológico con una mejor resolución espacial y temporal. sensores FRET son proteínas de fusión compuestas de un resto de unión a ligando, el elemento de reconocimiento, y un par fluorescente con la superposición de espectros de emisión y excitación, típicamente PPC y YFP. La unión de la molécula de ensayo produce un cambio conformacional que afecta a la distancia y /o la orientación relativa entre las proteínas fluorescentes, provocando un aumento o una disminución en la eficiencia de FRET. El nanosensores descrito aquí se basa en LldR, un regulador de la transcripción bacteriana que consta de dos módulos, a /dominio de unión lactato-regulador y un dominio de unión a ADN [19], [20]. Para generar un sensor de lactato, se seleccionaron los genes LldR de
Corynebacterium glutamicum
y de
Escherichia coli
como elementos de reconocimiento potenciales. La estructura tridimensional de las dos proteínas de unión de lactato es prácticamente superponibles (Fig. 1A), sin embargo, son solamente 19.4% idénticos, difieren en numerosos residuos cargados que pueden alterar de barrido de superficie de carga y, posiblemente, el cambio en la eficiencia de FRET [21] . Como par de FRET se seleccionaron MTFP [22] y Venus [23], que, cuando se compara con PPC y YFP, son más brillantes y menos sensible al pH. La arquitectura general de los sensores se representa en la Fig. 1B, con MTFP situado en el extremo N-terminal, la LldR flanqueado por enlazadores, y Venus situado en el C-terminal. Ocho variantes fueron construidas para cada uno de los dos genes utilizando recombinación específica de sitio. Las variantes difieren con respecto a la presencia de dominio de unión a ADN y el enlazador longitud /composición (secuencias están disponibles en la Fig. S1). Un análisis comparativo mostró que, en respuesta a lactato
E. coli
y
C. quimeras glutamicum
cambiaron su relación de fluorescencia en dirección opuesta, y que las construcciones de
E. coli
eran más sensibles a lactato. Sorprendentemente, el dominio de unión al ADN era importante para el cambio de FRET. Como se muestra previamente para nanosensores de glucosa [21], los sensores de lactato que carecen de enlazadores artificiales obtuvieron mejores resultados (Fig. 1C). La variante con el mayor cambio de la relación absoluta se eligió para una caracterización adicional. Este nanosensores denominado Laconic (lactato óptico Indicador de Nano CEC) contiene el LldR de longitud completa de
E. coli Online Sin enlazadores artificiales. El espectro de emisión de Laconic se caracteriza por los picos esperados de MTFP y Venus de fluorescencia a 492 nm y 526 nm, respectivamente, y una disminución en la eficiencia de FRET en lactato de unión (Fig. 2A). No se conocen los cinética de LldR de L-lactato. La Figura 2B muestra que Laconic detectó lactato más de cuatro órdenes de magnitud (de 1 M a 10 mM), en lugar de los dos órdenes proporcionadas por los sensores de un solo sitio, tales como los nanosensores de glucosa [24]. Cuando se analizó
in vitro
, Laconic es al menos tan sensible como el mejor kit a base de enzimas comercialmente disponibles. curvas de respuesta de dosis de lactato se determinaron a diferentes valores de pH (Fig. 2C), que muestra un pequeño efecto en los valores de ácido y un efecto más marcado a valores alcalinos. La especificidad se investigó mediante la exposición del sensor a un panel de metabolitos y se detectó cierta interferencia para piruvato y citrato (Figs. 2D-I). El piruvato no cambió la relación de FRET (Fig. 2D), pero en altas concentraciones, el piruvato bloqueó el efecto de la baja de lactato (Fig. 2G). La concentración fisiológica de piruvato en células de mamífero es inferior a 100 micras y 10-50 veces menor que la de lactato [1], y por lo tanto piruvato endógeno no debe interferir con la detección de lactato en condiciones fisiológicas. Citrato a 1 mM aumentó la proporción de FRET en un 6% (Fig. 2D) y la reducción de la respuesta del sensor a la alta de lactato (Fig. 2H). No se observaron efectos en 10 mM o 100 mM de citrato (Figs. 2D y 2H). citrato citosólico es inferior a 100 mM [25] - [27] y por lo tanto no se espera que interfiera con la detección de lactato en el citosol. Sin embargo, la detección mitocondrial puede verse afectada como citrato mitocondrial es 10 veces mayor. relaciones redox extremos obtenidos con combinaciones de NADH y NAD
+ [28], eran sin efecto aparente sobre la detección de lactato (Fig. 2I).
