Extracto
Aplicaciones
El objetivo de este estudio fue utilizar la colaboración de la enzima basada en la proteómica Enhanced reactiva (CEER) inmunoensayo para investigar fosforilaciones de proteínas tirosina como marcadores de diagnóstico en el cáncer gástrico (GC ).
Diseño Experimental
proteína lisados de fresco congelado 434 GC en etapa avanzada se analizaron para determinar la fosforilación de HER1, HER2, p95HER2, HER3, CMET, IGF1R y PI3K. Los patrones de activación de la vía fueron segregados en función del estado de HER2 del tumor. La agrupación jerárquica se utilizó para determinar coactivations vía en GC. Valor pronóstico de los patrones de activación de la vía se determinó mediante la correlación de los tiempos de supervivencia libre de enfermedad de los distintos subgrupos de GC utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. CEER también se utilizó para determinar la presencia de tirosina fosforilada cascadas de señalización en las células tumorales (CTC) y las células tumorales de ascitis (ATCs) circulante.
Resultados
Uso de un inmunoensayo de nuevos diagnósticos, CEER, nos demostrar la presencia de p95HER2 y vías de señalización activadas de forma concomitante en los tejidos tumorales de GC, CTC y ATCs aisladas de pacientes GC por primera vez. p95HER2 se expresa en ~77% de HER2 GCs (+). Aproximadamente el 54% de GC tiene un activado HER1, HER2, HER3, cMet o IGF1R y demostrar un peor pronóstico que aquellos en los que no se activan estos receptores tirosina quinasas (RTK). La agrupación jerárquica de las RTK revela co-agrupación de HER1 fosforilada: CMET, HER2: HER3 y IGF1R-PI3K. Co-activación de HER1 con Cmet hace que los GC con una supervivencia libre de enfermedad en comparación con sólo Cmet activa GC.
Conclusiones
Nuestro estudio pone de manifiesto la utilidad de una nueva tecnología de diagnosis de compañía, que tiene CEER fuertes implicaciones para el desarrollo de fármacos y la monitorización terapéutica. CEER se utiliza para proporcionar una mayor comprensión de las vías de señalización activadas en GC avanzadas que pueden mejorar significativamente su manejo clínico del paciente a través de la selección precisa de terapias dirigidas
Visto:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) Una base-Proteómica nuevos diagnósticos clínicos Tecnología Identifica heterogeneidad en Activado vías de señalización en cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644
Editor: Anthony W. I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 20 Septiembre, 2012; Aceptado: 13 de diciembre de 2012; Publicado: 25 Enero 2013
Copyright: © 2013 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Mientras PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL y SS se emplean por Prometheus Laboratories, esto no altera los autores adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
agentes dirigidos molecularmente han acelerado el campo de la oncología. Dado que aproximadamente la mitad de la componente de la tirosina quinasa de la kinome humana está implicada en cánceres humanos, no es sorprendente que una gran proporción de los agentes terapéuticos actuales atacan varias quinasas [1], [2]. Coactivación de receptores tirosina quinasas (RTK) se ha observado en subconjuntos de múltiples tipos de cáncer tales como el glioblastoma multiforme [3], cáncer de mama [2], [4], [5], [6], [7], cáncer de pulmón [8 ], [9], cáncer de cabeza y cuello [7] y el cáncer gástrico [4], [5], [6] implicando así como necesaria para la progresión tumoral y la supervivencia. Estas observaciones proporcionan suficiente justificación clínica para la detección de las RTK se activan en los cánceres que se podrían orientar el enfoque terapéutico y potencialmente proporcionar el conocimiento de las estrategias terapéuticas racionales combinatorias. Sin embargo, simplemente el análisis de la expresión o activación de estado de un solo RTK que puede ser la proteína diana específica para un terapéutico particular es insuficiente para seleccionar a los pacientes como a menudo los pacientes no responden a terapias a pesar de la expresión de la diana. Varios problemas potenciales podrían ser responsables de tal falta de beneficio terapéutico de agentes dirigidos, por ejemplo, 1) la activación concomitante de vías paralelas o alternativas que evitan la proteína (s) previstos inicialmente, y 2) la continua alteración en las características moleculares y patológicos de neoplásico tejidos durante la progresión del cáncer. Por lo tanto, sería ideal disponer de una herramienta de diagnóstico compañero que se podría aplicar en cantidades limitadas de muestras clínicas para capturar la complejidad global de las redes de señalización fosforilados en el tejido neoplásico, además de la diana directa de proteínas RTK para controlar la enfermedad "evolución" .
