Extracto
El desarrollo de una terapia eficaz contra el cáncer ha sido un tema de gran interés desde hace varias décadas. La administración combinada de ciertas moléculas y células del sistema inmune se ha demostrado ser una forma eficaz de la terapia anti-cáncer. A continuación, se examinaron los efectos de la administración de un péptido estimulante inmunológico (WKYMVm), 5-fluoro-uracilo (5-FU), y células dendríticas maduras (PMD) contra modelo animal de cáncer heterotópico. La administración de la combinación triple reduce considerablemente el volumen del tumor en modelos animales de cáncer heterotópico inoculado-CT-26. La actividad anti-tumor inducido se correlaciona bien con la expresión de FAS, la activación de caspasa-3, y la apoptosis de células de cáncer. El tratamiento de combinación triple causó el reclutamiento de los linfocitos T CD8 y células asesinas naturales (NK) en el tumor. La producción de dos citoquinas, IFN-γ e IL-12, fueron fuertemente estimulados por la administración de la combinación triple. El agotamiento de los linfocitos T CD8 o células NK mediante la administración de anti-CD8 o anticuerpo anti-asialoGM1 inhibió la actividad y la producción de citoquinas anti-tumor de la combinación triple. La combinación triple de inhibió fuertemente la metástasis de células de cáncer de colon en un modelo animal de cáncer heterotópica, así como en un modelo animal de cáncer metastásico, y aumentó la tasa de supervivencia del modelo de ratones. La transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 y células NK aumentó aún más la tasa de supervivencia. Tomados en conjunto, nos sugieren que el uso de la terapia de combinación triple del WKYMVm, 5-FU, y mDCs puede tener implicaciones en el tratamiento de tumores sólidos y metástasis
Visto:. Kim SD, Lee HY, Calce JW, Kim HJ , Baek SH, Zabel BA, et al. (2012) Combinación A WKYMVm que contienen provoca una potente actividad anti-tumoral en el cáncer heterotópico modelo animal. PLoS ONE 7 (1): e30522. doi: 10.1371 /journal.pone.0030522
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 12 Agosto, 2011; Aceptado: 18 de diciembre de 2011; Publicado: 25 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Nacional de Investigación & amp; Programa de Desarrollo para el Control del Cáncer, Ministerio de Sanidad, Bienestar Social y Asuntos de la familia, República de Corea (0920220) (Y-SB); Fundación Nacional de Investigación de Corea concederán a las financiado por el gobierno de Corea (2009 0093198) (Y-SB); y los Institutos Nacionales de Salud de subvención AI-079320 (BZ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo de la terapia contra el cáncer ha sido un problema importante por varias décadas [1], [2]. El tratamiento con agentes anti-cáncer es uno de los modos más ampliamente utilizada de la terapia anti-tumor. Varios agentes contra el cáncer se han desarrollado, incluyendo 5-fluoro-uracilo (5-FU) [3]. Mecánicamente, se ha informado de agentes contra el cáncer para causar apoptosis de las células cancerosas, lo que induce el inicio de las respuestas inmunes contra el cáncer [4]. En el sistema inmune del huésped, las células dendríticas (DC) parecen desempeñar un papel clave en la actividad anti-tumor. DC reconocen y la captación de antígenos tumorales, y presentan los antígenos procesados de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad [5], [6], [7]. Por lo tanto, las DC pueden estimular los linfocitos T, lo que resulta en la actividad citotóxica de linfocitos T. DCs también secretan varias citocinas que son importantes en la actividad anti-tumor eficiente [7]
.
WKYMVm se identificó como un péptido sintético estimulante inmunológico de una biblioteca de péptidos cribado [8], [9]. WKYMVm estimula las células leucocitarias tales como monocitos, neutrófilos, células asesinas naturales (NK), y los países en desarrollo [9], [10], [11], [12]. Debido a los monocitos y neutrófilos estimulación, la migración quimiotáctica, la producción de anión superóxido y la producción de determinados mediadores inflamatorios tales como leucotrienos B
4 es inducida por WKYMVm [9], [13], [14]. la estimulación de células NK con resultados WKYMVm en la actividad citolítica y la migración quimiotáctica [11]. El péptido estimulado la migración quimiotáctica de las DC [12]. Tres miembros de la familia de receptores de péptido formilo (FPR) se han informado de que los receptores de la superficie celular cognitivos para WKYMVm en los seres humanos [15], [16]. Ratón FPR También se ha informado de actuar como un receptor de WKYMVm [17]. Aunque WKYMVm ha informado de estimular los leucocitos que juegan papeles importantes en contra antígenos del cáncer, se sabe poco sobre el papel de WKYMVm de la actividad anti-cáncer.
