Extracto
Un biorreactor versátil, apto para el cultivo de células en suspensión dinámica bajo condiciones de estrés de cizalla sintonizables se ha desarrollado y probado de manera preliminar esferoides celulares de cáncer de cultivo. Mediante la adopción de soluciones tecnológicas sencillas y evitando los componentes de rotación, el biorreactor explota la hidrodinámica laminares que se establecen dentro de la cámara de cultivo celular que permite la suspensión dinámica en un entorno favorable para el transporte de masa, bajo una amplia gama de condiciones de esfuerzo cortante sintonizables. La fase de diseño del dispositivo ha sido apoyado por el modelado multifísica y ha proporcionado un análisis exhaustivo de los principios de funcionamiento del biorreactor. Por otra parte, un ejemplo explicativo en el presente documento se presenta con multifísicos simulaciones utilizadas para establecer las condiciones de operación adecuadas para el biorreactor preliminar
in vitro
pruebas biológicas en una línea celular de carcinoma de pulmón humano. Los resultados biológicos demuestran que la suspensión dinámica de cizallamiento ultra proporcionada por el dispositivo es beneficioso para esferoides celulares de cáncer de cultivo. En comparación con el control de la suspensión estática, suspensión de células dinámico preserva las características morfológicas, promueve la conexión intercelular, aumenta el tamaño del esferoide (aumento de 2,4 veces) y el número de células en ciclo (aumento 1,58 veces), y reduce el doble de daño de DNA de cadena (1,5 veces reducción). Se prevé que la versatilidad de este bioreactor podría permitir la investigación y la expansión de diferentes tipos de células en el futuro
Visto:. Massai D, Isu G, Madeddu D, Cerino G, Falco A, Frati C, et al . (2016) Un versátil biorreactor para cultivo celular en suspensión dinámica. Aplicación a la cultura de cáncer esferoides celulares. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10.1371 /journal.pone.0154610
Editor: Maurizio Pesce, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
Recibido: Diciembre 23, 2015; Aceptado: 15 Abril de 2016; Publicado: 4 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Massai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación: Este trabajo recibió financiamiento parcial de (1) a la Cooperación Europea 7PM - Proyecto de colaboración "bioactivos altamente poroso e inyectables andamios Control de Stem Cell reclutamiento, proliferación y diferenciación. y activación de la angiogénesis para Cardiovascular Engineered tejidos "- BIOSCENT, 2009-2013 (ID 214539), y (2) el Proyecto Nacional italiano PRIN 2012" Un Bioprocesos para la Optimización de las construcciones 3D para la medicina regenerativa cardiaca cardioesfera basado "- BEAT3DHEART, 2014 -2017 (20123E8FH4), así como fondos adicionales interna como Politecnico di Torino y la Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl proporcionado apoyo financiero en forma de salario por autor GFDL y materiales de investigación, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de los autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y los autores de este manuscrito tiene los siguientes intereses en competencia: Giuseppe D'Urso Falvo Labate sirve como CEO de Bioexpansys Srl, el distribuidor del dispositivo de cultivo dinámico. Ninguno de los autores han recibido honorarios o cuota de asesoramiento en la redacción de este manuscrito. No se informó de otros posibles conflictos de interés respecto de este artículo. Ni Bioexpansys Srl ni ninguna otra empresa privada han tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las condiciones del Dr. D'Urso Falvo Labate o cualquier otro de los autores del empleo no alteran los autores de la adhesión a las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos o materiales.
Introducción
La producción a gran escala de las células es un paso obligatorio para establecer económicamente viable en modelos experimentales in vitro para la investigación básica, el modelado de la enfermedad y la prueba de la droga, y sin duda para traducir las estrategias de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa para la práctica clínica para aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, la escalabilidad y la estandarización de los procesos de fabricación celulares siguen siendo los principales retos. En particular, cuando un gran número de células (10
10-10
12) son obligatorios, (2D) estrategias de cultivo bidimensionales convencionales, basados principalmente en el manual, las intervenciones extremadamente espacio y mano de obra intensiva, son prácticamente y financieramente insostenible [1-5].