Targeted análisis de la fosforilación de muestras clínicas se ha visto obstaculizada debido a la falta de ensayos clínicos fácilmente utilizables que son lo suficientemente sensibles como para funcionar en cantidades limitadas de tejidos clínicos. Hemos informado anteriormente el desarrollo de un nuevo inmunoensayo basado en la proximidad, Collaborative Enzyme mejorada reactiva-inmunoensayo (CEER; Figura S1) [6], que es adecuado para el análisis tanto de la expresión total y estado de activación de señalización de la proteína cascadas. CEER se puede realizar de una manera multiplexada directamente en muestras clínicas que pueden estar disponibles en cantidades limitadas. El ensayo CEER utiliza la formación de un inmuno-complejo que requiere la co-localización de dos detectores de la enzima conjugada con anticuerpos una vez que las proteínas diana han sido capturados en un microarray único. Este formato permite la detección eficaz y sensible de las RTK, así como las proteínas de la ruta aguas abajo hasta el nivel de una sola célula (una sensibilidad de aproximadamente 100 zeptomoles). En este estudio hemos utilizado el ensayo CEER para estudiar la complejidad vía de señalización en el cáncer gástrico (CG).
GC son la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo con una incidencia de 18,9 /100.000 casos por año y una mortalidad tasa de 14,7 /100.000 por año [10] y son la neoplasia maligna más común en Corea [11]. GC metastásico sigue siendo un reto terapéutico para los oncólogos médicos debido a su mal pronóstico. Actualmente, trastuzumab es el único agente dirigido activo que ha demostrado ser eficaz para la GC en una fase III ensayo aleatorio [12]. Mientras que la activación de varios RTK se ha informado en los GC, su impacto en el pronóstico GC es desconocido. Esto es importante para el desarrollo y aplicación de la terapéutica para el manejo clínico de los GC.
En este estudio, hemos utilizado la plataforma CEER multiplexado para determinar los niveles de RTK activados (HER1, HER2, variantes truncadas de HER2, es decir, p95HER2, HER3, CMET, PI3K, y IGF1R) en 434 GC tejidos congelados frescos y trató de clasificar a los pacientes en subgrupos GC potenciales basándose en sus patrones de activación vía de la proteína. Hemos observado varias activaciones de proteínas de señal en los subgrupos de tumores GC que se correlacionan con la supervivencia libre de enfermedad (DFS) en estos pacientes. Por lo tanto, la hipótesis de que la activación de la vía entradas redundantes podrían conducir a la señalización aguas abajo residual en los GC, lo que limita la eficacia antitumoral de las monoterapias individuales dirigidos contra los RTK. Finalmente, se ha desarrollado una metodología potencialmente poderosa que puede permitir a los médicos para controlar la línea de base y en evolución alteraciones en los perfiles de activación de RTK tumorales en el curso de un tratamiento con células circulantes tumorales (CTC) y las células malignas aisladas a partir de fluido peritoneal (células tumorales de ascitis o ATCs ). Tomados en conjunto, nuestro estudio proporciona evidencia de activación de RTK concomitante en los tejidos humanos GC además de establecer CEER como una herramienta clínica eficiente para diagnosticar y controlar la activación de RTK durante el tratamiento GC o progresión de la enfermedad.
