Extracto
Está ampliamente aceptado que la mayoría de los cánceres colorrectales (CCR) surgen de adenomas colorrectales (CRA) , pero los datos de transcriptómica que caracterizan la progresión de la mucosa normal colorrectal a adenoma, y luego a adenocarcinoma son escasos. Estos pasos de transición se investigaron mediante microarrays, tanto a nivel de la expresión génica y empalme alternativo pre-mRNA. Muchos de los genes y exones se expresaron de manera anormal en las ACC, incluso más que en los CRC, en comparación con la mucosa normal. vías biológicas conocidas implicadas en el CCR se alteraron en CRA, pero varias nuevas vías enriquecido también fueron reconocidos, tales como las cascadas de complemento y coagulación. También se identificaron cuatro firmas transcripcional intersectoriales que permiten distinguir las agencias de calificación de las mucosas o CRC normal, incluyendo una firma de 40 genes diferencialmente desregulados en ambas muestras CRA y CRC. La mayoría de estos genes había sido descrita en diferentes tipos de cáncer, incluyendo
FBLN1
o
INHBA
, pero sólo unos pocos en el CCR. Varios de estos cambios también se observaron a nivel de proteínas. Además, el 20% de estos genes (
es decir CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3
y
TIMP1
) mostraron alteración pre-mRNA de empalme en las ACC. Como una variación global que está ocurriendo desde la etapa de CRA, y se mantiene en el CCR, la expresión y los cambios de empalme de este conjunto de 40 genes pueden marcar el riesgo de aparición de cáncer a partir del análisis de las biopsias CRA
Visto:. Pesson M, Volant A, Uguen A, Trillet K, De La Grange P, Aubry M, et al. (2014) Una Expresión Génica y pre-mRNA de empalme de la firma que marca el adenoma-Adenocarcinoma progresión en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (2): e87761. doi: 10.1371 /journal.pone.0087761
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Septiembre, 2013; Aceptado 30 de diciembre de 2013; Publicado: 6 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Pesson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiado por INSERM, Universidad de Brest, Brest Hospital Universitario Cancéropole Gran Occidente, la Ligue contre le Cancer, Oséo - Programa BioIntelligence, ARC, y la región de Bretaña. MP fue el beneficiario de una beca de la región de Bretagne. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más prevalentes en los países desarrollados, y es una de las principales causas principales de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El tipo más común de CRC es el adenocarcinoma (& gt; 95%), que es una neoplasia invasiva del epitelio glandular del colon o el recto. Se acepta que los adenocarcinomas pueden probablemente surgen de adenomas colorrectales (ACC), como se deduce de las características fenotípicas específicas, tales como el tamaño y la histología.
lesiones colorrectales se clasifican en la endoscopia como no polipoide (plana) y polipoide, que se separan en tubular, tubulovelloso o velloso, con diferentes grados de displasia. ACC se refieren a menudo como pólipos adenomatosos que representan las lesiones más frecuentemente asociados con el desenlace neoplásico, y se demostró que su eliminación se relacionó con una disminución en la incidencia de CCR [1]. Mientras que los adenomas tubulares son los más comunes, los adenomas vellosos son los menos frecuentes, pero pueden transformarse en cáncer con alta frecuencia [2]. Además, los pacientes con pólipos anteriores tenían múltiples adenomas avanzados con características patológicas [3].