La administración combinada de ciertas moléculas puede inducir la actividad efectiva contra el cáncer. Aunque se ha informado de diversos agentes anti-cáncer o terapias contra el cáncer, el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer que sean eficaces y específico con baja toxicidad sigue siendo necesaria. En este estudio se investigó la actividad terapéutica de WKYMVm cuando se administró con un agente anti-cáncer (5-FU) y un adyuvante de vacuna natural (madurar DCS, mDCs). El mecanismo de acción de la terapia de combinación triple se caracterizó también.
Resultados
La administración combinada de WKYMVm, 5-FU, y mDCs hace que la actividad antitumoral en cáncer de heterotópico modelo animal
La actividad anti-tumor putativo de WKYMVm, 5-FU, o mDCs se examinó. WKYMVm, 5-FU, o mDCs fueron administrados primero por separado. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 1A, WKYMVm (100 g /cabeza) se inyectó cuatro veces a intervalos de 12 horas. Una sola administración causó una ligera disminución en el volumen del tumor (Fig. 1B). Cuando los agentes se ensayaron en pares (WKYMVm + 5-FU; WKYMVm + PMDs; mDCs + 5-FU) en contra de un modelo animal, la actividad anti-tumor se ha mejorado (Fig 1B.). La presencia de 5-FU apareció para potenciar aún más la actividad anti-tumor (Fig. 1B, 5-FU + WKYMVm y 5-FU + mDCs). Por otra parte, cuando la combinación triple (WKYMVm + 5-FU + mDCs) se administró a el modelo animal de cáncer heterotópica, se observó la actividad anti-tumor más potente (Fig. 1B).
(A) Protocolo para el estudio de la actividad anti-tumor de WKYMVm, 5-FU, y mDCs. (B) La combinación triple de WKYMVm, 5-FU, y mDCs tiene la actividad anti-tumor más potente. Células CT-26 (5 × 10
5 células en 100 l de PBS) se inyectaron s.c. en el flanco derecho de ratones Balb /c (n = 8) en el día -3. Los ratones se trataron según el protocolo en (A). El volumen del tumor se midió y los datos se muestran como la media ± SEM (n = 8).
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La administración combinada de WKYMVm, 5-FU, y mDCs provoca la apoptosis tumoral
Desde apoptosis tumor está estrechamente relacionada con la actividad anti-tumor, se midió el efecto de cada administración en la apoptosis tumoral. Como se muestra en la Fig. 2, la administración única de WKYMVm, 5-FU, o mDCs inducida por los bajos niveles de muerte de células tumorales, y combinaciones de dobles mostró un mayor aumento en la muerte celular, con la combinación triple que resulta en aumento de forma espectacular la muerte de células tumorales en el modelo animal de cáncer heterotópico (Fig . 2). Las células TUNEL positivas coincidieron con la expresión de FAS, que indica que la muerte de células tumorales observada se debe a la apoptosis (Fig. 2). Actividad de la caspasa-3 en el tratamiento se determinó mediante tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpo anti-fosfo-caspasa-3. En consonancia con las de tinción TUNEL y la expresión de Fas resultados, la activación de caspasa-3 aumentó a medida que el número de agentes combinados aumentó, con la combinación triple WKYMVm + 5-FU + mDCs inducir un aumento dramático en la caspasa-3 actividad (Fig. 2). Los niveles de apoptosis de células tumorales y la actividad de caspasa-3 se correlacionan bien con los datos de volumen tumoral en la fig. 1B.
ratones Balb /c fueron inoculados con células CT-26 y se trataron con WKYMVm, 5-FU, y mDCs acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. Los ratones fueron sacrificados 42 días después de la inoculación del tumor y los tumores fueron extirpados quirúrgicamente, y se procesaron para tinción con hematoxilina y eosina, inmunohistoquímica para la tinción de FAS, caspasa-3 tinción, y la tinción TUNEL, como se describe en Materiales y Métodos. Los datos presentados son representativos de tres experimentos independientes.