Materiales y Métodos
Pacientes cohorte y muestra de tejido de adquisiciones
el estudio se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Samsung (SMC IRB) de suspensión consentimiento informado utilizando tejidos de archivos con datos clínicos retrospectivos. Las muestras de tumores primarios fueron recogidos de Samsung Medical Center. Todos los pacientes fueron sometidos a una gastrectomía radical con disección de los ganglios linfáticos con intención curativa. Entre marzo de 2001 febrero de 2005, 447 tejidos frescos congelados obtenidos de 434 pacientes se obtuvieron de los tumores gástricos primarios resecado quirúrgicamente y estaban disponibles para el análisis final. Todos los tejidos congelados frescos se recogieron (a menos de & lt; 30 minutos) en el campo quirúrgico e inmediatamente se congelaron rápidamente y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior. las muestras de tumor se confirmó la presencia de & gt; 70% área del tumor por el patólogo. Para el análisis, pequeños trozos de tejidos congelados (10 micras sección X 3) se prepararon usando hoja de afeitar previamente enfriada y se lisaron en 100 l de tampón de lisis. Los lisados resultantes fueron almacenadas a -80 ° C hasta su posterior análisis
Histopatología Revisión y determinación de la condición de HER2
Todos H & amp disponibles;. Portaobjetos teñidos-E fueron revisados centralmente por dos patólogos (ID, KKM ) en el núcleo de patología experimental del Instituto de Investigación del cáncer de Samsung. Todas las muestras tumorales fueron de tumores gástricos primarios resecado quirúrgicamente. El estado de HER2 se determinó por IHC y FISH. análisis IHC se realizó con el HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Dinamarca). proteína HER2 niveles de expresión se calificaron como 0 a 3+, de acuerdo con las recomendaciones del panel de consenso sobre HER2 que califican para GC [13], [14]. Para el pescado, se utilizó el kit de sondas de ADN PathVysion HER2 (Abbott, Des Plaines, IL). sistema de análisis de imágenes Ariol se utiliza para contar las señales de hibridación (Genetix, San José, EE.UU.). Todas las muestras con proporciones de HER2 /CEP17 entre 1,8 y 2,2 se calificaron manualmente contando más de 60 células que no se solapan. Las relaciones de & gt; 2.2, 1.8 y 2.2, o & lt; 1,8 se clasificaron como positivos, equívoca, o negativo para la amplificación, respectivamente. Cromosómico 17 polysomy se definió como una señal CEP17 que tenía más de seis copias en promedio por célula. De las 447 muestras, 434 muestras se incluyeron en el análisis final.
Colaboración mejorada de la enzima reactiva-inmunoensayo (CEER)
Se imprimieron diapositivas CEER, se incubaron con lisados GC y procesada como se describe anteriormente [ ,,,0],6]. Las láminas fueron explorados en cuatro configuraciones fotomultiplicador (PMT) de ganancia para aumentar el rango dinámico efectivo. Los datos se ajustaron a una ecuación de cinco parámetros derivada como una función de la concentración de anticuerpo de captura y PMT y se presentan en unidades computarizada (CU).
Luz y multiplexado-microarrays.
se imprimieron anticuerpos de captura nitrocelulosa sobre portaobjetos de vidrio recubierto de (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) utilizando impresoras sin contacto (Nanoplotter, GESIM). El diámetro del punto fue de aproximadamente 175 micras. Los portaobjetos se mantuvo en una cámara desecado a 4 ° C. Aproximadamente 500 pL de captura Abs fueron impresas por triplicado a concentraciones de dilución en serie de 1 mg /ml, 0,5 mg /ml, y 0,25 mg /mL. Purificada ratón-IgG sirvió como controles negativos. configuraciones de diapositivas Immuno-matriz se muestran en la Figura S1.
conjugación de anticuerpos y la purificación.
target-específico (monoclonal de ratón contra epítopos específicos de las proteínas de transducción de señales humanos) anticuerpos y las enzimas de detectores correspondientes, glucosa oxidasa (GO) o peroxidasa de rábano picante (HRP), se activaron con bi-funcional reticulante, succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de etilo (SMCC), y se acoplan produciendo conjugados anticuerpo-enzima. Los conjugados se purificaron por HPLC. actividad de los anticuerpos en los conjugados purificados se determinaron mediante ELISA de competición y las actividades enzimáticas de post-Conjugación fueron detectados por ensayos funcionales específicos para cada enzima detector.
ensayos CEER.