Varias mutaciones del conductor se han identificado durante la progresión de la CRA para CRC [4], junto con otros eventos moleculares, tales como microARN modulación [5] o alteraciones de corte y empalme de pre-ARNm [6]. Además, varios perfiles de expresión génica han sido reportados en CRC [7], [8]. Algunos estudios también examinaron la expresión génica en CRA, y se analizaron con el linaje CRC [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Sin embargo, la mayoría de los análisis se realizaron a partir de un número limitado de muestras de CRA. Por otra parte, sólo unos pocos estudios han analizado los perfiles pre-ARNm alternativos de todo el genoma de empalme de muestras CRA [15] y su vínculo con el CRC, a pesar de que splicing alternativo se produce un estimado de 90% de los genes en el genoma humano [16] .El objetivo de este estudio fue analizar, con microarrays, la expresión génica y splicing alternativo en las ACC, en comparación con la mucosa normal, pero también con los CRC. Presentamos aquí una imagen completa de las modificaciones que se produjeron en las ACC, algunos de los cuales eran específicas para las agencias de calificación, mientras que otros fueron compartidos en los CRC. Es importante destacar que hemos identificado un conjunto de 40 genes (32 abajo y 8 arriba de los genes regulados), a partir de un análisis interseccional de las comparaciones de lado a lado, teniendo en cuenta las mucosas normales, las agencias de calificación y los CRC, que podría marcar los principales acontecimientos que caracterizan la reglamentación progresión gradual en el cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Tratamiento de la muestra de tejido
Un formulario de consentimiento informado por escrito se elaboró junto con el Comité de Ética del hospital Universitario de Brest (encabezada por el Pr . JM Boles). Los pacientes firmaron el formulario, el cual fue devuelto al departamento de Anatomía y Patología del Hospital Universitario de Brest. Por lo tanto, este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Brest. muestras de colon o el recto de biopsia se obtuvieron después de la extirpación quirúrgica. Las muestras se procesaron a continuación de forma anónima. Los fragmentos de tejido derivadas de biopsias fueron almacenadas en RNAlater (Ambion, Francia): 55 CRA, 25 y 27 CRC mucosas normales colorrectal (NOR; emparejados con ACR o CCR) han sido recogidos entre 2006 y 2012, la mayoría a partir de 2009. A partir de CRA o biopsias de CRC, un fragmento de superficie se recogió de la región del tumor, que comprende en las células tumorales promedio 90%, 5% de linfocitos y 5% de células del estroma. Estos porcentajes fueron muy homogénea entre muestras independientes. Tres subgrupos (A1, A2 y A3) de las ACC podían distinguirse según los datos histológicos. Toda la información del paciente se presenta en la Tabla 1 y en la Tabla S1. ADN y el ARN total se extrajeron con el kit de AllPrep DNA /RNA Mini (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) a partir de muestras de tejido homogeneizadas (20 mg), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ARN pureza y la integridad se determinaron midiendo la relación de densidad óptica (A260 /A280) y el número integridad del ARN (RIN) se obtuvo usando el RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Massy, Francia) y el 2100 Bioanalyzer (Agilent). Sólo las muestras de ARN con una proporción & gt 28S /18S; 1,0 y RIN ≥7.0 fueron utilizados para análisis de microarrays
de todo el genoma de microarrays
Un análisis de las muestras de RNA derivado de 55 colorrectal. tejido, que consta de tres grupos de la muestra (NOR, CRA y CRC) con un número de repeticiones biológica variable, se realizó en 44k microarrays de todo el Genoma humano (Agilent) que contienen 41.093 sondas, proporcionar una cobertura completa de las transcripciones humanos. cDNA de doble cadena se sintetizó a partir de 500 ng de RNA total usando el kit de marcaje de Amp rápidas en un solo color, como se indica por el fabricante (Agilent). Etiquetado con cyanine3-CTP, la fragmentación de cRNA, la hibridación y el lavado se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Agilent). Los microarrays fueron escaneados y los datos se extrajeron con el software de extracción de características de Agilent. Análisis FODA
Expresión Génica
Los datos de expresión génica sin procesar se importaron en el programa de software 11.0.2 GeneSpring GX (Agilent). comparaciones de lado a lado se realizaron para las alteraciones de la expresión génica: CRC
vs
emparejados NOR, CRA
vs
NOR, y el CRC
vs
CRA.... Los genes con valores que faltan en más de 25% de las muestras se excluyeron del análisis. Estos datos han sido depositados en Gene Expression Omnibus de NCBI y son accesibles a través de números de acceso de la serie GEO GSE50114, GSE50115 y GSE50117. Se aplicó una de 2 veces de desconexión para seleccionar el arriba y abajo de los genes regulados (P-valor ≤ 0,01 por
t-test
con Benjamini-Hochberg tasa de falso descubrimiento, FDR). La agrupación jerárquica de la expresión de datos se ha realizado mediante la distancia euclídea con el promedio de vinculación.
conjunto de genes de enriquecimiento Análisis
El software a disposición del público, de base de datos para anotación, y Visualización Integrada Discovery, se utilizó [17] para analizar el enriquecimiento conjunto de genes en las lesiones colorrectales. Se aplicó una de 2 veces de desconexión para seleccionar la lista de genes desregulados (P-valor ≤0.01 por
t-test con
FDR). Sólo se describirán las vías de la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG) [18].