Administración de la triple combinación hace que el reclutamiento de células T CD8 y células NK en el tumor
Para iniciar una antitumoral inmune respuesta, las células leucocitarias necesitan ser reclutados en el área del tumor [18]. Puesto que la administración de la combinación triple (WKYMVm + 5-FU + mDCs) provocó la actividad anti-tumor potente contra el modelo animal de cáncer heterotópica, hemos examinado qué tipos de células son reclutados en el tumor por inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11b, o anticuerpo anti-DX5. La administración de la combinación triple causada reclutamiento dramática de los linfocitos T CD8 y células NK en el área del tumor, así como una ligera reclutamiento de linfocitos T CD4 (Fig. 3A).
Se inocularon ratones Balb /c (A) con células CT-26 y tratado con WKYMVm, 5-FU, y mDCs de acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. las células T CD8, células T CD4 o células NK se agotaron por vía intraperitoneal inyección de 100 g de anti-CD8 (B), anti-CD4 (C) o anti-asialoGM1 anticuerpo (D) en ratones Balb /c. Los ratones fueron sacrificados 42 días después de la inoculación del tumor y los tumores fueron extirpados quirúrgicamente, y se procesaron para inmunotinción usando anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-asialoGM1, como se describe en Materiales y Métodos. CD3
+ CD8
+ células, CD3
+ CD4
+ células, y CD11b
+ DX5
+ células indican los linfocitos T CD8, linfocitos T CD4 y células NK, respectivamente . Los datos presentados son representativos de tres experimentos independientes.
La administración de anticuerpo monoclonal anti-CD8 antes de la combinación triple produjo inhibición dramática de CD8 T reclutamiento de linfocitos en el área del tumor, sin afectar el reclutamiento de células NK ( la Fig. 3B). Cuando el anticuerpo anti-asialoGM1 se administró antes de la inyección de la combinación triple, el reclutamiento de células NK en el área del tumor estaba fuertemente bloqueado, pero CD8 T reclutamiento de linfocitos no se vio afectada (Fig. 3D). la administración del anticuerpo Anti-CD4 antes de la inyección de la combinación triple no afectó CD8 de linfocitos T o el reclutamiento de células NK (Fig. 3C).
células CD8 T y células NK juegan un papel importante en la actividad anti-tumor de la combinación triple terapia
Para la activación eficiente de la actividad anti-cáncer en un animal experimental, varios tipos de leucocitos se comunican entre sí y actuar concertadamente. Se examinó la contribución relativa de los tipos de leucocitos individuales sobre la actividad anti-tumor inducida por la terapia de combinación triple, mediante la administración de anticuerpos contra cada uno de leucocitos. Cuando el anticuerpo anti-CD8 se administra al modelo animal de cáncer heterotópica, la actividad anti-tumor de la combinación triple era casi completamente inhibida (Fig. 4A). La administración de anticuerpo anti-asialoGM1 provocó la inhibición parcial de la actividad anti-tumor de la terapia de combinación triple (Fig. 4B). Sin embargo, la administración del anticuerpo anti-CD4 no afectó a la actividad anti-tumor de la triple combinación (datos no mostrados). Estos resultados indican que las células T CD8 y células NK juegan un papel importante en la actividad antitumoral de la triple combinación de WKYMVm, 5-FU, y mDCs.
ratones Balb /c fueron inoculados con células CT-26 y se trató con WKYMVm, 5-FU, y mDCs acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. las células T CD8 o células NK se agotaron por vía intraperitoneal inyección de 100 g de anti-CD8 (A) o anti-asialoGM1 anticuerpo (B) en ratones Balb /c. El volumen del tumor se midió y los datos se muestran como la media ± SEM (n = 8).