diapositivas Inmuno-microarrays se aclararon 2X con TBST (Tris 50 mM /NaCl 150 mM /0,1% de Tween-20, pH 7.2 a 7.4), se bloquearon con 80 l Whatman tampón de bloqueo durante 1 hora a TA, luego se lavó 2 veces con TBST. Diluyeron en serie los controles de lisados o muestras en tampón de dilución de 80 l (2% de BSA /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7.2 a 7.4) se añadieron a sub-series designadas en portaobjetos y se incubó durante 1 hora a TA. Los portaobjetos se lavaron 4X (3 min. Cada uno), y el detector Abs se añadieron en 80 l de tampón de reacción y se incubó durante 2 horas a TA. Después de lavar las diapositivas con TBST para eliminar Abs detector no unida, 80 l de solución de biotina-tiramida (5 mg /ml en glucosa 50 mM /PBS) preparado a partir de 400 mg /ml en solución de etanol (Perkin-Elmer Life Science) y se incubó durante 15 minutos en oscuridad. proceso de amplificación de la señal mediada por tiramida HRP GO /se terminó mediante lavado con TBST 4X, 3 minutos cada uno. deposición local de biotina-tiramida se detectó por incubación con estreptavidina (SA) -Alexa647 (Invitrogen) a 0,5 mg /ml en 2% de BSA /0,1% de Triton /TBS durante 40 min. Al término de la incubación, los portaobjetos se lavaron 4 veces con TBST, se secan y se mantuvieron en la oscuridad hasta que se obtuvieron imágenes a través de un escáner de microarrays.
Para el análisis de los datos CEER, diapositivas escaneadas con cuatro ajustes de ganancia PMT para aumentar la dinámica efectiva distancia. Antecedentes corregido intensidades de señal se promediaron para los puntos impresos por triplicado. Varios criterios se utilizan para filtrar datos para su posterior análisis, incluidos los límites de huellas punto, coeficiente de variación de las réplicas punto, y el fondo general de la almohadilla. Para cada ensayo, una curva patrón se generó a partir de lisados de células de control en serie diluidas preparadas a partir de líneas celulares con las proteínas de transducción de señales bien caracterizados. Los datos se ajustaron a una ecuación de cinco parámetro derivado como una función de la concentración de anticuerpo de captura y PMT. La curva estándar para cada marcador se ajusta como una función de intensidad de la señal de registro, medido como unidad de fluorescencia relativa (RFU) frente a la concentración log de los lisados celulares y se hace referencia a las líneas celulares estándar. Por ejemplo, se utilizó curva estándar de lisados de células diluidas en serie preparadas a partir de BT474 para normalizar la expresión de HER2 y el grado de fosforilación en cada muestra (Figura S2). Por lo tanto, una muestra con 1 CU de expresión HER2 tiene el valor RFU equivalente al valor de RFU 1 de células BT474 de referencia estándar. Como las células de referencia tienen 1~2 × 10
6 HER1 o HER2 receptores por célula con receptores fosforilados aproximadamente el 10%, 1 UC representa la expresión de 1~2 × 10
6 RTK o 1~2 × 10
5 RTK fosforilados [6]. El límite de detección del valor (LOD) por CU se determinó que era de menos de 1 CU tanto para la expresión y la activación de HER2. predicciones individuales de cada dilución y la ganancia se promediaron en una única predicción, final.
truncado HER2 enriquecimiento
De larga duración receptores HER2-p185 se agotaron a partir de lisados de tejidos tumorales usando anticuerpos magnética con perlas acopladas específica al dominio extracelular (ECD) de HER2 tal como se muestra en la Figura S3. Resultando p185-HER2 lisados agotados, que contenía proteínas enriquecidas receptor truncado HER2 (t-HER2) que carecen de la ECD, se utilizaron para la posterior cuantificación de la expresión de t-HER2 y la fosforilación utilizando los ensayos CEER respectivos. Un valor de corte de 500 CU se utilizó para anotar para p95HER2 positividad por 20 g de tejido analizado. La lectura total del ensayo fue p95HER2 en relación con las señales generadas a partir de las curvas de calibración generadas usando un lisado celular de control de la línea celular de cáncer de mama BT474.
Cultivo de células y reactivos
líneas celulares de control de ensayo CEER , MDA-MB-468, T47D, HCC827 y células BT474 con diversos grados de expresión de ErbB-RTK se obtuvieron de ATCC y se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2 - para MDA-MB-468 (de mínimo esencial Dulbecco medio (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), y HCC827 y T47D (RPMI 1640 + 10% de FBS, 0,2 U de insulina bovina /ml). Se contaron las células y se lavaron con 1 x PBS antes de la estimulación del factor de crecimiento. células MDA-MB-468 se estimularon con 100 nM de factor de crecimiento epidérmico (EGF) o factor de crecimiento transformante a (TGF?), las células T47D se estimularon con 20 nM de herregulina β (HRGβ) o 100 ng /ml de factor-1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1) en medio de crecimiento libre de suero durante 5 o 15 min. células estimuladas se lavaron con 1 x PBS y después se lisaron (tampón de lisis: Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100 y Na 2 mM
3Vo
4) y se mantuvieron en hielo durante 30 minutos antes de tomar el sobrenadante para un ensayo posterior o se mantiene a -80 ° C.
