Extracto
El factor nuclear HNF4α hepática es una expresión del factor de transcripción versátil y controles de muchos genes en el desarrollo , el metabolismo y la enfermedad. Para delinear su red de regulación de genes en el cáncer de colon y para definir nuevas dianas génicas de un análisis completo de todo el genoma se llevó a cabo con una resolución de 35 pb con cromatina ADN IP obtiene a partir de la línea celular de carcinoma de colon humano Caco-2 que es un particularmente rica fuente de HNF4α. Más de 90% de los sitios de unión HNF4α fueron asignadas como secuencias promotoras distales, mientras que los elementos potenciadores se podrían definir para fomentar bucles de cromatina para la interacción con otros factores de transcripción del promotor de ruedas. El análisis de secuencia motivo por diversos algoritmos genéticos evidenció una enhanceosome única que consistió en las proteínas nucleares ER, AP1, Gata y HNF1α como factores de transcripción que coopera. En general & gt; 17.500 sitios de unión de ADN se identificaron con una relación de gen /sitio de unión que difería & gt; 6 veces entre cromosomas y agrupados en regiones cromosómicas distintas entre & gt; 6600 genes dirigidos por HNF4α. Se presenta evidencia de receptores nucleares diafonía de HNF4α y receptor de estrógenos α que se resume en la secuencia. Sorprendentemente, el cromosoma Y carece de sitios de unión HNF4α. La importancia funcional de los sitios de enriquecimiento fue confirmado en estudios de expresión de genes en todo el genoma en diferentes niveles de proteína HNF4α. Tomados en conjunto, se informó un análisis de todo el genoma de los sitios de unión HNF4α para comprender mejor los mecanismos básicos de control de la transcripción de genes específicos HNF4α. Se identifican promotor novedoso sitios de unión distal que forman enhanceosome facilitando de esta manera los eventos de procesamiento del ARN
Visto:. Weltmeier M, Borlak J (2011) Una alta resolución de escaneo de genoma completo de HNF4α sitios de reconocimiento infiere una red de regulación de genes en Cáncer de colon. PLoS ONE 6 (7): e21667. doi: 10.1371 /journal.pone.0021667
Editor: Ying Xu, de la Universidad de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2011; Aceptado: 6 Junio 2011; Publicado: 28 Julio, 2011
Derechos de Autor © 2011 Weltmeier, Borlak. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Ministerio Sajonia inferior de la Cultura y las Ciencias y la Fundación Volkswagen, Alemania. Grant número: 25A.5-7251-99-3 /00. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
hepática factor nuclear HNF4α es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares y un factor de transcripción extremadamente versátil [1]. Esta proteína de dedos de cinc se expresa en el hígado, el intestino, el páncreas y otros tejidos, y se une a secuencias de ADN afines como un homodímero [2]. En el pasado, se informó de algunos sitios de unión docena de promotor. El uso de inmunoprecipitación de la cromatina y metodologías chip-chip microarrays de hibridación demostró que estos son sólo la fracción más pequeña de los sitios de unión HNF4α reales. Mediante el uso de suelo de baldosas gama que abarca las regiones ENCODE que representan 1% del genoma de la línea celular de hepatoma humano HepG2 [3] podría ser mapeada un total de 194 sitios de unión HNF4α. En otro estudio HNF4α sitios de unión en los hepatocitos e islotes pancreáticos fueron asignadas, pero el enfoque centrado en regiones promotoras solamente [4]. Al día de hoy, no se ha reportado una huella en todo el genoma de HNF4α. Notablemente, HNF4α es una proteína reguladora principal y la disfunción de HNF4α se ha asociado con enfermedades metabólicas y cancerosas. Estamos particularmente interesados en explorar una huella genómica HNF4α en la línea celular adenocarcinmoa colon humano Caco-2 que ha sido ampliamente utilizado para explorar la actividad HNF4α [5] identificando de este modo una red de genes regulados. Específicamente, la línea celular se diferencia en enterocitos sobre confluencia [6] y expresa la proteína HNF4α comparable a hígado [7]. Aquí mostramos el primer genoma de toda exploración que permitió la identificación de & gt; 17.500 sitios de unión dirigidos por HNF4α y describir su distribución cromosómica. Además, se estudiaron las consecuencias de la inducción de la proteína HNF4α sobre la actividad transcripcional de
de novo
genes identificados y demostrar una buena concordancia entre los objetivos de la novela de genes y su expresión en células Caco-2. Por último, analizamos HNF4α sitios de motivos de unión enriquecidos y cooperantes identificados los factores de transcripción que parecen actuar en concierto con HNF4α en un enhanceosome de la regulación transcripcional de unión.