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Administración de la WKYMVm, 5-FU, y mDCs combinación triple provoca un cambio del perfil de citoquinas en un modelo animal de cáncer heterotópico
Hemos probado si la administración de WKYMVm, 5-FU, y mDCs en varias combinaciones provoca cambios en el perfil de citoquinas compararon al lisado tumor control. Como se muestra en la Fig. 5A, la administración de la combinación triple causó cambios drásticos en los niveles de IFN-γ y IL-12 producida a partir de lisados tumorales en el modelo animal de cáncer heterotópico. La producción de IFN-γ en el tumor se incrementó gradualmente a medida que el número de agentes combinados aumentado, con combinaciones dobles que muestra en general una mayor producción de IFN-γ de administración única, y la combinación triple que muestra el nivel más alto de producción de IFN-γ (Fig. 5A ). Cuando se midieron IL-12 niveles, se encontró que la administración única de cada agente no indujo la producción de IL-12, y entre las combinaciones dobles, sólo la combinación de mDCs WKYMVm + aumento de la producción de IL-12 en el modelo animal (Fig. 5B). La administración de la combinación triple (+ WKYMVm mDCs + 5-FU) incrementado dramáticamente la producción de IL-12 a un nivel que fue dos veces más alta que la WKYMVm + mDCs combinación doble (Fig. 5B).
Balb /ratones c fueron inoculados con células CT-26 y se trataron con WKYMVm, 5-FU, y mDCs acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. (A, B) IFN-γ y IL-12 niveles se midieron a partir de lisado de tejido tumoral. Se midieron los niveles (C-F) IFN-gamma y IL-12 en la sangre periférica en el tratamiento de combinación triple. 100 g de anti-CD8 (C, D) o anti-asialoGM1 anticuerpo (E, F) se inyectaron i.p. a ratones Balb /c. Los datos se muestran como la media ± SEM (n = 8).
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. & Lt; 0,05, significativamente diferente del control tratado con mDCs WKYMVm + 5-FU +
También se observó Administración de la combinación triple para mejorar la producción de IFN-γ e IL-12 en la sangre periférica (Fig. 5C-5F). Para examinar el papel de los linfocitos T CD8 y células NK en la producción de estas dos citoquinas después de la administración de combinación triple, anti-CD8 o anticuerpo anti-asialoGM1 se administró antes del tratamiento de combinación triple. La administración de anti-CD8 o anti-asialoGM1 anticuerpo bloqueado combinación triple inducida por IFN-γ y la producción de IL-12 en la sangre periférica (Fig. 5C-5F). Estos resultados indican que los linfocitos T CD8 y células NK juegan un papel en IFN-γ y la producción de IL-12 inducida por el tratamiento de combinación triple. Actividad
Anti-metástasis de administración combinada de WKYMVm, 5-FU, y mDCs
en el desarrollo de un agente terapéutico anti-tumor eficaz, es importante desarrollar agentes que inhiben la recurrencia del tumor [19]. La capacidad metastásica de las células cancerosas a migrar desde su origen a otros tejidos diana es una de las razones principales que hacen que sea difícil el desarrollo de un agente anti-cáncer eficaz [20], [21]. En nuestro modelo animal de cáncer heterotópica, se observó que la inoculación subcutánea de células de cáncer de colon CT-26 causó la metástasis espontánea de las células en el tejido pulmonar (Fig. 6A). La administración de la combinación mDCs + 5-FU Triple WKYMVm + bloqueada casi por completo la metástasis de células de cáncer de colon a los pulmones (Fig. 6A). Esta actividad anti-metástasis combinación inducida triple era bloqueada por la administración de anti-CD8 o anti-asialoGM1 anticuerpo (Fig. 6A), lo que indica que la actividad anti-metástasis está mediada por CD8 de linfocitos T y actividad de las células NK.
ratones Balb /c (a) fueron inoculados con células CT-26 y se trataron con WKYMVm, 5-FU, y mDCs acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. células CD8 T o células NK se agotaron mediante la inyección de 100 g de anti-CD8 o anti-asialoGM1 i.p. anticuerpo en ratones Balb /c. En el día 42, los ratones fueron sacrificados y se observaron nódulos tumorales en la superficie de los pulmones. (B) células CT-26 (2 × 10
5 células en 100 l de PBS) se inyectaron en la vena de la cola de ratones Balb /c. Después de 14 días, los ratones fueron sacrificados y la tinción de hematoxilina y eosina se realizó a través de los pulmones aislados. Las imágenes que se muestran son representativos de ocho experimentos independientes.