(A) la estructura cristalográfica de LldR de
Corynebacterium glutamicum
[19], y la estructura 3D de LldR de
Escherichia coli
predicho usando LldR de
C. glutamicum Opiniones y FadR de
E. coli
como plantillas (M4T Server 3.0 del Laboratorio Fiser http://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (B) Diseño general: el regulador transcripcional LldR se intercala entre las proteínas fluorescentes MTFP y Venus, con péptidos artificiales que separan las proteínas (azul y naranja) enlazadores. (C) Efecto de lactato 10 mM en la proporción de fluorescencia de 8 variantes del sensor de lactato basado en LldR ya sea de
E. coli
o
C.
glutamicum. El más sensible de los constructos, indicadas por la flecha, se utilizó en el resto del estudio.
(A) los espectros de emisión en ausencia y presencia de lactato 10 mM. (B) La relación entre MTFP y fluorescencia Venus (a 430 nm de excitación) se midió a 0, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 mM de lactato. La línea continua corresponde a la mejor ajuste de una hipérbola rectangular doble a los datos, con valores aparente constante de disociación (K
D) de 8 ± 2 micras y 830 ± 160 m, y respectivos valores máximos? R de 8 ± 0,4% y 11 ± 0,4%. (C) las curvas de dosis-respuesta del lactato se midieron a los valores de pH indicados. La línea continua corresponde a la mejor ajuste de una hipérbola rectangular doble a los datos a pH 0,4. (D) de respuesta del sensor a 5 mM de lactato, piruvato, acetato, glutamato, β-hidroxi-butirato y glucosa, 1 mM de α-cetoglutarato, succinato, malato o oxalacetato, o concentraciones crecientes de citrato (0,01, 0,1 y 1 mM). En los paneles E a I, las curvas de dosis-respuesta del lactato se midieron en presencia de acetato de 1 mM, glutamato, β-hidroxi-butirato o glucosa (E), de 1 mM de α-cetoglutarato, succinato, malato o oxalacetato (F) , en 0,25, 1 mM o piruvato 10 mM (G), en 0,01, 0,1 mM o citrato de 1 mM (H), y en 0,2 M de NADH, 100 mM NAD +, o 0,2 mM NADH plus 100 mM NAD + (I). Las líneas continuas corresponden con el mejor ajuste de una hipérbola rectangular doble para el control de datos.
Informes Laconic citosólica de lactato en células de mamífero
El sensor se muestra la distribución citosólica se esperaba con la exclusión nuclear cuando expresado en células HEK293 (Fig. 3A). Aunque la mayor parte del sensor se encontró en el citosol, la posibilidad de que una pequeña fracción se localiza en el núcleo no se puede excluir. Sin embargo, no parece probable que el sensor se une al ADN de mamíferos, ya que este tipo de regulador de la transcripción hélice-giro-hélice no se expresa en células de mamífero. Más directamente, la unión de LldR a prokariotic ADN requiere la secuencia de 17 nucleótidos AATTGGCCCTACCAATT [20], que de acuerdo con un análisis de la explosión está ausente en el genoma de los mamíferos. La secuencia también está ausente en los promotores eucariotas (EPD, promotores eucariotas de base de datos, ExPASy). La posibilidad de interferencia del sensor con la transcripción, que no estamos a favor, puede ser abordado mediante la sustitución de Ile 23 con serina, informó recientemente para eliminar la actividad de unión al ADN de LldR [29].