en una perspectiva de ampliación a escala e inspirado en los procesos de fabricación de productos terapéuticos en la industria biofarmacéutica [6,7], en tres dimensiones (3D) de cultivo en suspensión ha demostrado ser una alternativa ventajosa al monocapa técnicas para la expansión a gran escala de células [4,5,8,9]. En detalle, los métodos de suspensión han sido ampliamente adoptados: (1) para la expansión escalable y controlada de células madre [10-15] y las células del cáncer [16-18]; (2) para guiar la diferenciación de células madre [13,19-22]; (3) para la producción de esferoides celulares y construcciones de tejido similar a [23-25]. La provisión de un entorno de cultivo en suspensión 3D, imitando el microambiente del nicho celular, ha demostrado ser beneficioso, la promoción de la supervivencia celular y la retención de propiedades funcionales de células
in vitro
[9,26,27]. Además, cuando la suspensión se obtiene por mezcla dinámica del medio de cultivo, (1) la formación de gradientes en, por ejemplo, temperatura, pH, oxígeno disuelto, nutrientes /se impide metabolitos, (2) se aumenta el transporte de oxígeno y nutrientes, y (3) se evita la sedimentación de cultivos de células /constructos, con lo que superan las limitaciones intrínsecas de los sistemas de cultivo estáticas [4,7,9,28].
Hoy en día, el cultivo en suspensión dinámica para la producción y la diferenciación escalable de las células se lleva a cabo principalmente por tanque agitado y biorreactores de rotación [2,4]. Tales dispositivos están diseñados para proporcionar un ambiente de cultivo homogéneo 3D y para permitir el seguimiento y control de los parámetros de cultivo, dando lugar a procesos más reproducibles, robustas y rentables [5, 29,30,31]. Sin embargo, la mayoría de estos biorreactores todavía sufren de problemas críticos, lo que limita la ampliación de la escala y la estandarización de los bioprocesos de expansión. En cuanto a los biorreactores de tanque agitado, su rendimiento puede verse afectada por (1) colisiones de las células con el impulsor y (2) la aparición de flujo turbulento, que ambos pueden inducir tensiones mecánicas y hidrodinámico cizalla no fisiológicas en las células y dar lugar a daño celular. Por otra parte, estas condiciones desfavorables pueden afectar a la tasa de crecimiento celular y el metabolismo, interferir con la pluripotencia de células madre, y limitar la eficiencia y la reproducibilidad del proceso de cultivo [4,9,28,30,32,33]. biorreactores giratorios generan un ambiente de cultivo estrés de baja cizalladura, lo que permite superar en parte las limitaciones de los dispositivos de tanque agitado. Sin embargo, la complejidad de las soluciones tecnológicas adoptadas para la rotación hacen que estos dispositivos no son fácilmente escalables y no adecuados para el reemplazo medio continuo y monitoreo en tiempo real [4].
Se presenta aquí un biorreactor versátil, apto para esfuerzo de corte dinámico sintonizable cultivo de células en suspensión. En detalle, mediante la adopción de soluciones tecnológicas sencillas y evitar los componentes de rotación, el biorreactor propuesto permite la suspensión de células al asegurar un régimen de flujo de mezcla laminar, garantizando así oxígeno y el transporte de nutrientes y medio de cultivo en última instancia homogénea en una amplia gama de condiciones de estrés de cizallamiento.
con el fin de ir más allá del enfoque de ensayo y error experimental y para llegar a una comprensión más profunda de la dinámica de fluidos en desarrollo dentro del ambiente de cultivo [34,35], la fase de diseño del dispositivo ha sido apoyado por multifísica en silico modelado, proporcionando un análisis exhaustivo de los principios de funcionamiento del biorreactor. Por otra parte, los resultados de las simulaciones multifísicos sirven como criterios para establecer las condiciones de operación adecuadas para el biorreactor
in vitro
pruebas preliminares en. En particular, este primer estudio se centró en la evaluación de la idoneidad del biorreactor como dispositivo de suspensión dinámica tensión de corte ultra bajo para el cultivo de esferoides de células de cáncer. Para este propósito, la línea celular de carcinoma de pulmón humano Calu-3 se sometió a suspensión dinámica de cizallamiento ultra proporcionada por el dispositivo. Los resultados biológicos indican que este enfoque conserva crecimiento de células cancerosas
in vitro
, incluyendo la formación de esferoides, y sugieren la idoneidad del biorreactor propuesto para la investigación de las propiedades funcionales de células y para la expansión de los diferentes tipos de células.