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También utilizó un modelo animal metástasis artificial para probar el efecto de diferentes combinaciones de WKYMVm, 5-FU, y mDCs contra la metástasis. La inyección de células CT-26 de cáncer de colon en la vena de la cola hace que la metástasis en los pulmones. Los pulmones se aislaron 14 días después de la inyección de células CT-26. metástasis de pulmón dramático se observó con los ratones tratados con vehículo (Fig. 6B). combinaciones simples o dobles de WKYMVm, mDCs, y 5-FU inhibió la metástasis tumoral en diversos grados para reducir la metástasis de pulmón, y se observó el efecto más potente con la triple combinación (Fig. 6B).
administración de Combinado WKYMVm, 5-FU, y mDCs mejora las tasas de supervivencia en un modelo animal de cáncer heterotópico
se examinó la tasa de supervivencia del modelo animal de cáncer heterotópico tras el tratamiento combinado. Hemos probado las combinaciones que mostraron una actividad relativamente alta anti-tumor en nuestros ensayos anteriores anteriores; 5-FU solo, 5-FU + WKYMVm, 5-FU + mDCs, y 5-FU + + mDCs WKYMVm. La administración de 5-FU solo, mDCs 5-FU +, o 5-FU + WKYMVm sólo aumentó ligeramente la tasa de supervivencia, pero la administración de la triple combinación de 5-FU + + mDCs WKYMVm mejorado fuertemente la tasa de supervivencia (Fig. 7A). Todos los ratones del grupo de control se murieron después de 65 días, mientras que el 80% del grupo de combinación triple-administrados seguía vivo a los 80 días (Fig. 7A).
(A) Tasa de supervivencia de los ratones tratados con combinaciones de WKYMVm, 5-FU, y mDCs. los ratones Balb /c fueron inoculados con células CT-26 (5 × 10
5 células /cabeza) y tratados con WKYMVm, 5-FU, y mDCs de acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A. (B) La transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 o células NK puede aumentar la tasa de supervivencia de los ratones con cáncer heterotópico modelos animales tratados con la combinación triples. los ratones Balb /c fueron inoculados con células CT-26 (1 × 10
6 células /cabeza) y tratados con WKYMVm, 5-FU, y mDCs de acuerdo con el protocolo en la Fig. 1A, y aisladas linfocitos T CD8 (1 × 10
6 células /cabeza) o células NK (1 × 10
6 células /cabeza) fueron transferidos en la vena de la cola. La tasa de supervivencia se controló durante 80 días.
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Para probar si la transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 y células NK podría mejorar la triple supervivencia combinación inducida de los ratones de modelo animal de cáncer heterotópico, se inocularon un aumento del número de células de cáncer de colon (1 × 10
6 células /cabeza) en ratones. En este modelo, el efecto de la combinación triple se redujo, la reducción de la tasa de supervivencia a 40% en 80 días (Fig. 7B). En estas condiciones se llevó a cabo la transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 o células NK. La transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 o células NK aumentó sólo ligeramente la supervivencia puntuación causada por la administración de combinación triple, mientras que la transferencia adoptiva combinado de los linfocitos T CD8 y células NK aumentó drásticamente la tasa de supervivencia (Fig. 7B). Estos resultados indican que tanto los linfocitos T CD8 y células NK pueden mejorar la tasa de supervivencia inducida por la combinación triple en el modelo animal de cáncer heterotópico.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que la administración de la combinación triple del péptido sintético WKYMVm, mDCs, y 5-FU dota potente inmunidad anti-cáncer. Individuales (WKYMVm, mDCs, o 5-FU) o dobles (PMD WKYMVm +, 5-FU + WKYMVm o 5-FU + PMD) el tratamiento de ratones disminuyeron ligeramente el volumen del tumor, pero la administración de la combinación triple drásticamente inhibe el crecimiento tumoral (Fig . 1). Los resultados de medición de volumen de tumor se correlacionaron bien con la expresión de FAS, la actividad de la caspasa-3, y resultados de la tinción de TUNEL (Figs. 1 y 2). De acuerdo con informes anteriores, IFN-γ se sabe que inducen la expresión de receptores de muerte celular tal como FAS [22], [23]. En este estudio, hemos demostrado que la administración de diferentes combinaciones de WKYMVm, 5-FU, o mDCs puede inducir la expresión de IFN-γ, con la triple combinación que causa la mayoría reforzada de la producción de IFN-γ (Fig. 5A). El nivel de expresión de IFN-γ se correlaciona bien con la actividad anti-tumor de cada combinación, lo que sugiere que el IFN-γ inducida por la administración de cada agente o combinación es críticamente implicado en la actividad anti-tumor en el modelo animal.