Alternativa Empalme Análisis
Un ARN agrupado, analice en duplicado, a partir del 3 mucosas normales y colorrectal 24 muestras de ARN CRA se analizaron en Human exón 1,0 ST arrays (Affymetrix, París, Francia), lo que permitió el análisis tanto de la expresión génica y splicing alternativo. microarrays de hibridación se llevó a cabo en las instalaciones del Instituto Curie (París, Francia). Los datos en bruto se analizaron mediante la tecnología GenoSplice. Estos datos son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE50592. Se aplicó un 1,5 veces de desconexión para seleccionar el arriba y abajo de los genes regulados y exones (P-valor ≤ 0,05).
Real-Time Reacción en Cadena de Polimerasa Validación
una etapa de validación de resultados de microarrays, RT-PCR cuantitativa se realizó en tres grupos (NOR, CRA y CRC) de al menos 8 muestras, incluyendo algunas de las muestras hibridadas en microarrays, o en un conjunto independiente de 14 CRA y 8 emparejado tumoral CRC muestras -Normal. Se utilizó el ARN total (200 ng) para la síntesis de ADNc de primera cadena con la gran capacidad del kit de cDNA transcripción reversa (Applied Biosystems). RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando el SYBR Green PCR Master Mix de alimentación (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante con un sistema de PCR en tiempo real ABI 7000 o 7300 (Applied Biosystems). Todas las determinaciones se realizaron por duplicado y se normalizaron contra
beta
-2-microglobulina como un gen de control interno. Los resultados se expresaron como la expresión de genes en relación con el método ΔΔCt [19]. Todos los genes analizados fueron seleccionados con base en el análisis de microarrays, con el fin de validar el enriquecimiento vía biológica y una firma de genes en las ACC y CRC. El primer secuencias y condiciones de reacción se pueden proporcionar a petición. Además, se utilizó una configuración de arrays de PCR (Qiagen) para analizar, en NOR y muestras de CRC, la expresión de los genes con los primers presentes entre las placas de múltiples pocillos de matriz de PCR (apoptosis, cáncer Camino Finder, el metabolismo de fármacos, lipoproteína de señalización y el metabolismo del colesterol,
Wnt
vía de señalización).
resultados
Comparación de Adenoma colorrectal morfológicas Subgrupos
Varios puntos de referencia de mutaciones se han descrito en la progresión a cáncer colorrectal, tales como
KRAS
,
BRAF
y
PI3K
mutaciones [4], [20], y se analizaron en nuestras muestras (información de apoyo). Además, se determinó el estado de inestabilidad de microsatélites (información de apoyo) en 12 muestras de CRA, pero todos fueron negativos. La clasificación de Viena permitido a los adenomas de grupo en dos clases: un grupo menor de grado inferior (3) con 11 (22%) muestras y un grupo importante de 40 (78%) muestras de grado superior (& gt; 3) (Tabla S1) . Esta clasificación No se han encontrado con los tipos de lesiones túbulo-tubular /vellosidades /, ya que las ACC tanto con bajo grado y displasia de alto grado se distribuyen de manera uniforme en los grupos tubullovillous y tubulares (sólo una CRA era del tipo velloso). por lo tanto, no se adoptó esta separación en tubular, velloso o túbulo. Decidimos que depender de un análisis de la morfología precisa y aplicamos una agrupación anatómica, lo que llevó a la distinción de tres grupos morfológicos: adenomas con áreas de adenocarcinomas de micro-invasivo (A1; 10 muestras), adenomas degenerado,
es decir
. adenomas con áreas de
en los adenocarcinomas in situ gratis (dentro de la mucosa) (A2; 17 muestras), y adenomas con displasia de áreas (A3; 24 muestras). Con el fin de determinar si las ACC también podría distinguirse por medio molecular, un ANOVA de una vía se realizó para comparar subgrupos CRA para CRC y NOR grupos, con "tipo de tejido" como un factor ANOVA (datos no mostrados). El análisis reveló que los subgrupos CRA estaban muy cerca entre sí. No hubo diferencias entre los subgrupos A2 y A3, y se encontró que el número máximo de sondas desregulados para el subgrupo A1
vs
. subgrupo A2 de comparación (49 sondas, que corresponde al 0,12% del número total de sondas, valor de p ≤0.01). Por otra parte, mientras que las comparaciones entre los subgrupos de la CRA y mucosas normales mostraron el mayor número de sondas distintivos (hasta 4.382 sondas en el subgrupo A2
vs
. NOR), las comparaciones entre subgrupos y CRC CRA mostraron los más pequeños (hasta 1.424 sondas en el CCR
vs
. subgrupo A2). CRA en su conjunto eran por lo tanto más distinto de las mucosas normales que de CRC. Los tres subgrupos CRA también se compararon entre sí, y no se observó ninguna diferencia en el lado a lado comparaciones (p-valor de ≤0.01 por
t-test con
FDR). En consecuencia, las ACC fueron considerados colectivamente como un único grupo de más comparaciones de lado a lado por el estudiante de
t-test
.