determinación de los marcadores de CEER y el mapa de la agrupación de calor
positividad para un marcador biológico determinado se definió
como mayor que el tercer cuartil para un biomarcador individual en la población de pacientes de este estudio. Los pacientes se clasificaron en base al valor CU a partir del ensayo CEER para un biomarcador dado. Aquellos pacientes mayores que el tercero de corte cuartil se consideraron en riesgo más alto de tener los niveles de biomarcadores elevados y las vías de señal, por lo tanto potencialmente activados. El análisis posterior supervivencia se realizó para evaluar la calidad predicativo de estos puntos de corte.
El perfil de biomarcador de las muestras tumorales fue representado por un mapa de calor. Cada célula fue coloreada basado en el rango decil de la activación de ese marcador. Cada marcador se clasificó por deciles, representado por un color diferente, con la escala que indica el color. Ambos se demostró la fila (paciente) y la columna de agrupación (marcador). El algoritmo de vinculación completa se utilizó para obtener un agrupamiento jerárquico (o dendrograma) agrupando secuencialmente las observaciones más correlacionados con la función hclust en R, llamada por la función heatmap.2 disponible con la biblioteca gplots del entorno estadístico R: un idioma y Medio Ambiente para la Computación de estadística (http://www.r-project.org/). Los subgrupos de marcadores fueron definidos por la agrupación que permitió la comparación de perfiles de los marcadores para los pacientes.
ATC CTC y el aislamiento
Para la evaluación de CTC, 7,5 ml de muestras de sangre fueron extraídas en etilendiamina evacuadas de 10 ml ácido tetraacético (EDTA) tubos. El Sistema CellSearch (Veridex) se utilizó para el aislamiento CTC inmuno-magnética de acuerdo con el protocolo descrito previamente [6] con ferrofluidos conjugados con Ab contra la molécula de adhesión de células epiteliales. Para la evaluación ATC, los contenidos celulares se enriquecieron de 50 a 100 ml de líquido ascítico por centrifugación y el aislamiento de células tumorales inmuno-magnética se realizó de una manera similar. Distintos conjuntos de ATC fueron tratados con un cóctel de factores de crecimiento (EGF, HRG, HGF y IGF-1), con o sin lapatinib y PHA-665752 combinación de inhibidores.
Resultados y Discusión
Características de los pacientes
Características de los 434 pacientes del GC se proporcionan en la Tabla 1. Todos los pacientes recibieron gastrectomía D2 con disección de ganglios linfáticos con 242 (55,8%) pacientes tratados con gastrectomía subtotal. De acuerdo con un sistema de estadificación AJCC 2002, 86 pacientes tenían patológica en estadio I, 116 tenían la etapa II, 126 tenían en estadio III y IV 106 en estadio (35 pacientes con metástasis M1) GC. En el momento de análisis, 226 pacientes habían muerto y 237 pacientes habían documentado recurrencia. 70 pacientes tenían carcinoma de células en anillo de sello. El total de 5 años y las tasas de supervivencia libre de enfermedad fueron 52,4% y 50,0%, respectivamente. Todos los tejidos GC primarios se adquirieron en el momento de la cirugía e inmediatamente se congelaron para el análisis molecular futuro.