IL-12 puede primo o estimular a las células T CD4, células T CD8 y células NK [24], [25], [26]. En este estudio, sólo ciertas combinaciones, a saber WKYMVm + mDCs y la combinación triple podrían inducir IL-12 expresión en el modelo animal de cáncer heterotópico (Fig. 5B). Una sola administración de WKYMVm o mDCs no indujo la producción de IL-12 (Fig. 5B). Esto sugiere que la estimulación de mDCs con WKYMVm es responsable de la inducción eficaz de IL-12 en el modelo animal. Desde WKYMVm es un ligando para la familia FPR, parece probable que la activación de la familia FPR induce IL-12 expresión de mDCs. En el experimento de la tasa de supervivencia, triples administración de mDCs WKYMVm + 5-FU + inducida por un fuerte aumento de la tasa de supervivencia en un modelo animal de cáncer heterotópica, pero 5-FU tratamiento + mDCs tenido un efecto mucho menor (Fig. 7). Como la producción de IL-12 está fuertemente inducida por la combinación triple, pero no por 5-FU + mDCs (Fig. 5B), puede ser posible que la combinación triple de mejora tasa de supervivencia mediante la estimulación de la producción de factores solubles, tales como IL-12. células
NK y T CD8 se informó recientemente a ser importante en el cáncer de regresión [27], [28], [29]. Aquí, hemos demostrado que las células T CD8 y NK fueron enriquecidos en tumores cuando la triple combinación se administró (Fig. 3), y el agotamiento de las células CD8 T o células NK aumentó el crecimiento del tumor (Fig. 4). Además, el agotamiento de las células CD8 T o células NK reduce los niveles de IFN-γ inducida e IL-12 (Fig. 5C-5F). Estos resultados indican que las células T CD8 y células NK participan en el efecto anti-tumor de la combinación triple. Triple administración de WKYMVm, mDCs y 5-FU también provocó un efecto anti-metástasis en un modelo animal de cáncer heterotópico (Fig. 6). La inyección intravenosa de liposomas IL-12 complejos de ATRA catiónicos /pDNA fue mostrado para mejorar la inhibición del crecimiento de tumores pulmonares metastásicos en ratones [30], el apoyo a nuestra noción de que IL-12 de producción puede estar asociada con la actividad anti-metástasis de la combinación triple .
en este estudio hemos demostrado que las células T CD8 y células NK juegan un papel importante en la actividad antitumoral de la combinación triple. Hemos informado anteriormente de que las células NK expresan familia FPR funcional, y la estimulación de las células NK con FPR agonista WKYMVm provoca la producción de IFN-γ [11]. En este estudio también encontró que las células NK de ratón expresan familia FPR, y la estimulación de las células NK de ratón con WKYMVm provoca la producción de IFN-γ (datos no mostrados). Este hallazgo explica la activación celular inducida por WKYMVm NK es esencialmente necesario para la actividad anti-tumor de la combinación triple contra modelo animal de cáncer heterotópico. En términos de la activación de las células T CD8 y su papel en el modelo animal de cáncer heterotópico, que anteriormente mostró que las células T no expresan receptores para WKYMVm [31]. Dado que las células T CD8 pueden ser activados por mDCs y IL-12 [32], [33], será razonable pensar que la administración de la combinación triple que contiene WKYMVm puede inducir la activación de las células T CD8 será mediado por mDCs o IL -12.