perfiles de expresión génica en lesiones colorrectal en comparación con el normal de las mucosas
con el fin de identificar los genes que podrían participar en la progresión de la mucosa normal a CRA, se realizó un CRA
vs
. NI comparación, y se encontró que 2.393 sondas fueron desregulados en las ACC (≥ 2,0 veces el cambio (FC), P-valor de ≤0.01 por
t-test con
FDR), que corresponde a un 32% hacia arriba y 68 % de bajada reglamentos. El CRC
vs
. NI comparación mostró que 1.805 sondas fueron desregulados en los CRC (≥2.0 FC, P-valor por ≤0.01 emparejado
t-test con
FDR), que corresponde al 46% hacia arriba y hacia abajo 54%-normativa. Los mapas de calor de las sondas desregulados con un factor de cambio ≥3.0 y un valor de p ≤0.001 se muestran en las Figuras 1A (CRA
vs
. NOR) y 1B (CRC
vs
. NI), y la figura S1 (CRA
. NOR, imagen completa vs). Las listas completas de los expresados diferencialmente sondas en CRA
vs
. NOR y CRC
vs
. NI se presentan en los cuadros S2 y S3, respectivamente. Un conjunto de eventos de desregulación en CRA
vs
. Tampoco fue analizado por RT-PCR cuantitativa, y el índice de validación de resultados de microarrays Agilent fue del 78% (50 de los 64 transcripciones; Tabla S4). Además, la serie de experimentos Qiagen PCR se realizaron en un conjunto independiente de 96 CRC y 20 NOR muestras (de banco de tumores Brest). Entre las sondas desregulados en el CCR
vs
. NOR en microarrays, 41 pares de cebadores correspondientes a los mismos genes que estaban presentes en las matrices de PCR. Veintiocho también fueron desregulados en las matrices de PCR (≥2.0 FC, valor P ≤0.01), lo que corresponde al 68% de la validación cruzada (Tabla S5).
Mapa de calor de los datos de expresión se construyó utilizando la distancia euclídea con el promedio de vinculación. El mapa de calor de las sondas desregulados con un factor de cambio ≥3.0 y un valor P ≤0.001 se muestra para CRA
vs
. NI (A; mapa de calor completo en la figura S1), para el CCR
vs
. NI (B), y el CRC
vs
. CRA (C).
El CRA
vs
. NI comparación mostró más diferencias que la CDN
vs
. NI comparación, y no hubo más los pies en la normativa (68% en CRA
vs
. 54% en CRC) de hacia arriba-normativa (32% en CRA
vs
. 46% en CRC) . Un análisis interseccional de las alteraciones a nivel de la sonda se realizó (Figura 2A), que muestra una firma de 954 sondas desregulados en ambas muestras CRA y el CRC en comparación con la mucosa normal (Tabla S6 y la Figura S2), que corresponde a 40% y 53% sondas desregulado en CRA y el CRC, respectivamente. Todas las sondas comúnmente desregulados siguieron el mismo tipo de variación en ambas comparaciones,
es decir.