Resultados
La cromatina IP experimentos se realizaron con cultivos celulares y un anticuerpo altamente específico para HNF4α 2 Caco-. En particular, se obtuvo el total de entrada, así como IP-ADN de tres réplicas biológicas independientes y sometidos a un protocolo optimizado para la amplificación imparcial de acuerdo con la recomendación de manufacturas (véase también la sección Material y Método). El ADN amplificado a partir de experimentos independientes se hibridó con los arrays suelo de baldosas 2.0R Affymetrix Humanos con una resolución de todo el genoma de 35 pb. A continuación, los datos en bruto se examinaron para regiones enriquecidas mediante el uso de tres algoritmos independientes (TAS [8], MAT [9] y Tilemap [10]). criterios de corte iniciales se establecen en el control positivo débilmente enriquecido (
OTC
) y mejorado aún más sobre la base de la frecuencia de HNF4α -motifs dentro de las regiones enriquecidas, tal como se determina por el algoritmo PARTIDO [11]. Para ganar confianza en los datos, se cruza resultados de los tres algoritmos. La superposición de sitios de enriquecimiento (ES) identificados por los tres enfoques era muy alto (Fig. 1), a pesar de que se observaron pequeñas diferencias posiblemente debido a las diferentes bibliotecas repetidos utilizados. En general, este enfoque condujo a la identificación de 17.561 ES (Tabla S1). Por otra parte, un conjunto de datos de baja rigurosidad se generó mediante la fusión de los datos ES detectados con el MAT y algoritmos Tilemap. Esto dio lugar a un total de 25,419 ES (Tabla S2).
Los datos en bruto se analizó con tres programas diferentes (Tilemap, MAT y TAS) para identificar los sitios de unión HNF4α. Aunque se utilizaron diferentes ajustes de los parámetros (por ejemplo, ancho de banda de 200, 300 y 400 nucleótidos) y de diferentes algoritmos, la superposición fue sorprendentemente alto. El diagrama de Venn se calculó utilizando la función de intersección de Galaxy [47].
Además, 15 ES de genes blancos HNF4α conocidos fueron elegidos y su enriquecimiento en las primarias de ADN-IP se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Para todos los sitios seleccionados de enriquecimiento se pudo confirmar. Así, la robustez y la calidad de los datos se validan (Fig. 2). Entre los identificados ES había sitios de unión HNF4α ya descritos en la literatura o en otros lugares reportados como
AAT gratis (R00114),
GCC gratis (R08885),
PCK gratis (R12074 ),
APOB gratis (R01612),
CYP2C9 gratis (R15905),
AKR1C4 gratis (R13037),
ACADM gratis (R15923) o
CYP27A1 gratis (R15917). En el caso de SHBG (R15941), ES se determinaron dentro de unos pocos cientos de pares de bases con relación a los sitios de unión reportados. Otros sitios de unión descritos en la literatura, como
ALDH2 gratis (R15845), no se pudo confirmar. Sin embargo, la cuantificación mediante PCR en tiempo real mostró que el
ALDH2
sitio se enriquece no en las primarias de IP-ADN. Como las funciones de la proteína HNF4α de una manera específica de tejido, no es inesperado que algunos ES no están obligados en las células Caco-2; su accesibilidad más bien depende de la organización de la cromatina, que a su vez depende del tipo de célula. Esto es apoyado por investigaciones independientes, en los que se habían observado diferencias significativas en los sitios de unión de ADN en diferentes tipos de células [12].
El enriquecimiento de nuevos sitios de unión HNF4α detectados por el chip-chip fue confirmada por PCR en tiempo real. se utilizó chip-ADN de tres experimentos independientes. La normalización se realizó con un control negativo β-actina, y los valores se muestran como enriquecimiento veces frente a la entrada total. HNF1α aguas arriba es un segundo control negativo, situado aguas arriba del sitio de unión HNF4α conocido en el promotor HNF1α y se utiliza para confirmar el control negativo ß-actina.