células HEK293 (A) expresando Laconic proyectado en 440 de excitación /emisión 535). La barra de escala es de 20 micras. relación de (B) de la fluorescencia se midió en 0,01, 0,1, 1 y 10 mM de lactato extracelular en células HEK293 tratadas con inhibidores metabólicos y permeabilizadas para H
+ como se describe en Material y Métodos. (C) El curso temporal de MTFP y Venus fluorescencias se midieron en presencia de glucosa 2 mM /lactato de 1 mM o piruvato 10 mM, como se indica. Una célula con baja expresión del sensor requiere iluminación fuerte fue elegido para demostrar la falta de sensibilidad de la relación de fluorescencia para photobleaching. La relación de fluorescencia se convirtió en la concentración de lactato usando la relación en piruvato (cero lactato) como se describe en el texto.
Para la calibración, la glucólisis fue bloqueada con ácido yodoacético y el metabolismo mitocondrial fue bloqueada con rotenona, en la ausencia de glucosa, y la célula se pH-sujetan con el nigericine protón ionóforo en un tampón rica en potasio. Con flujo de lactato se detuvo y no gradiente de pH, se utilizó el MCT para equilibrar lactato través de la membrana de plasma. La curva de calibración resultante (Fig. 3B) fue similar en forma a la observada con la proteína purificada, lo que sugiere que el sensor
in situ
comporta como
in vitro
. Sin embargo, el cambio en la relación MTFP /Venus en todas las concentraciones de lactato era aproximadamente el doble de la observada
in vitro
. No sabemos por qué el rango dinámico del sensor es mayor en las células. Las explicaciones posibles incluyen la interferencia negativa de la marca de histidina utilizado para
in vitro
purificación, y /o una mejor estabilización de la proteína en el medio intracelular. El sensor no podría ser calibrado en astrocitos debido a que en estas células la privación de glucosa no logró agotar lactato, como se muestra por una respuesta robusta a piruvato (véase más adelante) y la falta de respuesta a bajas concentraciones de lactato (datos no mostrados), explica posiblemente por lactato sostenida la producción de glucógeno y /o diferente afinidad MCT. Incluso en las células HEK, permeabilidad MCT no es lineal y el daño celular severo causado por el procedimiento de calibración puede haber alterado la proteína del sensor. Por esta razón, un protocolo de calibración de un punto menos invasiva se ideó que se puede aplicar en el curso de los experimentos sin dañar las células. Para agotar las células de lactato, nos aprovechamos de una propiedad de los MCT y otros transportadores de facilitación denominado trans-aceleración o de cambio acelerado [30]. equilibrio termodinámico para la MCT depende de los gradientes de lactato y pH, pero también se ve afectada por el gradiente de cualquier otro sustrato. Se aplicó un gradiente de piruvato forzado hacia el interior para aumentar el número de hacia el interior frente a sitios de unión vacíos y disminuir el número de hacia el exterior frente a los sitios de unión vacíos, el aumento de flujo de salida de lactato y la disminución de afluencia de lactato. Un nuevo equilibrio termodinámico sólo podrá alcanzarse cuando el intra: extracelular de la relación lactato es igual a la intra: piruvato extracelular. Como lactato extracelular se mantuvo cerca de cero por superfusión de una solución libre de lactato, lactato intracelular se predice a caer, como se observa en la Fig. 3C. Monocloracetato (MCA), un sustrato de MCT redujo la proporción de fluorescencia en un grado similar como piruvato (Fig. S2), lo que indica que la producción de lactato a partir del piruvato es despreciable en comparación con la extrusión de lactato a través del MCT. Esto puede explicarse por el hecho de que la combinación de alta piruvato y no agota la glucosa severamente NADH [28], [31], lo que limita la reacción de LDH. Medición con un kit enzimático confirmó que MCA reduce el lactato de los astrocitos (Fig. S2). Con el valor de la relación de fluorescencia a lactato "cero", las constantes cinéticas determinadas
in vitro
, y suponiendo un cambio máximo de la relación de fluorescencia de 38% (a partir de la curva dosis-respuesta ajustadas a los datos de células HEK) , datos de fluorescencia se convirtieron en concentraciones de lactato como se ilustra en la Fig. 3C. Además validación del protocolo cero lactato fue proporcionada por la observación de que después de un prolongado glucosa /privación de lactato en las células HEK, piruvato no afectó a la proporción de fluorescencia (datos no mostrados), consistente con el agotamiento de lactato completo y un muy bajo NADH: NAD