Eran altura o hacia abajo-regulada de manera similar se llevó a cabo.
Un análisis interseccional de alteraciones a nivel de la sonda. Los valores de corte fueron de valor P ≤0.01 y ≥2-veces el cambio. La CRA
vs
. NI comparación mostró el mayor número de cambios en el nivel de la sonda (2.393 sondas desregulados), mientras que el CRC
vs
. CRA comparación mostró el más bajo (669 sondas desregulados). Las sondas que mostraban alteraciones en dos o en las tres comparaciones fueron de interés. (A) la firma de 954 sondas desregulados tanto en las lesiones de la CRA y la CRC en comparación con NOR. (B) La firma de 172 sondas desregulados en el CCR en comparación con tanto CRA y NOR. (C) La firma de 265 sondas desregulados en el CCR en comparación con CRA, que ya estaban niveles anormales de CRA en comparación con NOR. (D) Firma de 44 sondas que muestra alteraciones en las tres comparaciones (CRA
vs
. NOR, CRC
vs
. CRA y el CRC
vs
. NOR). Abreviaturas: NOR: mucosa normal colorrectal; CRA: adenoma colorrectal; CRC:.
Cáncer colorrectal
Camino de Enriquecimiento en colorrectales Las lesiones en comparación con las mucosas normal
El KEGG vía de análisis mostró 25 conjuntos de genes distinguir CRA de NI, y el 20 de distinguir CRC NOR ( P-valor ≤0.05; Tabla 2), teniendo en cuenta las sondas desregulados con una de 2 veces de corte (P-valor ≤0.01 por
t-test con
FDR). El complemento de la coagulación y cascadas, la interacción del receptor de citoquina-citoquina, y las vías de señalización de quimiocinas se encontraban entre la parte superior de las vías enriquecido en CRA
vs
. NOR, mientras que el ciclo celular y la replicación del ADN eran las vías más afectadas en el CCR
vs
. NOR, de acuerdo con el valor de p. Siete vías fueron enriquecidos en tanto CRA
vs
. NOR y CRC
vs
. NOR comparaciones, entre las que la vía de señalización p53 era parte de las vías enriquecidos ya descritos en CRA [14]. el metabolismo del nitrógeno fue también una vía común enriquecida entre ambos análisis, e incluyó los anhydrases carbónica (
CA1
y
CA4
) que formaban parte de las mayoría de las sondas-regulado en CRA y el CRC.
Si un 1,1 veces de desconexión en lugar de 2,0 se aplicó para seleccionar sondas desregulados (P-valor ≤ 0,01),
es decir
. si todas las sondas fueron considerados desregulados (5 733 sondas), 18 genes establece en lugar de 25 fueron alterados en CRA
vs
. Ni según KEGG (P-valor ≤0.05; Tabla S7). Sólo la vía del complemento y coagulación cascadas era común entre ambas las listas de genes 18 y 25. Por lo tanto, 17 nuevas vías fueron enriquecidos en CRA, tales como la replicación del ADN, ciclo celular, spliceosoma o reparación de genes.
perfiles de expresión génica en adenocarcinomas de colon en comparación con adenomas colorrectales
Un análisis de forma diferencial sondas detectadas entre CRC y CRA identificaron 669 sondas desregulados (≥2.0 FC, valor de p de ≤0.01 por
t-test con
FDR), que corresponde al 55% hacia arriba y hacia abajo 45%-normativa. El mapa de calor de las sondas desregulados con un factor de cambio ≥3.0 y un valor P ≤0.001 se muestra en la Figura 1C. La lista completa de las señales de la sonda diferencial en el CCR
vs
. CRA se presenta en la Tabla S8. El CRC
vs
. CRA comparación mostró un menor número de diferencias de nivel sonda con mucho más bajos factores de cambio que el CRC
vs
. NI y CRA
vs
. NOR comparaciones. El análisis interseccional de señales de la sonda mostró una firma de 172 sondas desregulados en el CCR en comparación con muestras tanto de la CRA y NOR (Figura 2B, Tabla S9 y Figura S3), que corresponde al 26% sondas desregulados en el CCR
vs
. CRA, y menos del 10% del mercado liberalizado sondas en el CCR
vs
. NI. A medida que estas modificaciones no estaban presentes en CRA, podrían ser marcadores de CRC agresividad.