El motivo HNF4α es altamente enriquecido dentro del chip regiones
chip regiones enriquecidas fueron examinados para HNF4α motivos de unión con el algoritmo PARTIDO [11]. El uso de criterios estrictos para minimizar los falsos positivos, & gt;. Se observó un enriquecimiento de 14 veces para HNF4α secuencias dirigido en comparación con el fondo genómico (Tabla S3)
Las regiones de 500 pb en torno a los 17.561 sitios de unión identificados fueron analizadas para determinar motivos HNF4α con ajustes para minimizar los falsos negativos por el uso del algoritmo PARTIDO [11]. Esencialmente, las regiones se dividen en segmentos en contenedores de 25 pb, y se contó el número de ocurrencias de los diferentes motivos dentro de cada bin. Esto dio lugar a un total de 23.145 motivos y equivale a 1,32 /motivos región chip. Para el 98,1% de las regiones de chip se detectó al menos un motivo. Esto sugiere que la mayoría de las regiones de chip se enriquecieron debido a la unión directa de HNF4α. Por el mismo enfoque a los sitios de unión reportados para las regiones ENCODE fueron examinados [3] y 1,13 motivos /región se estimaron viruta que es menor que la observada en el presente estudio sugieren que posiblemente matrices de alta resolución de mosaico para identificar mejor ES. Posteriormente, se analizó la distribución de los motivos HNF4α alrededor del centro de las regiones de chip enriquecido (Fig. 3a). La mayoría de los motivos se encuentra en una región de sólo ~ 500 pares de bases. Cuando las regiones enriquecidas en las posiciones de los picos detectados con el algoritmo MAT fueron alineados en contra de la posición central, el número de motivos HNF4α aumentó, por lo tanto, lo que indica que la posición del pico estima mejor sitio de unión real. Además, se aplicó el motivo de muestras de Gibbs para identificar regiones embrionarias para permitir una fácil
de novo
definición del motivo HNF4α (Fig. 3b).
a) motivos HNF4α en la zona de 1.000 pb planta de enriquecimiento (eN) la punta o centro de posiciones circundantes como se detectó con el partido, utilizando puntos de corte para minimizar los falsos positivos. La distancia del centro de motivos detectado a la posición del pico o centro de la ES se calculó. Un histograma se ha creado usando contenedores de 50 nucleótidos en torno a las posiciones del centro o pico. La línea azul muestra la desviación de HNF4α: motivos en relación con el centro de ES, la línea roja muestra la desviación con respecto a la posición del pico. b) ES HNF4α chip-chip para permitir una fácil
de novo predicción del motivo de unión HNF4α. Tras el análisis de la secuencia de las regiones enriquecidas por HNF4α chip-chip con Gibbs sampler motivo, el HNF4α-motivo se detectó en realidad dos veces, con el segundo motivo de la presentación de sólo la mitad de un sitio. c) Conservación de todos los sitios de unión HNF4α (línea azul). centros ES (azul) o posiciones de los picos (rojo) se ampliaron a 1.000 pb en ambas direcciones, y para cada nucleótido de la puntuación media de conservación, sobre la base de la información de alta calidad Phast Contras de la GoldenPath de Recursos del Genoma UCSC, se calculó. Las puntuaciones medias de conservación se representaron frente a la posición de los nucleótidos. Los análisis se realizaron con CEAS [43].
Para subrayar la importancia biológica de los sitios de unión identificado su conservación media se estudió también. Los nucleótidos en el centro, donde se puede esperar un sitio de unión, muestran una conservación de dos veces mayor que los que están en los extremos de la trama (fondo genómico) (Fig. 3c). Una vez más, cuando las regiones chip enriquecido fueron alineados por la posición del pico, el pico de conservación era aún mejor definida.