+ proporción presente en las células de glucosa-privado [28], [31]. La evidencia anterior más el
in vitro
observación de que el sensor no responde a bajo de lactato en presencia de alta piruvato (Fig. 2G), sugiere que la proporción de fluorescencia en presencia de alta piruvato es una buena estimación de cero lactato. Sin embargo, incluso una pequeña señal residual puede introducir un sesgo significativo y se recomienda precaución cuando se utiliza el sensor de lactato de cuantificar, sobre todo en los astrocitos.
Al controlar el intercambio de lactato entre las células y el espacio intersticial, los MCT son ganglionar puntos de metabolismo de los tejidos. La captación de lactato 5 mM por los astrocitos se inhibió en un 65 ± 3% y 62 ± 7% en presencia de los bloqueadores de los MCT floretina y parachloromercurybenzoate (pCMBS; gráfico de barras en la figura S3.). Transformación de lactato a piruvato por LDH disminuirá la tasa de acumulación de lactato, pero debido a las concentraciones de piruvato son un orden de magnitud más bajos que los de lactato, este efecto debe ser pequeña. No esperamos que el búfer de lactato por la LDH o por el propio sensor que es un factor importante porque lactato intracelular, por lo general en el rango de cientos de micromolar a milimolar, es más abundante que sea [32], [33].
Medición de la producción de lactato y Consumo
El diagrama de flujo de la Fig. 4A muestra cómo la concentración intracelular de lactato se ve afectada por la producción glicolítica, el consumo mitocondrial y exportación /importación a través del MCT. La tasa de glucólisis en su punto de entrada se ha estimado con un sensor de glucosa FRET mediante el bloqueo del transportador de glucosa GLUT mientras que el control de la velocidad a la que la hexoquinasa agota la reserva intracelular de la glucosa [34], una técnica que ha servido para detectar cambios rápidos en los astrocitos glucólisis en respuesta a las señales neuronales [11], [35], [36]. Siguiendo el mismo principio, el intercambio de lactato se investigó en células HEK293 perturbando el estado estacionario con un bloqueador MCT mientras que la medición de lactato citosólica con Laconic. En la presencia de glucosa como combustible exclusivo, floretina provocó una acumulación de lactato intracelular, indicativo de la producción neta de lactato, pero si la glucosa se reemplazó por el lactato, el resultado fue el agotamiento de lactato (Fig. 4B), indicativo de importación neta de lactato. En las células HEK floretina inhibida sólo el 57 ± 5% de la actividad MCT (Fig. S3), y por lo tanto subestima las tasas reales de producción o el consumo en aproximadamente 40%. pCMBS fue un bloqueador de MCT más eficaz que floretina en las células HEK, con 96 ± 1% de inhibición (Fig. S3), dando una estimación más precisa de la producción de lactato (Fig. 4C). En astrocitos, la tasa de producción de lactato calcula con el procedimiento de calibración descrito en la Fig. 3C fue de 2 ± 0,5 micras /s (n = 22 células en tres experimentos), que cae en el orden de magnitud correcto teniendo en cuenta que bajo cultivo y experimentales idénticas condiciones astrocitos consume la glucosa a las 2 micras /s [34] y que un poco de glucosa es oxida a CO
2. la inhibición aguda de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) con azida estimuló la producción de lactato por varias veces (Fig. 4D), adecuado para la estimulación observada de consumo de glucosa [34]. Las mediciones de pH de control con BCECF mostraron que azida causó una pequeña acidificación que en astrocitos alcanzó 0,1 unidades de pH durante el período en el que se determinó la acumulación de lactato (Fig. S4). Por 2 min de exposición a la azida, los tres tipos de células se habían estabilizado a un pH de aproximadamente 0,2 unidades de pH inferiores a los valores de control. Los efectos de la floretina y pCMBS sobre el pH intracelular eran más pequeñas. Teniendo en cuenta la modesta sensibilidad del sensor de lactato a un pequeño acidificación (Fig. 2C), pH no parece ser un factor significativo en los efectos diferenciales de los inhibidores a lactato de detección en los astrocitos, las células HEK293 y T98G.