Enriquecimiento Camino en adenocarcinomas de colon en comparación con adenomas colorrectales
El KEGG vía de análisis reveló cinco conjuntos de genes que distinguen a partir CRC CRA (P-valor ≤0.05; Tabla 2), teniendo en cuenta las sondas con una de 2 veces de corte desregulado (P-valor ≤0.01 por
t-test con
FDR). Dos vías enriquecidos fueron específicos para la CDN
vs
. comparación CRA: arginina y prolina metabolismo, y TGF
beta
vía de señalización que ya ha sido descrito como una vía alterada entre CRA y CRC [9]. Por otra parte, la CRA
vs
. NOR y CRC
vs
. comparaciones CRA tenían tres vías comúnmente enriquecidos, entre las que la adhesión focal y la interacción ECM-receptor formaban parte de las vías ya reportados enriquecidas en la carcinogénesis de colon [21]. Estas vías podrían desempeñar un papel importante en la progresión de la CRC, ya que se enriquecieron de NI a CRA, y luego desde CRA a la CRC.
Firma intermedio de progresión de adenoma colorrectal de adenocarcinoma colorrectal
la evidencia de la progresión de la NOR a CRA, y luego a CRC, se investigó con un análisis interseccional de las alteraciones a nivel de la sonda. Se identificó una firma de 265 sondas, que corresponde a 215 genes, (Figura 2C, Tabla S10 y la figura S4), que era una coincidencia en las listas de los 2.393 y 669 sondas desregulados, correspondiente a la CRA
vs
. NOR y CRC
vs
. Comparaciones de CRA, respectivamente. Se incluye sondas desregulados en el CCR
vs
. CRA, que ya eran distintos en la CRA
vs
. NOR análisis. Las distribuciones de los acontecimientos hacia arriba y hacia abajo reguladas en el CCR
vs
. CRA fueron 69% y 31%, respectivamente. Un análisis de enriquecimiento de la firma de 265 sondas se realizó utilizando KEGG vías, y reveló que 41 genes fueron parte de ocho conjuntos de genes enriquecidos, incluyendo la adhesión, la interacción ECM-receptor focal o TGF
beta
vía de señalización (Tabla S11). Por otra parte, se identificó un patrón de expresión génica intermedio de 44 sondas (que corresponden a 40 genes) firmas (Figura 2D y en la Tabla 3), que fue una coincidencia en las tres listas de sondas desregulados, y luego fue parte de todas las firmas que ya hemos descrito anteriormente ( de 954, 172 y 265 sondas). Correspondía a 8 hacia arriba y hacia abajo 32 genes regulados en ambas muestras CRA y la CRC, en comparación con la mucosa normal. Ocho sondas demostraron un aumento progresivamente las señales de NI a CRA, y después de la CRC; 23 sondas reveladas gradualmente disminuyeron señales. Además, 13 sondas fueron suprimidas en menos CRC que en CRA, en comparación con NOR.
Clasificación de los adenomas de colon en comparación con normal de las mucosas y colorrectal Los adenocarcinomas
Una clasificación de la tejidos colorrectales se ha realizado mediante la agrupación jerárquica de las alteraciones de la señal de sonda correspondientes a los cuatro firmas descritos previamente. Sólo se distinguieron dos grupos, considerando la firma de 954 sondas (Figura S2): uno estaba compuesta de mucosa normal y el otro contenía una mezcla de lesiones colorrectales. Por el contrario, la agrupación considerando la firma de 172 sondas permiten distinguir los tres tipos de tejidos colorrectales (Figura S3): un grupo se componía solamente de los CCR, y el otro se divide en un subgrupo de CRA y NOR subgrupo. Del mismo modo, la agrupación con la firma de 265 sondas habilitados para distinguir los tres tipos de muestras (Figura S4), pero un solo grupo estaba compuesto por las agencias de calificación, y el otro agrupan los NOR y CRC muestras que fueron distribuidos en dos subgrupos distintos. Por último, la firma de 44 sondas mostraron que la mayoría de las ACC agrupado con CRC, algunas agencias de calificación (que muestra la histología menos afectados) se agrupa con NOR muestras (Figura 3). Para la mayoría de las muestras, no se reconoció concordancia estricta entre los subgrupos (morfológicas o localización) histológicos y moleculares de datos sobre la distribución de las ACC en subgrupos. Del mismo modo, los aspectos específicos de la agrupación CRC no fueron explicados por la localización del tumor (Tabla S1). Los datos moleculares podrían así dar información complementaria para clasificar las lesiones colorrectales.