ensayos basados en CEER revelan heterogeneidad en la expresión de HER2 y la presencia de HER2 variante truncada, p95HER2, en HER2 ( +) cánceres gástricos
Hemos informado anteriormente el desarrollo de ensayos basados CEER inmuno-microarrays [6], [15]. Se utilizó el ensayo de HER2 basado en el CEER para investigar el estado de HER2 de las HER2 (+) y HER2 - muestras en nuestra cohorte de pacientes que fueron segregados GC basado en el estándar IHC HercepTest /análisis FISH (). La ventaja de los ensayos basados en CEER es su mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los ensayos de [6] basados en IHC. Sobre la base de las definiciones de los GC actual HER2 (+) [13], [14], es decir, las muestras con una puntuación HER2 IHC 3+ o 2+ y una positiva
HER2
estado de amplificación génica, 50 de 434 (11,5%) muestras en nuestra cohorte de pacientes GC eran HER2 (+) por IHC HercepTest /análisis FISH (Tabla S1). En contraste, de acuerdo con las directrices de IHC específicas para los cánceres de mama, sólo el 78% (39/50) de estos pacientes eran HER2 (+) (Tabla S1) que indica las diferencias en los criterios de puntuación para la positividad HER2 entre cáncer gástrico y de mama. La mayoría de los GCs HER2 (+) (36 de un total de 50 muestras (72%)) eran del subtipo intestinal en lugar de los GCs difusas o tipo mixto de acuerdo con informes publicados [13], [16], [17].
ensayo HER2 basado en CEER demostraron sustancialmente más altos niveles de expresión de HER2 en IHC /FISH HER2 (+) tumores en comparación con los de la HER2 (-) tumores (con un valor medio de 77,9 CU vs. 4,3 CU, 8.18E-10 p-valor) como se muestra en la Figura 1A. Los datos HER2 basado en el CEER se presenta en CU, una unidad funcional estándar basado en la línea celular controla la expresión de HER2 conocida [6], que permite la comparación de la expresión de HER2 través de muestras. Sólo 32/50 o 64% de IHC /FISH HER2 (+) GC demostró la expresión de HER2 por CEER y había un nivel significativo de heterogeneidad en la expresión de HER2 en estas muestras según lo revelado por las lecturas CEER cuantitativos. La heterogeneidad en la expresión de HER2 puede explicar la razón por sólo un moderado grado de concordancia (87,5%) entre la IHC y FISH lecturas de HER2 en el ensayo ToGA [12]. Esta discrepancia podría afectar directamente el resultado de la terapéutica de HER2, tal como trastuzumab en GC. Por otra parte, debido a la alta sensibilidad del ensayo CEER, se observó que ~ 20% de la IHC /FISH HER2 (-) GCs todavía expresa HER2 total de aunque a niveles claramente más bajos que el HER2 (+) población de pacientes
.
(a) distribución de CU para la expresión de HER2 de muestras GC en 0.25 g lisado. El
x
eje x representa el estado de IHC /FISH, y el
y
eje x representa los valores de CU de ensayo CEER como se determina a partir de una curva estándar BT474. La separación se ilustra entre los dos grupos con una media de 0 para el /la población IHC FISH negativo (384 de 434) en comparación con una mediana de 11 para el /la población positiva FISH IHC (50 de 434). Una muestra saturada, por encima del límite de cuantificación y se indica como "Número saturado 'en la tabla correspondiente, no se muestra. Las cajas representan el rango intercuartílico, con el 75 por ciento en la parte superior y el percentil 25 en la parte inferior. La línea en el medio de la caja representa la mediana. Las marcas se prolongan hasta el valor más alto y el más bajo a menos de 1,5 veces el rango intercuartil.
P
valor & lt; 0,001 se determinó mediante los signos de Wilcoxon prueba. (B) la distribución de CU para p95HER2 en un subconjunto de las muestras de tumores (58 de 434) en 20 g de lisado. El
x
eje x representa el estado de IHC, y el
y
eje x representa los valores de CU de ensayo CEER para p95. de longitud completa HER2 se eliminó por inmuno-agotamiento antes del ensayo. Los puntos de datos son de color en función del estado de HER2 por IHC y FISH. Como se muestra, se determinó un punto de datos con una IHC de 2 a ser positiva mediante análisis FISH. De las 34 muestras determinado que son positivos para p95 por CEER, 24 (71%) de ellos eran HER2 (+) por IHC /FISH. p95HER2 expresión no se pudo determinar en una muestra de lo que se indica como 'NA' en la tabla correspondiente.