Materiales y Métodos
biorreactor de rodaje dinámico
el diseño del dispositivo (figura 1A) fue impulsado por dos requisitos principales: (1) proporcionar un cultivo en suspensión dinámica con la mezcla apropiada; (2) para garantizar un ambiente de cultivo sintonizable-ultra bajo a moderado esfuerzo de corte, ajustable en función de las necesidades del cultivo mediante una simple modificación de las condiciones de funcionamiento. Se han logrado estos objetivos la combinación de las características geométricas particulares de la cámara de cultivo biorreactor con la recirculación continua del medio de cultivo asegurado por un circuito de recirculación de bucle cerrado, evitando el uso de impulsores y /o componentes de rotación. Esta combinación promueve la creación de vórtices de flotación dentro de la cámara de cultivo, que mantienen células /construcciones en suspensión dinámica, minimizando su sedimentación.
(A) Esquema sorteo del biorreactor mostrando sus componentes internos y su simetría axial (roja líneas). (B) Imagen del biorreactor. (C) Representación esquemática de la puesta a punto del biorreactor conectado al circuito de recirculación de bucle cerrado y situado dentro de la incubadora.
El biorreactor (Fig 1B, dimensiones externas = 95 mm x 70 mm x 70 mm) consta de: una base de acero inoxidable AISI 316L; Una cámara de cultivo de policarbonato para alojar los constructos células /(volumen de la cámara = 75 ml); una tapa de policarbonato. La curvatura y la forma de la pared interna de la cámara de cultivo fueron diseñados y optimizados para la generación de vórtices de flotación para la suspensión de muestras (como se detalla en el siguiente). Las células suspendidas /construcciones están confinadas dentro de la cámara de cultivo por medio de la presencia de (1) un acero inoxidable válvula de retención unidireccional AISI 316L (que evita el reflujo y garantiza una entrada de flujo simétrico), y (2) un cultivo de filtro de medio permeable ( Durapore
®, MerckMillipore, Alemania), que impide salidas accidentales de células. El biorreactor es parte de un circuito de bucle cerrado para la recirculación del medio de cultivo oxigenado (Fig 1C). Tal circuito de recirculación se compone de un contenedor de medios, tubo de silicona curado con peróxido, permeable al oxígeno (Masterflex L /S
®, Cole-Parmer, IL, EE.UU.) con acoplamientos de desconexión rápida, y una bomba peristáltica (Masterflex L /S
®, Cole-Parmer, IL, EE.UU.), para un volumen total de trabajo de aproximadamente 200 ml. Para garantizar el suministro adecuado de oxígeno dentro de la cámara de cultivo, el circuito de recirculación se dimensionó a través de un modelo de balance de masa de oxígeno analítica de conformidad con Orr et al. [36].
El principio de funcionamiento del biorreactor se basa en la recirculación continua del medio de cultivo dentro de la cámara de cultivo bajo el régimen de flujo laminar, que se obtiene a través de la modulación de la velocidad de flujo de circuito de recirculación, con el fin de producir de ultra bajo a moderado de estrés condiciones de suspensión de corte dinámico. En detalle, el medio fluye a través de la válvula de retención, impulsado por la bomba peristáltica contra el gradiente de presión estática, e impregna la cámara de cultivo. Sucesivamente, el medio pasa a través del filtro y fluye hacia fuera de la tapa, se mueve de vuelta al depósito en un proceso de circuito cerrado continuo. La formación de vórtices de flotación dentro de la cámara de cultivo permite que la suspensión dinámica de los cultivos de células /construcciones (S1 Película).