Las ramas representan muestras individuales colorrectales. Se utilizaron diferentes colores para identificar los grupos de la muestra: rojo, grupo de mucosa normal (N: normal); verde, grupo de adenomas (A: adenoma); azul, grupo de los adenocarcinomas (C: cáncer). La primera anotación de la muestra corresponde al grupo de muestra. Los subgrupos de los adenomas se especifican: A1, adenomas con áreas de micro-adenocarcinomas invasivos; A2, adenomas con áreas de adenocarcinomas intra-mucosa; A3, adenomas con áreas de displasia. La segunda anotación de la muestra se corresponde con el número de la muestra.
Exon-Nivel Análisis de adenomas colorrectales
Un CRA
vs
. NI comparación se realizó en Human exón 1,0 ST arrays (Affymetrix), y mostró que 1.484 genes fueron desregulados en el CRA (590 hacia arriba y 894 genes regulados; ≥1.5 FC, valor P ≤0.05; Tabla S12). Un mapa de calor correspondiente se muestra en la Figura S5. Una serie de transcripciones desregulados en CRA
vs
. Tampoco fue analizado por RT-PCR cuantitativa, y el índice de validación de resultados de microarrays de Affymetrix fue del 83% (24 de los 29 transcripciones, también validados para el análisis de Agilent). Además, la CRA
vs
. NI comparación mostró grandes cambios en los perfiles de splicing alternativo: 1.852 exones fueron desregulados en el CRA (862 990 arriba y abajo reguladas exones; ≥1.5 FC, P-valor ≤0.05; Tabla S13). A los datos de microarrays de expresión disponibles al público establecidos de 10 muestras apareadas de tumor normal de CRC [6] fue descargado desde el sitio web de Affymetrix con el fin de comparar los perfiles de splicing alternativo en CRA y el CRC. La CRA
vs
. NOR y CRC
vs
. NI comparaciones tenían 100 exones desregulados en común. Mientras que el 47 arriba y 47 eventos de corte y empalme-regulado por siguieron el mismo tipo de variación en las dos comparaciones, pocas regulaciones eran opuesto en CRA y CRC, correspondiente a 6% de los exones desregulados comunes (datos no mostrados). Se encontró que 296 desregulado (102 hacia arriba y hacia abajo 194-regulado) sondas en CRA
vs
. NOR del análisis Agilent mostró exones desregulados en el análisis Affymetrix (datos no mostrados). Una gran cantidad de genes que eran parte de las vías alteradas tenía exones desregulados. Entre los 40 genes de la firma Agilent transcripcional de 44 sondas, 8 (
CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3
y
TIMP1
),
es decir
. 20 exones%, había desregulados (Tabla S14).
Discusión
El objetivo de este estudio fue investigar, a nivel de todo el transcriptoma, en la medida de las variaciones que se producen en los adenomas colorrectales humanos en comparación con adenocarcinomas, tomando el epitelio normal como referencia. Muchos cambios fueron evidentes en el CRA
vs
. NOR, incluso más que en el CCR
vs
. NI. Por lo tanto, CRA, como un tipo de lesión intermediario, ya exhibió fuertes señales de alteraciones. A partir de los cambios moleculares evidenciados en CRA, es evidente que las ACC no son meramente acumulando alteraciones que se pueden encontrar en los CRC. Posiblemente, la evolución de CRCs sigue una expansión más estrictamente clonal, que puede llevar a seleccionar para cambios en los genes importantes para el crecimiento clonal, mientras que la eliminación de modificaciones menos relevantes. De acuerdo con esta hipótesis, las ACC puede tener diferentes resultados, algunas evolución hacia el cáncer, mientras que otros podrían ser propensos a la desaparición. Se identificaron cuatro firmas que distinguen los tipos de tejidos colorrectales, y demostraron que un conjunto de 40 genes podría ser de interés específico, marcando los cambios moleculares que distinguen a la mucosa normal del CRA y la CRC. Es importante destacar que varios eventos alternativos de empalme de pre-ARNm también eran características de la CRA a la progresión del CRC.