El uso de la plataforma de ensayo p95HER2 basado en el CEER, se detectaron específicamente las formas truncadas de HER2, además en toda su longitud HER2, en GCs por primera vez. expresión p95HER2 se analizó en 31/50 HER2 (+) muestras y 27/384 HER2 (-) muestras) que demostró una expresión completa significativa longitud HER2 por CEER (Figura 1B). La incidencia de p95HER2 de HER2 (+) GC fue ~77% (en 24/31 muestras) (Tabla S1). Similar a la expresión longitud HER2 completo, la mayoría de expresión p95HER2 (79% de p95HER2 expresa en HER2 (+)) se detectó en GCs de tipo intestinal. expresión p95HER2 también se observó en un pequeño porcentaje de HER2 (-) GCs (37% o 10/27 muestras) que demostraron expresión completa HER2 longitud. Sin embargo, la expresión promedio p95HER2 en HER2 muestras GC (+) fue significativamente mayor que la observada en HER2 (-) GCs (5083,6 CU en HER2 (+) vs 437,0 CU en HER2 (-), p-valor = 1.27e-05 ). p95HER2 puede contribuir al trastuzumab falta de respuesta en tumores GC como lo hace en el 70-80% de los que sobreexpresan HER2 cánceres de mama [18]. Trastuzumab más quimioterapia estándar prestan una respuesta global de sólo el 47% de HER2 (+) GC en el ensayo ToGA [12] que indica la existencia de posibles mecanismos de resistencia a trastuzumab y nuestra incapacidad para seleccionar con precisión los respondedores trastuzumab. Con el fin de validar clínicamente expresión p95HER2 con la resistencia a trastuzumab, que ha sido motivo de controversia, especialmente debido a los recientes hallazgos contradictorios de los estudios de cáncer de mama GeparQuattro [19], riguroso refinamiento ensayo p95HER2 en términos de determinaciones y aplicabilidad ensayo de diagnóstico de corte clínicamente relevantes en la práctica clínica se requiere. Una validación de expresión p95HER2 está prevista en un lapatinib neoadyuvante fase II de ensayos clínicos además de la quimioterapia en pacientes con cáncer gástrico ya que varios estudios sugieren el uso de lapatinib en p95HER2 (+) cáncer [20], [21].
En su conjunto , nuestros datos definen claramente el estado de HER2 en GC y demuestran la utilidad de diagnóstico de HER2-CEER basados en muestras de pacientes GC para determinar la exacta longitud completa y truncada expresión de HER2. El desarrollo de este tipo de diagnóstico tendrá un impacto fuerte en la selección precisa de HER2 (+) GC que son respondedores a trastuzumab y otros agentes de la orientación HER2. Hemos informado anteriormente el uso de los diagnósticos basados HER2-CEER en pacientes con cáncer de mama [6], [15] que han demostrado una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los diagnósticos basados en IHC.
Los cánceres gástricos demuestran la activación concomitante de vías
se utilizó el ensayo de CEER directamente en muestras de GC para evaluar la presencia de formas totales y fosforilada (activada) de varias moléculas de señalización que se sabe objetivos farmacológicos de señalización: se trata, en los RTK (HER1, HER2, HER3, CMET, IGF1R) y PI3K. Imágenes representativas de multiplexados CEER vía de arrays de ocho muestras diferentes se muestran en la Figura 2A. Estas imágenes demuestran claramente la heterogeneidad de las firmas vía activada que es frecuente en los GC. Por ejemplo, tanto HER1 /HER2 se coactivadas en las muestras 1 y 6, mientras que sólo HER2 se activa en la muestra 2 a pesar de HER1, HER2 y cMet se expresan a niveles altos. La muestra 5 demuestra la activación de los 5 RTK analizadas, incluyendo la vía PI3K vías aguas abajo y en situación especialmente difícil. La siguiente sección describe la heterogeneidad vía de señalización observado en nuestra cohorte de pacientes GC como se determina mediante los ensayos de CEER.
(A) representativos imágenes inmuno-array para el perfil de la vía de transducción de señales de las proteínas indicadas. la intensidad de señal de la serie va de negro /azul oscuro (bajo) a rojo /blanco (alta /saturación). (B) Mapa de calor y la agrupación jerárquica de las 434 muestras basadas en los valores de CU de ensayo para los marcadores CEER fosforilados medidos a 10 μ g de lisado de concentración. Cada columna representa un marcador y cada fila representa una muestra de paciente. Los niveles relativos de fosforilación se representan con una escala de colores donde el rojo representa el más alto nivel de activación y el verde representa el nivel más bajo. Los valores de CU para cada marcador (columna) se clasificaron por deciles. Jitter, entre 0 y 0,1, se añadió a cada valor CU biomarcador para crear cubos de igual tamaño. Fila y columna dendrograma mostrar el resultado del cálculo de la agrupación jerárquica.