HNF4α se une predominantemente a elementos potenciadores
La distancia del sitio de unión HNF4α a la transcripción más cercano se determinó sitio de inicio (TSS) de un gen RefSeq. Aquí, se observó una sobrerrepresentación casi 5 veces de sitios de unión en la región promotora de -1.000-0 relación con el SAT (Fig. 4a, b). Sin embargo, sólo el 5,8% de todos los sitios de unión asignada a próxima al promotor regiones y 3,6% de todas las RefSeq promotores están obligados por HNF4α. Una falta similar y significativa de la preferencia por la unión a regiones promotoras-proximal 5 'había sido reportado para los factores de transcripción Sp1, P53, cMyc y ER [13], [8]. Mientras que algunos factores de transcripción E2F1 como muestran una clara preferencia por regiones 5 'del promotor proximal [14], la acumulación de pruebas es muy sugerente para las regiones promotoras-proximal al constituyen sólo una pequeña fracción de las secuencias reguladoras de genes de mamíferos. De hecho, algunos de los receptores nucleares muestran mayor actividad en potenciador lugar de unión del promotor sitios [13], [15]. En consecuencia, los estudios con matrices promotoras tienen un valor limitado.
a) Localización de sitios HNF4α relación con el SAT más cercano de los genes RefSeq unión en comparación con distribución aleatoria. Las regiones de 100.000 nucleótidos que rodean a cada TSS se dividieron en cubos de 5.000 nucleótidos, y se contó el número de sitios de unión en cada bin. b) Genómica distribución de sitios de unión HNF4α. El número de sitios de unión localizados en las regiones determinadas de genes RefSeq anotado se calculó mediante la CisGenome herramienta de software. TSSup1k: 1.000 pb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción (TSS); TESdown1k: 1.000 pb aguas abajo de un sitio final de la transcripción. c) La distribución de los sitios de unión HNF4α ubicados proximal a TSS, de RefSeq genes, en comparación con distribución aleatoria. Las regiones de 5.000 nucleótidos que rodean a cada TSS se dividieron en cubos de 200 nucleótidos, y se contó el número de sitios de unión en cada bin. d) sobrerrepresentación de HNF4α sitios en regiones proximales TSS aguas arriba y aguas abajo y en primera unión, segundo un terceros intrones de genes RefSeq anotado, con relación a un control de las regiones aleatorias. Las posiciones de TSS, primera, segunda y tercera intrones de genes RefSeq anotados fueron recuperados de UCSC, y se calculó el número de sitios de unión HNF4α situados en las regiones determinadas. TSSup600: 600 pb aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción; TSSdown600: 600 pb aguas abajo del sitio de inicio de transcripción; TSSup10k: 10.000 pb aguas arriba de un SST; TSSdown10k:. 10.000 pb aguas abajo de una TSS
Un análisis de la distribución de ES en 600 pb que rodea a la TSS proporcionan evidencia de unión preferencial en la región aguas arriba (figura 4c y d.). Sin embargo, a una distancia mayor que 800 pb de la TSS, más sitios de unión están situados aguas abajo. En particular, muchos factores de transcripción sitios de unión se encuentran en el primer intrón; el segundo pico se muestra en la Fig. 4c es debido a la unión de las regiones intrónicas. La frecuencia de los sitios de unión HNF4α en RefSeq anotado genes se analizó adicionalmente. Esto demuestra una sobrerrepresentación de ES en los primeros intrones, pero no tanto en la segunda o tercera (Fig. 4d).
Es importante destacar que un estudio reciente de HNF4α chip-chip de sugirió ES próxima al promotor se deben a interacciones indirectas de HNF4α con otros factores de transcripción [3]. En consecuencia, se desarrolló un modelo mediante el cual se une a HNF4α elementos potenciadores distantes y crea bucles de cromatina mediante la interacción con otros factores de transcripción del promotor de ruedas. Desafortunadamente, este modelo se basa en menos de 1% de las secuencias genómicas. Sobre la base de la amplia exploración del genoma informó en el presente documento HNF4α motivos en regiones promotoras-distal están sobrerrepresentados de unión en comparación con regiones promotoras-proximal (Fig. 5a), sin embargo, las regiones con bajo enriquecimiento muestran un porcentaje más alto de sitios de unión al promotor proximal de las regiones con alta enriquecimiento (Fig. 5b). regiones Posiblemente, HNF4α contactos próxima al promotor por la interacción física con otros factores de transcripción y por lo tanto muestra promotor, así como una actividad de unión al potenciador.