(A) Diagrama del metabolismo del lactato. La concentración citosólica de lactato depende del equilibrio entre la producción glicolítica, el consumo mitocondrial de piruvato y lactato, y el intercambio con la piscina lactato extracelular a través de los MCT. (B) lactato intracelular fue monitorizada en células HEK293 individuales durante las exposiciones transitorias a floretina (50 M), en presencia de glucosa 25 mM (panel superior) o lactato de 1 mM (panel inferior). (C) Las respuestas de lactato intracelular a inhibiciones transitorios del MCT con floretina (50 M) o pCMBS (500 m) se midieron de forma secuencial en la misma célula HEK293 en presencia de glucosa 25 mM. Las líneas rectas representan las pendientes de la acumulación de lactato provistos por regresión lineal durante el primer minuto de exposición. El gráfico de barras que resume los datos de tres experimentos. (D) El efecto de azida de sodio 5 mM se midió en un astrocito durante la exposición a floretina 50 mM.
unicelular en tiempo real Detección de Cáncer de Metabolismo
Las células cancerosas tienen mitocondrias defectuosas y fuerte glucólisis, un fenómeno conocido como el efecto Warburg, que también está presente en líneas de células [15]. Consistente con un papel de menor importancia para las mitocondrias en la producción de ATP en las células cancerosas, la medición de glucosa en tiempo real con el sensor de glucosa FRET [37] mostró que la glucólisis en las células de glioma T98G es mucho menos sensible a la inhibición de la fosforilación oxidativa de la glucólisis en astrocitos (Fig. S5) . Por lo tanto, una respuesta glicolítica robusta a la azida puede ser interpretado como un signo de que las mitocondrias tienen un papel importante en la producción de ATP celular. La reversibilidad de los efectos de la azida y floretina permitió aplicaciones secuenciales de azida, floretina y pCMBS a la misma celda. Los resultados muestran los astrocitos y células de glioma que presentan patrones opuestos, con astrocitos responden fuertemente a la azida pero débilmente a floretina /pCMBS y células T98G que responden débilmente a la azida y con más fuerza a floretina /pCMBS (Figs. 5A-D). Un análisis de la frecuencia de adquisición requerido para la estimación precisa de la respuesta a la azida se describe en la Fig. S6. Los experimentos de control mostraron que como se observa en las células HEK, en células de glioma T98G pCMBS es un mejor inhibidor de la MCT que floretina (95 ± 5% y la inhibición 53 ± 3%, respectivamente; Fig. S3). Una relación entre la producción de lactato basal y la respuesta a la inhibición de la fosforilación oxidativa medido en la misma gama de proporción de fluorescencia y en la misma célula debe ser insensible a la concentración de lactato y por lo tanto menos afectado por posibles diferencias en la concentración de lactato en reposo o comportamiento sensor entre tipos de células. una relación de este tipo, que hemos denominado el Índice de Warburg, era muy sensible a la diferencia metabólica entre astrocitos y células de glioma. Calculado con floretina, que subestima la producción de lactato más en las células de glioma y células HEK que en astrocitos (Fig. S3), el Índice de Warburg