Los tumores de 202 pacientes (46,5%) no detectable activación de los RTK probados en nuestro estudio. los patrones de activación de la vía para el resto de los tumores, tal como se representa en una vía de análisis de agrupamiento (Figura 2B), variar ampliamente con algunos GC demuestra la activación simultánea de múltiples RTK como HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /Cmet o HER3 /Cmet mientras que otros fueron fosforilados sólo en una única proteína. El contenido de tumor de todas las muestras analizadas fue & gt; 70% en base a su examen histológico. Sin embargo, la expresión pan-citoqueratina (pan-CK) era claramente de la variable de la heterogeneidad que sugiere en el contenido de GC epitelial. Sobre la base de este perfil, se categorizaron la cohorte muestra de 434 GC de acuerdo con sus firmas de activación RTK y el estado de HER2
SU eje en los cánceres gástricos. (Tabla 2 & amp; Tabla S1).
al menos un miembro receptor de la HER eje se activó en 41% de los pacientes GC. se detectó la fosforilación de HER2 no sólo en 50% de los pacientes HER2 GC (+), sino también en $ ~ $ 22% de HER2 (-) cánceres de acuerdo con la expresión de HER2 total observada descrito anteriormente. 16/25 HER2 (+) muestras que demostraron activan HER2 también expresaron p95HER2. Del mismo modo, HER3 también se fosforiló en un mayor porcentaje de HER2 (+) GCs (36%) en comparación con HER2 (-) cánceres (~ 24%). Sin embargo, HER1 fosforilada no tenía tal preferencia y se activó de forma equivalente en los dos tipos de GC (26% en HER2 (+) y 25% en HER2 (-)). Además, la mayoría de los tumores HER GC miembro activado (~64%) demostró una activación concomitante de otros RTK, es decir, cMet o IGF1R. Histológicamente, la mayoría de la HER2 (+), tipo intestinal GCs expresó una HER2 activado (en 22/36 o ~61%) seguido de HER3 (en 13/36 o ~36%) con un 36% en total de GCs de tipo intestinal expresar una vía HER2 activado. En general, la activación de HER2 era más concentrada en tipo intestinal (55/154 o 35,7%) en comparación con los tipos de cáncer de tipo difuso (43/225 o 19,1%). Por el contrario, se activa HER1 se observó por igual en ambos de tipo intestinal (38/154 o 24,7%) y el tipo difuso (58/225 o 25,8%) GC. HER3 activa también fue equivalente actual (29,9% y 21,8%) entre los dos subtipos de clasificación de Lauren
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A medida que la función de señalización de la quinasa HER eje depende de la dimerización del receptor activado, nos fijamos en los diferentes pares de HER miembro coactivations. Co-activación de HER2 con HER3 se prefería HER2 (+) cáncer (13/50 o 26%) con 7/13 HER2: GCS HER3 activados sin un co-activación HER1. Aproximadamente el 54% de la HER2: HER3 coactivadas HER2 (+) GCs coexpressed p95HER2. Por otro lado, HER2 (-) GCs no demostró una preferencia por cualquier par específico HER dímero quinasa con los tres posibles pares de dímeros activados (HER1: HER2, HER1: HER3 y HER2: HER3) expresada en ~ 15% cada uno de HER2 (-) muestras. Se observó la activación de Triple /2/3 receptores de HER1 en el 11,1% de los GC con una distribución ligeramente superior en HER2 (-) cánceres
Cmet activa cánceres gástricos (Tabla 3 & amp; Tabla S1).
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similar a HER1, la fosforilación Cmet se distribuyó de forma equivalente entre HER2 (+) (22%) y HER2 (-) (~ 25%) GCs. Por otra parte, la distribución Cmet activado basado en la histotype Lauren fue similar entre intestinal (48/154 o 31,2%) y de tipo difuso (55/225 o 24,4%) GC.
La mayoría de las muestras de GC Cmet activado (~ 71% o 77/108) demostraron una activación concomitante de sus miembros quinasa del receptor. Todas las muestras con un Cmet fosforilada demostraron un
amplificación Cmet
(datos no mostrados).