a) análisis de Bootstrapping HNF4α motivo de unión (matriz M01031) en el promotor proximal y promotor regiones distales. 100 ES-promotor proximal (-138 a -2 relación con el SAT) se compararon con 100 ES-promotor distal (-24,972 a -23.489 relación con el SAT) por la herramienta de análisis de programa previo POBO [48]. ES promotor proximal muestran un número significativamente menor de motivos HNF4α. b) ES (300 pb rodean la posición del pico) fueron ordenados por su valor P (calculado por el algoritmo MAT) y dividido en compartimientos de 1000 ES. Para cada bin se calcularon el número de motivo de los sucesos HNF4α y el porcentaje de ES promotor proximal. Como puede verse, ES con un alto valor P (débil ES) son más propensos a ser situada próxima al promotor, pero que no contienen motivo de unión HNF4α.
La distribución de ES identificados a través de los cromosomas variada & gt; 6 veces. Sorprendentemente, el cromosoma Y está desprovisto de HNF4α ES (Tabla S6) y la distribución cromosómica de ES no está distribuido al azar; más bien se forman grupos (Fig 6a;. Fig. 7). Estos grupos no están relacionadas con diferencias en la densidad de genes dentro de estas regiones, como se muestra para el cromosoma 10. La región con la mayor densidad de sitios de unión en el cromosoma 10 contiene dos grupos de sitios con el ACSL5 loci superposición y VTI1A1 (Fig unión. 6b ). Mediante la exploración de la secuencia genómica para las ventanas de 100.000 pares de bases que contienen sitios de unión ≥10 HNF4α, quince grupos podrían ser definidos (Tabla S7). De hecho, la mayoría de los potenciadores parecen ser promiscuos y por lo tanto regular múltiples genes [16]. Mientras potenciador de la actividad puede tener lugar durante cientos de kilobases [17] e incluso casos de regulación inter-cromosómicas por potenciadores se han comunicado [18], la mayoría son dentro de 100.000 pares de bases de sus respectivos TSS. Para definir mejor una posible enhanceosome para las secuencias de genes diana se seleccionaron más cerca de los genes RefSeq con un TSS separados por menos de 100.000 nucleótidos (Tabla S8).
a) La distribución de los sitios de unión HNF4α (gráfico de líneas púrpura, superior la mitad) se compara con la distribución de los genes conocidos en el cromosoma 10. las flechas verdes marcan dos regiones de genes que escasean en el que se encuentran eS. Las flechas rojas marcan dos regiones con un alto número de sitios de unión HNF4α y un bajo número de genes. Los análisis se realizaron utilizando la herramienta de Ensembl Karyoview (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview). b) Los grupos de HNF4α sitios en una región genómica de unión en el cromosoma 10 con alto contenido de sitios de unión (la región marcada por la segunda flecha roja en a)). Los sitios de unión identificados en este estudio, que aparecen como picos azules en la mitad superior, se presentan usando el navegador genoma IGB. Los sitios de unión se distribuyen en dos grupos en torno al sitio de inicio de transcripción del locus ACSL5 y en la región 3 'del locus VTI1A.
Cada cromosoma se divide en 150'
contenedores
', y dentro de cada bin se contó el número de ES. En el gráfico de líneas azul, el número de sitios de unión dentro de cada bin HNF4α se representa como un único punto de datos. Debajo de cada cromosoma se da el número mínimo y máximo de sitios de unión localizados en un solo contenedor. Los análisis se realizaron utilizando la herramienta de Ensembl Karyoview (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview).