Los modelos computacionales
Un enfoque computacional multifísica apoyó el diseño y las fases de optimización de el dispositivo, lo que permite la identificación de (1) la geometría óptima de la cámara de cultivo, y (2) las condiciones de funcionamiento para el cultivo de células en suspensión dinámica bajo valores de esfuerzo de cizalla definidas. Se realizó un enorme número de simulaciones variando tanto de células /construcción de dimensiones (en términos de su diámetro) y las densidades de inoculación de células altamente diluidas, con el fin de estudiar la sensibilidad del flujo de fluido a estos parámetros de cultivo dentro del volumen de la cámara.
Técnicamente, aprovechando la simetría axial del dispositivo (Fig 1A), un conjunto de simulaciones numéricas axisimétricas dependientes del tiempo se llevó a cabo utilizando un volumen finito software comercial basado en la técnica de diseño (FLUENT, ANSYS Inc., PA, ESTADOS UNIDOS). El dominio fluido se discretizado utilizando el software de la ICEM CFD (ANSYS Inc., PA, EE.UU.). Una cardinalidad de malla igual a 6.5x10
3 se consideró células cuadriláteros. Al igual que en estudios previos [21,37], la presencia concomitante de medio de cultivo y las células se modeló usando la Multifase Modelo euleriano-euleriano, que permite que las mezclas de múltiples fases sin embargo, que interactúan separadas de un continuo que se describirá. Para cada fase de las ecuaciones que rigen el movimiento de las ecuaciones de Navier-Stokes, se resolvieron mediante la solución numérica. El medio de cultivo, considerado como la fase primaria, se asumió que era newtoniano con propiedades físicas de los medios de cultivo usados típicamente en aplicaciones de cultivo celular (viscosidad dinámica = 1x10
-3 Pa · s, densidad = 1,000 kg /m
3) [21]. Las células suspendidas, considerada como la fase secundaria sumergido, se modelaron como perlas esféricas no deformables. En el ejemplo explicativo reportado en este trabajo, una densidad igual a 1,070 kg /m
3 [38] y un diámetro medio igual a 20 micras (es decir, el diámetro medido de células de cáncer de Calu-3) fueron consideradas. La presencia del filtro se modela como un medio poroso que se caracteriza por un valor de Darcy resistencia hidráulica igual a 96x10
4 m
-2 para el medio de cultivo y ajuste de la máxima resistencia hidráulica aceptado por el solucionador (1x10
20 m
-2) para las células, teniendo el filtro de un tamaño medio de poro de 5 micras, por lo que es impermeable a ellos. la inoculación celular se supone que es uniforme en la región inferior de la cámara de cultivo. Este supuesto se tradujo en la prescripción marco computacional, como condición inicial, una fracción de volumen uniforme (VF) ocupada por las células (la fase secundaria) en la región inferior de recipiente (10 mL, en el ejemplo explicativo usando la línea de células Calu-3) . Las simulaciones se llevaron a cabo teniendo en cuenta siempre las culturas altamente diluidas de suspensión (números de Stokes considerablemente inferiores a 1, el valor de VF menor que 1%), para los que las variaciones en inicial VF no afectan notablemente el campo de flujo de la fase primaria. Como valor límite indicativo para la sedimentación, un valor VF mayor que 20% se consideró, que corresponde a aproximadamente un tercio del límite máximo de embalaje de 63%, es decir, el límite de embalaje para perlas esféricas no deformables lleno regularmente [21]. Las simulaciones se extendieron sobre los valores de caudal en el rango de 5-120 ml /min, con un tiempo de cultivo simulados igual a 60 min, lo que se consideró suficiente para describir completamente la dinámica del medio dentro de la cámara de cultivo. El esquema simple fase-acoplado se utiliza para el acoplamiento de presión-velocidad. La Segunda Upwind Orden y la formulación RÁPIDO se utilizaron para la discretización espacial de la impulso y el transporte fase secundaria, respectivamente. Detalles relacionados con el modelo ecuaciones y condiciones de contorno se presentan en la S1 de texto.