en conclusión, la inmunoterapia combinación triple con mDCs, el péptido sintético WKYMVm, y 5-FU fue superior al tratamiento simple o doble en la inhibición de tumores y metástasis primarias establecidas, así como la prolongación de la supervivencia. El aumento de la eficacia terapéutica era debido a los efectos que se produjeron localmente (niveles mejorados de FAS y la expresión de la caspasa-3) y sistémica (aumento de la producción de IFN-γ y IL-12). Por lo tanto, el uso de la terapia de combinación triple puede tener implicaciones en el tratamiento de tumores sólidos y metástasis.
Materiales y Métodos
Ratones
El Comité de Revisión Institucional para el Cuidado de Animales y el empleo en Dong-A Universidad específicamente aprobado este estudio (aprobación ID: DIACUC 07-6). los ratones Balb /c (machos, de 6-8 semanas de edad) se obtuvieron del Laboratorio Jackson
Cultivo de células y material de
células CT-26 (CRL-2638;. ATCC American Type Culture Collection ) son una línea celular de adenocarcinoma de colon derivada de ratones Balb /c. CT-26 células se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y antibióticos a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado. El péptido sintético, WKYMVm, se sintetizó en Anygen (Kwangju, Corea). La pureza de WKYMVm sintetizado era & gt; 98%. 5-FU se adquirió de Choongwae, Pharma Co. (Seúl, Corea).
preparación y maduración DC
células de médula ósea se cultivaron durante 5 días en un medio de DC (RPMI 1640 con 10 % de FBS, 2 mM L-glutamina, 50 mM β-mercaptoetanol, antibióticos) en presencia de ratón GM-CSF (1000 U /ml) e IL-4 (500 U /ml), como se describe [34]. GM-CSF e IL-4 fueron repuestas en días 2 y 4. En el día 5, se recogieron las células y se transfirieron a una nueva placa con medio de DC y se estimularon con lipopolisacárido (100 ng /ml; Sigma), CpG oligodesoxinucleótidos 1826 (10 g /ml), y CT-26 lisado (100 mg /ml) durante 2 días para inducir la maduración. En el día 7, las DC se recogieron para su uso como vacunas.
El crecimiento del tumor y la supervivencia
Para medir el crecimiento del tumor, células CT-26 (5 × 10
5 células en 100 l de PBS) se inyectaron sc en el flanco derecho de ratones Balb /c (n = 8) en el día -3. En los días 0 y 1, 5-FU (100 mg /100 l) se inyectó s.c. en ratones Balb /c. El día 2, los ratones fueron tratados con cuatro inyecciones de WKYMVm (100 g /100 l) y mDCs (1 × 10
6 células) a las 12 h-intervalos. En los días 4 y 5, 5-FU (100 mg /100 l) se inyectó s.c. en ratones Balb /c. Posteriormente, los ratones fueron tratados con s.c. inyección de 5-FU, mDCs y WKYMVm vez por semana durante 4 semanas. El volumen del tumor se determinó por la siguiente fórmula: volumen del tumor (en mm
3) = longitud (mm) x anchura (mm)
2/2 [35]. Además del crecimiento de tumor de seguimiento, se observaron los ratones para la supervivencia después de la inoculación y el tratamiento de tumores.
hematoxilina y eosina y tinción de inmunofluorescencia
Los ratones fueron sacrificados 42 días después de la inoculación del tumor, y los tumores fueron extirpados quirúrgicamente , fijado durante 24 h en 10% de fosfato de formalina tamponada neutra (NBF), embebidos en parafina, y se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis morfológico. Para la inmunotinción, se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-ratón Fas (Santa Cruz), anti-ratón exfoliados caspasa-3 (Señalización Celular), conjugado con FITC anti-ratón CD3 (BD Pharmingen), PE conjugado anti-ratón CD4 (BD Pharmingen), PE conjugado anti-ratón CD8 (BD Pharmingen), conjugado con FITC anti-ratón CD11b (BD Pharmingen), y el anticuerpo conjugado con PE anti-ratón DX5 (BD Pharmingen). Para la microscopía confocal, los tejidos tumorales fijadas se tiñeron con FITC-conjugado anti-IgG de ratón y Alexa 594-conjugado anti-IgG de ratón (BD Pharmingen).