fue de 0,07 ± 0,01 en los astrocitos, 0,74 ± 0,15 en las células HEK y 1,7 ± 0,2 en las células de glioma. Calculado con pCMBS, el Índice de Warburg fue de 0,07 ± 0,01 en los astrocitos, 0,94 ± 0,08 en las células HEK y 4,1 ± 0,6 en células de glioma (Fig. 5E). inhibidores de MCT más específicos se están introduciendo en la investigación y en ensayos clínicos que se pueden utilizar en concentraciones micromolar o inferior. AR-C155858, un inhibidor específico de MCT1 y MCT2 [38], se encontró que inhibe la captación de lactato 5 mM en astrocitos por 87% (Fig. S7). El uso de AR-C155858 el Índice de Warburg estima en astrocitos fue de 0,07 ± 0,006 (Fig. S7). Los experimentos de control mostraron que floretina, azida y AR-C155858 no tuvieron efecto en la detección de lactato
in vitro gratis (Fig. S8). no se espera pCMBS para interactuar con el sensor, ya que no entra en las células de mamíferos.
(A) Un astrocito expresar Laconic fue expuesto de forma secuencial a la azida mM 5, 50 mM y 500 mM floretina pCMBS. Las líneas rectas representan las pendientes iniciales de acumulación de lactato equipado por regresión lineal dentro de la misma gama de valores de relación. (B) células de glioma T98G Un expresando Laconic se expuso de forma secuencial a la azida 5 mM, 50 mM y 500 mM floretina pCMBS. Las líneas rectas representan las pendientes iniciales de acumulación de lactato equipado por regresión lineal dentro de la misma gama de valores de relación. (C) Síntesis de las pendientes iniciales (Δ relación /min) obtenidos en tres experimentos del tipo mostrado en A y la trama B. (D) de correlación entre las tasas de acumulación de lactato (Δ relación /min) en azida y en pCMBS. Los símbolos representan los astrocitos individuales (blanco), células HEK293 (grises) o células T98G (negro). (E) El Índice de Warburg se estimó como la relación entre las tasas de producción de lactato con pCMBS y la acumulación de lactato con azida, y se utiliza para dar color a la silueta de cada célula de acuerdo con la tabla de consulta de 16 colores. El recuadro muestra una célula aislada que se encuentra a unos 100 m de la agrupación. El gráfico de barras se resumen los datos de 3 experimentos en cada tipo de célula. Las barras de escala son 20 micras. *, P & lt; 0,05 entre cada tipo de célula.
Discusión
Hemos utilizado el regulador transcripcional bacteriana LldR como elemento de reconocimiento para generar Laconic, un biosensor codificado genéticamente que detecta lactato en el rango fisiológico. Expresado en células de mamífero, el sensor es capaz de estimación sensible de la actividad del transportador de lactato y la producción de lactato y se utilizó para generar un nuevo parámetro de una sola célula del efecto Warburg, la marca metabólica de las células cancerosas. El desarrollo de un sensor basado en LldR proporciona la base para la creación de una amplia variedad de nuevos indicadores, porque la superfamilia GntR, de los cuales LldR es miembro, comprende por lo menos otros 270 factores de transcripción que se unen piruvato, ácidos grasos, aminoácidos, ciclo de Krebs intermedios, etc. [19], [39], que son posibles elementos de reconocimiento para nanosensores codificados genéticamente.