Además, con el fin de investigar la influencia de la dinámica de mezcla que se establece dentro de la cámara de cultivo en la evolución de las cantidades físicas y ambientales, el transporte de una cantidad escalar dentro de la cámara de cultivo fue modelado. En detalle, el transporte de oxígeno disuelto en el medio que fluye dentro de la cámara de cultivo se simuló mediante la resolución de la ecuación de transporte de advección /difusión, junto con las ecuaciones de Navier-Stokes. Un medio de cultivo completamente anóxica en el interior de la cámara de cultivo fue considerado como condición inicial (peor caso). Este modelo computacional puede generalizarse a todas las especies disueltas caracterizadas por los números de Péclet similares (es decir, la relación entre las velocidades de transporte de advección y de difusión). se informan detalles acerca de los supuestos del modelo y las ecuaciones en S2 texto.
in vitro
cultivo celular
El rendimiento del biorreactor se puso a prueba en el marco explicativo cultura dinámica tensión de corte ultrabajo (que se establece un caudal de 5 ml /min), como se identifica a partir del análogo in silico del experimento in vitro (ver resultados). La línea de células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de células Calu-3 (American Type Culture Collection, ATCC, VA, EE.UU.) fue seleccionado y los resultados de la cultura dinámica se compara con un control cultivo en suspensión estática. En detalle, las células se cultivaron en medio completo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich, MO, EE.UU.) añadido con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina /estreptomicina (P /S) y 1% para no esencial Amino Acids (NEAA, Sigma Aldrich, MO, EE.UU.), y mantenido bajo condiciones estándar de cultivo celular a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua de 5% de CO
2 en el aire. Después de la expansión en matraces de cultivo de células, 9x10
6 Calu-3 células (1.92x10
5 células /ml) se inocularon dentro de la cámara de cultivo del biorreactor y se cultivaron durante 5 días en suspensión dinámica con medio de crecimiento completo. El biorreactor se hizo funcionar a una velocidad de flujo de 5 ml /min. En paralelo, las células Calu-3 se sembraron a la misma densidad en frascos de cultivo de baja unión (Corning Inc., Nueva York, EE.UU.) utilizados como control, lo que representa un modelo de cultivo en suspensión estática. Después de 5 días, las células cultivadas en suspensión dinámicas y estáticas fueron rescatados del biorreactor y del matraz de cultivo de fijación baja, respectivamente, y se resuspendieron en medio de crecimiento fresco para su posterior análisis. Tres cultivos en suspensión estáticos y dinámicos independientes se llevaron a cabo.
Las evaluaciones de los
in vitro
cultivo celular
Calu-3 células recolectadas del biorreactor y del matraz de cultivo bajo apego y re-suspendido en medio de cultivo fresco se investigaron por microscopio invertido (Olympus CK40, Japón). Se recogieron microfotografías y se analizaron mediante un software de análisis de imágenes (Image Pro-plus 4,0, Media Cybernetics, EE.UU.) en orden (1) para calcular el número de células individuales Calu-3 y el número de Calu-3 células formadoras de los esferoides, y (2) para determinar los tamaños de esferoides.