HNF4α factor de transcripción diafonía
Para buscar factor de transcripción diafonía se consideraron las regiones de la viruta por motivos excesivamente. Entre los motivos con el más alto enriquecimiento son matrices similares a la HNF4α motivo de unión, por ejemplo, los de COUP-TF, PPAR o LEF1 (Fig. 8, Tablas S3, S4, S5). Estos factores de transcripción son conocidos para competir con HNF4α para los sitios comunes de unión [19] - [21]. Sin embargo, muchos motivos diferentes a HNF4α, por ejemplo, los motivos de unión para HNF1α, AP1 o factores de transcripción GATA, también fueron significativamente enriquecido. Si estos factores actúan en común con HNF4α, se podría esperar que la frecuencia de sus motivos aumenta con la disminución de la distancia de los sitios de unión HNF4α. Por lo tanto, se analizó la frecuencia de tales motivos en relación con los sitios de unión HNF4α (Fig. 9a y 9b). El enriquecimiento de estos motivos se restringe a una región de unos pocos cientos de pares de bases alrededor de la posición del pico, por lo tanto el apoyo a la idea de que son parte de un enhanceosome definido por HNF4α. Además de un aumento en la frecuencia de los motivos de unión de AP1, GATA, ER y HNF1α se observó una relación inversa entre HNF4α y los motivos de la compra, pero no había ninguna relación con SREBP1 (Fig. 9a). Es tentador especular que esto es de importancia regulatoria para HNF4α. Otros motivos analizados mostraron sólo una ligera correlación entre el número de motivos y la distancia a la posición del pico, a pesar de que estaban claramente enriquecido en regiones chip (por ejemplo, USF, CREB, HNF6).
Los 10.000 CHIP- más significativo regiones enriquecidas se analizaron para motivos excesivamente mediante el uso de la herramienta de CEAS [43]. Se muestra son los 10 motivos con el enriquecimiento más significativo, mientras motivos redundantes (es decir, múltiples motivos para el mismo factor de transcripción) se retiraron. La similitud o disimilitud de los motivos se visualiza mediante el uso de WebLogo representación (http://weblogo.berkeley.edu/). motivo de análisis de enriquecimiento con Genomatix RegionMiner y coincidir [11] se encuentran en las Tablas S3, S4, S5.
a) posiciones de los picos (representado como 0) se ampliaron a 500 pb en ambas direcciones, y motivos fueron detectados mediante el uso del algoritmo PARTIDO [11] utilizando criterios de corte para minimizar la suma de los falsos positivos y falsos negativos. Regiones se dividen en segmentos en contenedores de 25 pb, y se contó el número de ocurrencias de los diferentes motivos dentro de cada intervalo. b) Parcela de la distancia relativa de los motivos HNF4α a otros motivos enriquecido en la región chip. Dentro de las regiones de chip los motivos HNF4α más conservados, donde se identificaron. Las secuencias de los 500 nucleótidos que rodean estos motivos HNF4α más conservadas donde recuperados y analizados para aquellos motivos de otra TF que también se enriquecieron en las regiones chip. Entonces, la distancia entre estos motivos y el motivo HNF4α se calculó utilizando CisGenome por motivo de la detección y se representa como histograma utilizando contenedores de 20 pb. El motivo HNF4α se encuentra en el centro, que va desde pb -6 a 6 pb. HNF4α y ER comparten sitios de unión comunes y superpuestos. c) Indicación de la superposición entre los motivos de unión de HNF4α y el receptor de estrógeno (ER) mediante el uso de ilustraciones WebLogo. Ambos motivos muestran una superposición parcial. d) La superposición entre los sitios de unión ER y sitios de unión HNF4α. El alto rigor conjunto de sitios de unión de ER identificados por el chip-chip de [13] se obtuvo. El porcentaje de sitios de unión de ER identificados en este estudio y también obligados por HNF4α se muestra en un gráfico de barras. Se determinó la superposición de sitios de unión ER con regiones de control al azar.
La alta similitud de secuencia de los sitios para HNF4α y receptor de estrógeno (ER) de unión es de considerable importancia (Fig. 9c). A fin de analizar la probabilidad de co-ocupación de motivos enriquecidas los sitios de unión HNF4α se determinaron exactamente mediante el análisis motivo. La posición genómica de la más alta puntuación HNF4α motivo dentro de las regiones de chip se recuperó y se extendió a 500 nucleótidos de las secuencias flanqueantes izquierda y derecha. Dentro de estas secuencias, se detectaron otros motivos enriquecidas y se calculó la distancia al motivo HNF4α (Fig. 9b). Como era de esperar, la mayoría ER motivos co-localizar en HNF4α ES causando un pico alto en el centro. Por el contrario, HNF1α, AP1 y GATA motivos visualizar el enriquecimiento a una distancia de 20 a 60 nucleótidos al motivo HNF4α. También hay un enriquecimiento de los sitios de unión HNF4α menos conservadas en las proximidades de la más alta puntuación motivo HNF4α. Esta sobrerrepresentación de los motivos HNF4α menos conservadas puede jugar un papel en el aumento de la probabilidad de HNF4α vinculante en el contexto local secuencia que rodea el sitio de unión.