el sensor fue capaz de cuantificar los niveles de lactato en el intervalo entre 1 mM y 10 mM. El rango extendido de detección fue inesperado como sensores de metabolitos previamente desarrolladas abarcan solamente dos órdenes de magnitud [40] - [43]. Affinity se determina principalmente por las propiedades del elemento de reconocimiento y no por los socios fluorescentes, por lo que el comportamiento cinético distintivo de este sensor basado en LldR y su sensibilidad a los niveles mM de piruvato puede ser de interés para los investigadores que trabajan en la regulación transcripcional. Lacónica ofrece ventajas sobre los métodos alternativos, la primera es la resolución. ensayos enzimáticos y HPLC exigen un gran número de células, lo que hace datos significativos sólo si hay homogeneidad metabólico. tejidos reales e incluso cultivos de tejidos primarios son mezclas complejas de células que crecen y se diferencian mejor en presencia el uno del otro, siendo un ejemplo popular co-cultivos de neuronas y astrocitos. Al igual que con otros nanosensores genéticamente codificados-, Laconic puede expresarse
in vivo
en tipos de células identificadas mediante transgénesis o transducción viral y pueden ser dirigidos a orgánulos subcelulares. Otra ventaja de las mediciones ópticas es que no requieren la destrucción de la muestra, lo que permite el diseño de experimentos estadísticamente potentes y después antes de tipo. Además de ser transportado por los MCT, cuya actividad puede estimarse utilizando un colorante sensible al pH, lactato también se transporta de forma independiente de protones a través de uniones [44] y, posiblemente, a través hemichannels conexina y canales pannexin, fundentes que son invisibles para mediciones de pH y que ahora puede ser abordado.
Aunque la forma similar de las curvas de calibración obtenidas
in vitro
y en células HEK es alentador, la dureza necesaria del protocolo de calibración completa es un motivo de preocupación y se no es posible en esta etapa para asegurar que los parámetros cinéticos obtenidos
in vitro
representan el comportamiento del sensor en las células. Por tanto, los datos se pueden considerar como semi-cuantitativo y se expresaron en términos de relación Δ utilizando el punto de lactato cero como referencia, idealmente en antes y después de los experimentos con tasas de comparación en valores de relación similares. Otra limitación de Laconic es su sensibilidad al pH en el intervalo alcalino. En condiciones fisiológicas, el pH citosólico de la mayoría de las células fluctúa entre 7,0 y 7,4, intervalo en el que el sensor mostró poco cambio, pero dada la amplia gama de concentraciones de cubierta, incluso un cambio relativamente pequeño en el pH puede introducir un error en la determinación de lactato. Si un fuerte cambio de pH está presente, una corrección puede llevarse a cabo con proteínas o colorantes sensibles al pH rojo, co-cargados en las mismas células o con los experimentos BCECF paralelas. Una cuestión de pie en el metabolismo celular es el grado en que las mitocondrias metabolizan lactato en lugar de piruvato [45] - [47], un fenómeno que puede ser tratado con el sensor de lactato se expresa en el citosol. mediciones de lactato en la matriz mitocondrial pueden resultar más difícil debido a la reducción de la sensibilidad de Laconic para el medio ambiente de pH 7,8 a 8,0 de este compartimiento y la posible interferencia de citrato. Estas limitaciones pueden ser superadas quizás por mutagénesis, como se ha demostrado para la sensibilidad al pH del sensor de NADH Peredox [28].
El protocolo para evaluar la producción de lactato /consumo debería usar idealmente un inhibidor reversible capaz de bloquear la permeabilidad lactato sin que afecta a otras proteínas de membrana o procesos intracelulares. Ni pCMBS ni floretina cumplen con tal descripción, sino que se complementan entre sí. pCMBS no entra en la célula, pero se dirige a numerosas proteínas de la superficie y su efecto es irreversible, lo que impide el diseño de experimentos de antes y después. No sabemos por qué los astrocitos eran más resistentes a pCMBS. sensibilidad diferencial de las isoformas de MCT es posible, pero no se encontró evidencia de que en la literatura. Se espera que la inhibición parcial por pCMBS a subestimar la producción de lactato en astrocitos en alrededor de 35%, con un sesgo similar introducido en el índice de Warburg. El efecto de floretina es reversible, pero menos eficaz y no es específico, ya sea. 4-5.