Además, se procesaron Calu-3 células de cultivo en suspensión dinámica y estática para el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y para inmunocitoquímica. Para el análisis TEM, Calu-3 células se fijaron en solución de Karnovsky (4% de formaldehído, 5% de glutaraldehído). Las muestras se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% y se deshidrataron mediante el aumento de concentración de alcohol. A continuación, las muestras se lavaron con óxido de propileno y se embebieron en resina epoxi. Las secciones de 0,5 m de espesor fueron teñidos con azul de metileno y safranina para seleccionar morfológicamente el campo de interés. Posteriormente, se recogieron secciones ultrafinas en una rejilla de cobre de malla 300 y, después de la tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo, se examinaron cualitativamente bajo TEM (Philips EM 208S, Países Bajos). Para evaluar la fracción de células en el ciclo celular activo, la presencia de ADN reversible doble filamento se rompe, y la muerte celular por apoptosis, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y procesadas por citocentrifugación en un portaobjetos de vidrio para obtener una densidad de 10
5 células por punto. manchas de células se tiñeron con anticuerpos anti-Ki67 (Ki67, monoclonal de ratón, Dako, Italia) y anti-histona H2AX gamma (γH2AX, policlonal de conejo, Bethyl Laboratories, TX, EE.UU.) y se revelaron por DAB (3,3 '-Diaminobencidina) peroxidasa (HRP) de reacción Kit sustrato (DAKO, Italia). La evaluación cuantitativa de la fracción de células Ki67 y γH2AX positivos se llevó a cabo mediante el cálculo del número de núcleos positivos sobre un total de 900-2000 núcleos contados en cada muestra analizada. La muerte celular por apoptosis a nivel de una sola célula se investigó utilizando el In Situ Cell Death Kit de detección, fluoresceína de ensayo (solución enzimática TdT, etiqueta de la solución de fluoresceína-dUTP, Roche). positividad fluorescencia nuclear verde se midió utilizando microscopio Olympus BX60. Los núcleos se reconoce por la fluorescencia azul de 4 ', 6-diamidina-2-phenyndole (DAPI, Sigma, Italia). La fracción de células muertas se evaluó contando el número de núcleos apoptóticos durante un total de cerca de 1.000 células. Los datos se analizaron mediante el test de ANOVA de una sola vía. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas cuando p & lt; 0,05. Con el fin de investigar la posible adhesión accidental de células /esferoides en el filtro después de 5 días de cultivo dinámico dentro del biorreactor, el filtro se fijó con paraformaldehído al 4% y se incubaron con DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente, y sucesivamente investigado por microscopio de fluorescencia para evaluar la presencia de núcleos en su superficie. Por último, con el fin de evaluar la presencia de adheridos 3-Calu células y sedimentación en la zona inferior de la cámara de cultivo, después de células rescatar a la pared interna de la cámara de cultivo fue raspado por un rascador de células y se lava con tampón fosfato salino (PBS) . Por consiguiente, el PBS se recogió en una placa de Petri y se observa por microscopio invertido para detectar la presencia de Calu-3 células.
Resultados
dinámica de flujo dentro de la cámara de cultivo biorreactor
multifísicos simulaciones numéricas permiten caracterizar el campo de flujo dentro de la cámara de cultivo del biorreactor. Fig 2 muestra representaciones esquemáticas de las estructuras de flujo medio típicos establecen dentro de la cámara de cultivo, lo que resulta de la interacción mutua entre el medio (fase principal) y las células /los constructos (fase dispersa), dependiendo de la velocidad de flujo impuesta. En detalle, en el caso de valores de velocidad de flujo inferiores a 20 ml /min (Fig 2A y 2A1), la transmisión en medio en la cámara de cultivo a través de la válvula no tiene suficiente energía para interactuar marcadamente con la pared lateral de la cámara de cultivo. El equilibrio entre las fuerzas hidrodinámicas y gravitacionales conduce a la formación de un gran vórtice boyante dinámica situada lejos de la pared de la cámara (Fig 2A1). Este vórtice boyante está rodeado de estructuras de torbellino más pequeñas situadas más cerca de la pared, que aseguran la suspensión de las células cultivadas y aumentan la mezcla y el transporte (Fig 2A1). Como ejemplo, la figura 3 muestra la evolución temporal de la VF ocupado por células suspendidas dentro de la cámara de cultivo, obtiene la simulación de la presencia de 9x10
6 células inoculadas (inicial VF = 0,48%) y se establece un valor de velocidad de flujo de 5 ml /min (ultra bajo condición de tensión de cizallamiento, de manera similar a la prueba experimental en vitro). Se puede observar que las células cultivadas se mantienen distribuidas uniformemente sobre todo en la región inferior de la cámara de cultivo. En detalle, después de un transitorio de aproximadamente 5 min, el 95,3% de las células inoculadas se suspenden en un valor medio VF de aproximadamente 0,33%, que es próximo al valor de VF inicial (0,48%), con el pico de la función de densidad de probabilidad (PDF) valor igual a 2,5, lo que corresponde a los valores de FV entre 0 y 0,5% (Fig 4A). En la parte inferior de la cámara de cultivo, un pequeño volumen de aproximadamente 194 l se caracteriza por un valor VF alrededor de 6%, lo que implica dinámicamente sólo el 2% de las células inoculadas (Fig 3). Este valor de embalaje es más de tres veces menor que el valor umbral de la sedimentación que se estableció (20%) y aproximadamente diez veces más bajos que el límite máximo de embalaje de 63%. En particular, cuando se adopta una velocidad de flujo inferior a 20 ml /min, la distribución de los valores de tensión de cizallamiento experimentadas por las células dentro de la cámara de cultivo revela que los más altos niveles de estrés de cizallamiento son inferiores a 1 mPa (Fig 4B), con media y la mediana valores próximos a 1x10
-2 mPa (la denominada condición de estrés de cizallamiento ultra).