A medida que el motivo de ER se superpone parcialmente con el motivo HNF4α, es tentador especular que tal enriquecimiento dentro de las regiones chip es debido a una conexión funcional entre los dos factores. Recientemente, se informó de un mapa de todo el genoma de los sitios de unión de ER [13]. Por lo tanto se analizaron los datos para los sitios de ER y HNF4α y se encontró que se superponen considerablemente (Fig. 9d). Utilizando cualquiera de la rigurosidad alta o baja conjunto de sitios HNF4α o ER de unión de hasta aproximadamente 15% de los sitios de unión de ER también fueron objeto de HNF4α, apoyando así la idea de la cooperación entre HNF4α y el receptor nuclear ER. Es importante destacar que varias investigaciones independientes informan sinergismo en la actividad del factor de transcripción de HNF4α y ER en la regulación génica de, por ejemplo, la apolipoproteína A1, apoVLDII y el pequeño socio heterodímero.
Una exploración de todo el genoma revela la función principal de HNF4α
los datos del presente estudio se comparó con los datos publicados con el fin de identificar las regiones que se solapan entre estos estudios (Fig. 10). De los 194 ES reportados dentro de las regiones ENCODE [3], 76 se superponen con los hallazgos del presente estudio. Desafortunadamente, las regiones ENCODE comprenden 1% de solamente todo el genoma. Además, en un estudio se centró promotor [4] se informó de 1.553 secuencias de destino a los hepatocitos. En el presente estudio y mediante la selección de secuencia de las regiones comparables de un total de 575 sitios de unión podría ser investigado. De estos, 200 sitios de unión estaban en común, por lo tanto volver a confirmar 13% de los sitios de unión del promotor propuestos. Por otra parte, el mismo investigador informó ES de islotes pancreáticos pero sólo el 9% se pudo confirmar en el presente estudio con el ADN IP desde la línea de células Caco-2. Tales diferencias pueden surgir de las diferentes protocolos experimentales y las diferencias en los tipos de células.
Porcentaje de sitios de unión identificados por HNF4α Rada-Iglesias et al. [3] o Odom et al. [4], que podría ser confirmada en este estudio. Para Rada-Iglesias et al. se utilizó un grupo control de secuencias genómicas aleatorias para calcular la superposición aleatoria. Para Odom et al., Un grupo de control se crea seleccionando al azar un número de regiones promotoras de la matriz Huk13 utilizado en su estudio, igual al número de promotores que detectan como estar limitado por la HNF4α.