In situ
tinción TUNEL
Terminal desoxi-nucleotidyl transferasa mediada fin de etiquetado con digoxigenina-dUTP nick (TUNEL) se realizó para detectar células apoptóticas en los tejidos tumorales. secciones de parafina fueron desparafinados, hidratados, se trató con 3% de H
2O
2 de 5 min, y se enjuagó con PBS durante 15 min, y el
In situ
Death Kit de detección, POD, se utilizó (Roche, Penzberg, Alemania). Brevemente, se detectó el ADN marcado con digoxigenina-dUTP final con el anticuerpo anti-digoxigenina peroxidasa seguido por la detección de peroxidasa con diaminobencidina (DAB). Los tejidos fueron contraste con hematoxilina de Mayer.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
El día 42, se recogió la sangre del corazón de los ratones y se clarificó por centrifugación. El suero se almacenó a -80 ° C hasta que esté listo para el análisis de citoquinas. Murino IL-12 (p70) y IFN-gamma concentraciones se midieron utilizando un sándwich ELISA estandarizada método (BD Biosciences Pharmingen).
In vivo
subconjunto de células inmunes agotamiento
para agotar CD4, células T CD8 y células NK, los ratones fueron tratados con el anticuerpo correspondiente en días -1, 0, y 5 (donde día 0 es el día de la inoculación del tumor primario). La rata monoclonal anti-ratón CD4 (clon GK1.5), rata anti-ratón CD8 (clon 53 a 6,7) y de rata anticuerpos anti-ratón de asialoGM1 se utilizaron para la inmunodepleción. En los estudios de agotamiento de leucocitos, 100 g de anti-CD4, anti-CD8, o anticuerpo anti-asialoGM1 se inyectaron i.p. en ratones Balb /c.
vía subcutánea metástasis de pulmón
Para el experimento de metástasis de pulmón heterotópico, células CT-26 (5 × 10
5 células en 100 l de PBS) se inyectaron en el flanco derecho de ratones Balb /c (n = 8) en el día -3. 5-FU, WKYMVm y mDCs se administraron durante 3 semanas, como se describió anteriormente para el experimento para medir el volumen del tumor. En el día 42, los ratones fueron sacrificados y se observaron nódulos tumorales en la superficie de los pulmones. Para el experimento con animales de cáncer metastásico, CT-26 células se lavaron dos veces con PBS, y se inyectaron en la vena de la cola de ratones Balb /c (2 × 10
5 células en 100 l de PBS). Después de 14 días, los ratones fueron sacrificados y se pesaron los pulmones.
La transferencia adoptiva
Para obtener células T CD8-tumorales CT26 reactivos, los ratones Balb /c fueron inmunizados tres veces (en 1 semana intervalos) con 1 × 10
7 CT26 lisados tumorales (inyección subcutánea). En 21 días, los ratones inmunizados se sacrificaron y se aislaron las células CD8 T o células NK utilizando el kit de aislamiento de células CD8 T o kit de aislamiento de células NK (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) de su bazo. Para la terapia adoptiva, los tumores fueron establecidos por s.c. la inyección de 5 × 10
6 células tumorales CT26 en el flanco derecho de ratones Balb /c. tumores palpables (~ 5 mm de diámetro) forman generalmente en el sitio de inyección después de 4 a 5 días. Antes del tratamiento combinado triple, purificado CD8 T (1 × 10
6/100 l de células) de células o NK (1 × 10
6 células /100 l) células transferidas (inyección iv) a ratones cargado-tumorales CT26 y a continuación, comienzan con el tratamiento combinado triple.
análisis de los datos
los resultados se presentan como la media ± SEM de experimentos repetidos. La significación estadística de las diferencias se determinó mediante ANOVA. Los datos de supervivencia se analizaron mediante la prueba de log-rank.
P Hotel & lt;.. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Min Sung Choi, de la Universidad de Sungkyunkwan por su ayuda editorial