flujo de visualización campo de la interacción mutua entre el medio (fase primaria) y las células /los constructos (fase dispersa) dentro de la cámara de cultivo de ultra bajo (a y A1) y de baja a moderada (B y B1) condiciones de estrés de cizalla. campo de flujo se representa con las dos líneas lineales integral de convolución (A y B), y una línea de corriente representación clásica (A1 y B1). Las flechas amarillas indican la entrada de flujo y la salida. Las flechas azules indican los vórtices de flotación primaria. Las flechas rojas indican los vórtices secundarios.
Diagramas de contorno de la evolución temporal de la VF ocupado por las células en suspensión dentro de la cámara de cultivo de biorreactor de 0 a 60 min de tiempo simulado, con un caudal de impuesto 5 ml /min (ultra bajo condición de tensión de cizallamiento, de manera similar a la prueba experimental en vitro) y 9x10
6 células inoculadas (inicial VF = 0,48%). Después de un transitorio de aproximadamente 5 min, el 95,3% de las células inoculadas se suspenden en un valor medio VF de aproximadamente 0,33%, muy cerca del valor inicial VF. En la parte inferior de la cámara de cultivo, un pequeño volumen de aproximadamente 194 l se caracteriza por un valor VF alrededor de 6%, más de tres veces menor que el valor umbral conjunto de sedimentación (20%), que implica dinámicamente sólo el 2% de las células inoculadas.
funciones de densidad de probabilidad (pdf) de los valores experimentados por la fase celular dentro de la cámara de cultivo biorreactor después de 60 minutos de células FV (A) y esfuerzos de corte (B), con un flujo de impuesto velocidad de 5 ml /min y 9x10
6 células inoculadas
el aumento de la velocidad de flujo más allá de 20 ml /min favorece la aparición del efecto Coanda [39] dentro de la cámara de cultivo del biorreactor:. el chorro entrar en la cámara de cultivo es atraído por la pared cercana y, debido a la curvatura de la pared peculiar, una región de separación se produce lejos de la pared inferior de la cámara (Fig 2B y 2B1). Como resultado, un vórtice boyante grande en sentido horario, lo que contrarresta la fuerza de la gravedad y por lo tanto mantiene células /construcciones en suspensión, se genera (Fig 2B1). Cerca de la pared exterior, un vórtice más pequeño desarrolla, que puede jugar el papel beneficioso de mejorar la mezcla y la suspensión de las construcciones flotantes (Figura 2B1). La adopción de un intervalo tal velocidad de flujo (30 a 120 ml /min), sesgadas se obtuvieron las distribuciones de esfuerzos de cizallamiento a la derecha, con valores medios de 2 a alrededor de 7 MPa, con valores de pico de estrés de cizallamiento dentro de la cámara de cultivo inferior a 50 mPa (de baja a condición de moderado esfuerzo de corte, ver detalles en el texto S3).
en cuanto al transporte de oxígeno disuelto dentro de la cámara de cultivo imponer una condición inicial completamente anóxica para el medio, la simulación numérica muestra claramente que dentro de 840 s ( 14 minutos) la presión parcial del oxígeno disuelto se repone en más de la 90% del volumen de la cámara de cultivo (S2 Película, S2 texto). Los resultados obtenidos se pueden generalizar al transporte de otras especies disueltas en el medio de cultivo, debido a que su transporte se caracteriza por un número de Péclet dos o tres órdenes de magnitud superior a la unidad, lo que confirma que las estructuras de fluidos que se establecen dentro de la cámara de promover el transporte de oxígeno disuelto y nutrientes a través de la mezcla, por lo tanto la homogeneización de su concentración.