ontologías biológicas de
de novo
identificaron genes blancos HNF4α
sobre la base de la ontología de genes
de novo
genes identificados fueron agrupados (Tabla S9). Muchos de los genes específicos están involucrados en diferentes procesos metabólicos, por ejemplo, lípidos, ácido orgánico o metabolismo de los carbohidratos. Categorías relacionadas con el transporte, el transporte de lípidos es decir, tenían una representación significativa como fue el ácido graso y el metabolismo del colesterol [1], [22]. Además, se identificaron muchos genes para el desarrollo y la diferenciación, por lo tanto el papel de tranquilizar HNF4α en desarrollo [23] y la diferenciación epitelial [22], [24] - [26]. Esta proteína también controla la ruta de secreción de insulina [27] y está ligada a la enfermedad monogénica rara, es decir, la diabetes de aparición de madurez de los jóvenes (MODY) [28]. Por lo tanto, los genes blanco de HNF4α en la vía de señalización de la insulina, así como tal en relación con la actividad de la muerte celular y supresor de tumores fueron identificados [29]
Definición de los sitios de unión funcional -. Correlación entre HNF4α chip-chip y todo el genoma datos de expresión génica
un enfoque común para identificar los genes dirigidos por un factor de transcripción es determinar la abundancia de ARNm causada por su aumentado o disminuido la actividad transcripcional como investigado en el riñón embrionario humano (HEK293 [30]) y células de hepatoma (HUH7 [31], HepG2 [32]). Sorprendentemente, los experimentos de transfección HNF4α influenciados transcripción de un pequeño número de genes únicos. Aunque se sabe que la regulación transcripcional no está mediada a nivel de la unión al ADN por sí sola [33] en tales experimentos mayoría de los factores de transcripción se unen bajo condiciones no activantes ''. Para confirmar los sitios de unión funcionales de
de novo
identificados objetivos de genes HNF4α, los cultivos de células Caco-2 fueron tratados con un inductor de la proteína HNF4α [34]. Después del tratamiento de células Caco-2 con Aroclor 1254, unión de la proteína HNF4α a la
HNF1α
promotor se incrementó [7], mientras que la inducción de la proteína se confirmó por experimentos de transferencia Western (Fig. 11). Los cultivos tratados Aroclor 1254 se sometieron a escala del genoma de perfiles de transcripción. El uso de criterios estrictos, 536 genes únicos RefSeq anotado se definieron como expresados diferencialmente (Tabla S10). De estos, 383 genes fueron reguladas y 153 regulados hacia abajo. Las secuencias promotoras de genes regulados se analizaron para los sitios de unión HNF4α y se comparan con la lista de objetivos de genes chip-chip recientemente identificados. Un solapamiento del 63% o 336 genes expresados diferencialmente (Tabla S11) fueron identificados como objetivos de genes HNF4α, confirmando así la importancia funcional de los ES identificados en el ensayo de chip-chip.
a) HNF4α Western Blot de 20 g Caco-2 extracto de células. Una clara inducción de la expresión de la proteína HNF4α fue visto después de 48 h y 72 h de tratamiento Aroclor1254. b) Ensayos de movilidad electroforética con extracto nuclear 2,5 g Caco-2 células y oligonucleótidos correspondientes a la A-sitio del promotor HNF1α (HNF1pro) como sonda marcada con 32P. En supershift ensayos de un anticuerpo dirigido contra HNF4α (+) se añadió. La unión de HNF4α se incrementó significativamente después de 72 h de inducción Aroclor1254.
Finalmente, los datos publicados sobre HNF4α sobreexpresan líneas celulares de mamífero se comparó con los datos del presente estudio. La superposición varió desde 65 hasta 94% de los genes identificados (Tabla S10). Es importante destacar que, se obtuvo el mayor solapamiento en los estudios que emplearon knock-down siRNA experimentos para validar sus hallazgos [32]. Por lo tanto, los objetivos de genes observadas podrían considerarse más fiable.
Discusión
En el pasado, la investigación sobre los factores que actúan en trans y sus correspondientes
cis
-elementos se centró en el promotor -proximal sitios de unión. Con el desarrollo de ensayos de chip-chip, todo el genoma explora para los sitios de unión del factor de transcripción se convirtió en factible. Esto mejoró considerablemente la comprensión de los mecanismos básicos de control de la transcripción y una identificación de sitios de unión del promotor distal que facilitan el procesamiento de eventos de ARN.
En el presente estudio, un mapa de todo el genoma de los sitios de unión HNF4α se construyó. Esta proteína juega un papel esencial en el desarrollo del hígado, y su papel regulador maestro en el mantenimiento de la competencia metabólica del hígado ha estimulado la investigación en HNF4α dirigido terapias contra el cáncer por su capacidad para revertir el cáncer de hígado a un fenotipo menos agresivo [35].
las evidencias actuales de estudio & gt; 90% de los sitios de unión HNF4α que se encuentra en regiones promotoras-distal y esta distribución de eS es similar a la reportada para el ER [13]. Cabe destacar que, con la excepción de las regiones a menos de 600 pares de bases a la TSS, sitios de unión fueron más frecuentemente aguas abajo. Por lo tanto, los ensayos de chip-chip centrados en regiones promotoras única [4], [36] podrían perder la mayoría de los sitios de unión.
Por otra parte, un análisis de los motivos HNF4α dentro de las regiones de chip enriquecida demuestra tan alto como en la precisión