Varios genes implicados en el CCR fueron desregulados en CRA
vs
. NI. Los mayores incrementos en los niveles de sonda incluyen
KIA1199 Windows que ya habían sido encontrados desregulado en CRA [22], o la metaloproteinasa de la matriz
MMP7
que se conoce sobre-expresión de influir en la carcinogénesis colorrectal temprano [23 ]. Quince conjuntos de genes, como los que participan en la interacción de citoquinas-receptor de citoquina, vía de señalización de quimioquinas, o moléculas de adhesión celular, eran específicos para la CRA
vs
. NI. Es importante destacar que, se identificaron varias nuevas vías biológicas enriquecidos, entre los que la vía del complemento y coagulación cascadas fue el más afectado de manera significativa en el análisis de Agilent, y también se identificó como alterada en el análisis de Affymetrix (datos no mostrados). Esto está de acuerdo con un informe reciente sugiere que los componentes de la cascada de la coagulación podrían influir en la progresión del cáncer [24].
Un número de genes también se expresa de forma diferente en el CCR
vs
. CRA. La mayoría de estos genes no han sido descritos en anteriores estudios de microarrays, aunque varios de los cambios estuvieron de acuerdo con informes anteriores, incluyendo las variaciones en los niveles de expresión de AMN, THBS2, SPP1 o TIMP1 [25], [26], [27]. Además, 58 sondas (19 arriba y 39 hacia abajo-regulado) de la CDN
vs
. Comparación de CRA se encontraban entre una lista de 248 sondas identificada previamente [11], incluida la de
AURKA
, que codifica una quinasa regulada por el ciclo celular implicada en el CCR [28], y se expresó en off en el CCR, como en comparación con CRA y NOR. Además, entre nuestros principales desregulado sondas,
SPON2
,
Rgs16
,
SFRP4
y
CTHRC1
ya se han encontrado entre los más regulados arriba sondas en el CCR en comparación con CRA, y
FAM55D
,
ATOH8
,
RETNLB
,
ID4
,
UGT1A6
, y
VSIG2
, entre las mayoría de las sondas-regulado [11]. Ya se demostró que algunos de estos genes fueron desregulados en los cánceres epiteliales o asociados con, como
SFRP4
,
SPON2
[29],
Rgs16
[30], o
UGT1A6
[31].
se identificaron alteraciones de expresión de genes específicos en cualquiera de los tipos de lesiones colorrectales, gracias a los análisis intersectoriales (Figura 2). En primer lugar, 1.218 (51%) desregulados sondas fueron específicos para la transición ni de CRA y, a continuación, podría marcar CRA de bajo riesgo, ya que no existía ningún vínculo con el CRC. En segundo lugar, 723 (40%) fueron desregulados sondas específicas para el CCR
vs
. NOR, y luego podría marcar específicamente CRC. Por último, 276 (41%) fueron desregulados sondas específicas para la CRA para la transición CRC. Este último grupo de sondas podría ser interesante para definir eventos específicos para las etapas finales de la progresión del cáncer
.
La firma de 954 sondas correspondió a genes que muestran alteraciones de expresión en ambas muestras CRA y la CRC, en comparación con la mucosa normal. Como estas sondas desregulados en CRC también se expresaron de forma anormal en el CRA, que eran marcadores candidatos improbables de la progresión de la CRA para CRC. De acuerdo con ello, la agrupación jerárquica no permite distinguir las agencias de calificación de CRC. La firma de 172 sondas, que corresponden a los genes desregulados en el CCR en comparación con tanto CRA y NOR, podría marcar específicamente CRC y, el apoyo a esta hipótesis, la agrupación jerárquica identificado la CRC como un solo grupo. La firma de 265 sondas correspondientes a los genes desregulados en el CCR
vs
. CRA, que ya estaban anormalmente expresado en CRA
vs
.