in vitro
resultado cultura y
Después de 5 días de cultivo en suspensión, las células fueron rescatados del matraz baja cultura de fijación (suspensión estática ) y de la cámara de cultivo del biorreactor (suspensión dinámica). En primer lugar, fueron morfológicamente analizadas: observaron por microscopía de contraste de fase, Calu-3 cultiva en suspensión mostrar células individuales estáticas o conglomerados muy pequeños (figura 5A), mientras que las células cultivadas en el biorreactor bajo suspensión dinámica muestran claramente la formación de esferoides (Fig 5B ). En particular, la proporción entre 3 Calu-células que forman los esferoides y células individuales Calu-3 es 59,7 para las células Calu-3 cosechadas del matraz de cultivo de unión baja y 76,0 para las células Calu-3 cultivadas en el biorreactor.
Después de 5 días de cultivo en suspensión, (a) Calu-3 células cultivadas en suspensión muestran estática células individuales o muy pequeños racimos, (B) Calu-3 células cultivadas en suspensión dinámica muestran la formación de esferoides. Escala de barras de 200 micras.
Por otra parte, el análisis ultraestructural por TEM permite observar que Calu-3 de la suspensión estática están parcialmente conectados por uniones de adherencia débiles y pequeños (Fig 6A y 6A1), con alteraciones morfológicas ( Fig S1). Por el contrario, los esferoides cosechadas de la cámara de cultivo biorreactor son 2,4 veces (p & lt; 0,001) más grande (superficie media = 23699 ± 5645 m
2) que los grupos rescatados del matraz baja cultura de unión (superficie media = 9787 ± 2202 micras
2), y se componen de células que se caracterizan por las características morfológicas típicas de Calu-3, tales como nucleolos prominentes y membranas microvellosidades (figura 6B), con uniones de adherencia bien desarrollados (Fig 6B1).
las imágenes TEM muestran (a) un pequeño grupo (3 células) de Calu-3 células cultivadas en suspensión estática, y (B) un esferoide más grande (9 células) de Calu-3 células cultivadas dentro del biorreactor, se recogieron tanto después de 5 días de cultivo en suspensión. nucleolos prominentes (N: núcleos), estructuras citoplásmicas y microvellosidades orientadas longitudinalmente y transversalmente son rasgos característicos de la línea celular de NSCLC Calu-3. vistas de gran aumento de las áreas incluidas en rectángulos negros en los paneles A y B muestran, respectivamente, (A1) de una sola unión adherencia pequeña (punta de flecha) entre las células cultivadas en suspensión estática, y (B1) varios adherencia uniones bien desarrollados (puntas de flecha) desarrollaron por Calu-3 cultivadas en el biorreactor. Las barras de escala: A y B = 5 micras; A1 y B1 = 1 m.
Estas observaciones son compatibles con la evaluación de Ki67 inmunotinción, que indica que la fracción de ciclismo Calu-3 células es significativamente mayor (aumento de 1,58 veces) cuando se cultivan en dinámica en vez de en condiciones de suspensión estáticos (figura 7A). Además, a partir de la cuantificación del ADN doble filamento se rompe, es posible observar una tendencia a la baja (reducción de 1,5 veces, incluso si no es estadísticamente significativa) en la fracción de γH2AX
pos Calu-3 células cultivadas en el biorreactor en comparación a las células cultivadas en suspensión estática (Fig 7B). Esto se confirma por el ensayo de muerte celular por apoptosis, de hecho la fracción de células apoptóticas Calu-3 cosechadas del control de la suspensión estática (46,5 ± 4,5%) era 16,9 veces mayor que las células recogidas del biorreactor (2,7 ± 0,2%), ( p & lt; 0,05)
(A) gráfico de barras de la medición de las células Ki67 positivas, mostrando la fracción de ciclismo Calu-3 células después de cultivo en suspensión estática y dinámica (*:. p & lt; 0,05 vs suspensión estática).