Extracto
Antecedentes
El desarrollo de vacunas eficaces contra el cáncer sigue siendo un reto. A pesar del papel crucial de las células dendríticas plasmacitoides (PDC) en las respuestas antitumorales, su potencial terapéutico aún no ha sido resuelto. Exploramos la relevancia de HLA-A * 0201 igualaron PDC alogénicos como vectores para la inmunoterapia.
Métodos y Hallazgos
La estimulación de PBMC de HLA-A * 0201
+ donantes de HLA a * 0201 corresponde PDC alogénicas pulsadas con péptidos derivados del tumor desencadenados altos niveles de respuestas de células T citotóxicas específicas de antígeno funcionales y (hasta 98% de tetrámero
+ células T CD8). La vacuna demostró pDC fuerte eficacia terapéutica anti-tumor in vivo, como se muestra por la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de ratón humanizado. También suscitó las células T específicas de tumor altamente funcionales ex-vivo a partir de PBMC y TIL de pacientes I-IV melanoma en etapa. Respuestas contra mela, GP100, tirosinasa y MAGE-3 antígenos alcanzaron niveles de tetrámero de hasta un 62%, 24%, 85% y 4,3%, respectivamente. Las células T de vacunas cebado con PDC mataron específicamente propias células tumorales de melanoma autólogas de los pacientes. Esta vacuna pDC semi-alogénico fue más eficaz que las vacunas basadas en DC mieloides convencionales. Por otra parte, el diseño de vacunas PDC dota de un fuerte potencial para la aplicación clínica en el tratamiento del cáncer.
Conclusiones
Estos resultados ponen de relieve HLA-A * 0201 emparejado PDC alogénicos como potentes inductores de la inmunidad tumoral y proporcionar una estrategia inmunoterapéutica prometedora para combatir el cáncer
Visto:. Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) Una estrategia de vacuna contra el cáncer novela basada en HLA-A * 0201 Conjunto combinado de células alogénicas plasmocitoide dendríticas. PLoS ONE 5 (5): e10458. doi: 10.1371 /journal.pone.0010458
Editor: Graham Pockley, Universidad de Sheffield, Reino Unido
Recibido: 4 de diciembre de 2009; Aceptado: April 7, 2010; Publicado: 4 Mayo 2010
Derechos de Autor © 2010 Aspord et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (ACI-63-04 y Cancéropôle 2004-05) y Etablissement Français du Sang. J. Charles era un beneficiario de becas de la Academia Nacional de Medicina y Cancéropôle 2004-05. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El desarrollo de vacunas eficaces para el tratamiento del cáncer representa un importante problema de salud pública [1]. Debido a que los linfocitos T citotóxicos (CTL) son capaces de reconocer y lisar las células malignas, muchos ensayos terapéuticos han sido diseñados para potenciar las respuestas de CTL. células dendríticas mieloides (MDC) vacunas basadas tuvieron éxito en la inducción de células T específicas en pacientes pero sin la suficiente eficacia clínica [2], [3]. transferencia celular adoptiva de células T efectoras anti-tumorales amplifica ex-vivo de TIL inducida regresión objetiva del tumor [4], [5], pero la complejidad de esta estrategia ha obstaculizado el desarrollo de ancho. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de nuevas estrategias inmunoterapéuticas para superar las limitaciones de los protocolos actuales.
Hasta ahora, la inducción de respuestas de células T específicas para ambas estrategias inmunoterapéuticas adoptivas y activos se ha basado en mDCs [6 ] - [8]. células dendríticas plasmacitoides (PDC) son actores clave en la inmunidad sin embargo [9], [10] con un papel en las respuestas inmunes específicas de tumor [11]. PDC difieren de mDCs en muchos aspectos tales como la expresión de TLR, el perfil de la migración y la respuesta inmune que desencadenan. pDC también son capaces de captura de antígeno, el procesamiento y la presentación [12] - [15]. Antígeno pulsado pDC puede estimular primario específico (MELA) y la memoria (Flu) de células respuestas inmunes autólogas CD4 y CD8 T in vitro [16] - [19] y las respuestas de células T funcionales principales en vivo como se muestra después de la vacunación de ratones con CpG o activado virus-pDC [20] - [21]. pDC se encuentran dentro de muchos tumores en seres humanos [22] - [26], en el que se cree que son inmaduros, tolerogénico o asociada con mal pronóstico. Sin embargo, en el melanoma, la activación de TLR PDC-L podría desencadenar efectos antitumorales potentes. En ratones, la aplicación imiquimod (TLR7-L) [27] o la inyección intratumoral de CpG (TLR9-L) [28] invierten la inhibición funcional de pDC, promoviendo así la regresión del tumor. Por otra parte la administración local de CpG en pacientes con melanoma induce el reclutamiento y la activación de PDC en los ganglios linfáticos centinela [29] y las células T CD8 específicos de tumores posteriores asociados con un beneficio clínico [30]. El potencial de PDC en la generación de respuestas inmunes específicas de tumor eficaces también se ha demostrado en un modelo de ratón [31]. Los enfoques basados en PDC y agonistas de TLR [32] Por lo tanto, se prometedora para el tratamiento del cáncer humano.
Los antígenos tumorales generalmente desencadenan respuestas débiles. Por el contrario, las respuestas alogénicas dirigidos contra los no-auto MHC son extremadamente potentes. Curiosamente, la respuesta alogénica mediada por células T CD4 + MHC de clase II restringido-promueve espectador específica la inducción de células T [33], [34] como se ha mostrado con péptidos virales [35] y la regresión del tumor siguientes injerto de piel alogénica [36]. Por lo tanto, Allogeneicity podría ser explotado para promover la inmunogenicidad hacia antígenos tumorales [37] cuando se considera una compatibilidad HLA parcial entre la vacuna y el paciente, se hace referencia en adelante como HLA compatibles allogeneicity.
Debido PDC juegan un papel fundamental en el desencadenamiento de T respuestas de las células, su uso podría ser prometedor como nuevas estrategias de inmunoterapia. Sin embargo, el uso de pDC autólogo para la inmunoterapia del cáncer es difícil debido a la escasez de estas células [38] y la posible alteración funcional de PDC recolectadas de los pacientes portadores de tumores. Por lo tanto, explorado el potencial de HLA-A * 0201 igualaron alogénico PDC para inducir inmunidad anti-tumor-A HLA * 0201 restringida. Se utilizó una única línea celular humana PDC (GEN) establecida a partir de leucémica HLA-A * 0201
+ PDC con características fenotípicas y funcionales cerrado al PDC primarios [39], [40], [41]. La estrategia consistió en utilizar los PDC cargadas con péptido para inducir HLA-A * 0201-restricted CTL específica de antígeno. Se demuestra aquí usando tumor y modelo de antígenos virales potencial del irradiado pulsado por el péptido HLA-A * 0201 igualaron línea alogénico PDC (GENiusVac) in vitro, su eficacia terapéutica in vivo en ratones humanizados, y su relevancia clínica ex vivo con células de pacientes con melanoma ". Nuestros resultados ponen de relieve HLA-A * 0201 igualó PDC alogénicos como potentes inductores de la inmunidad antitumoral y ofrecer una nueva estrategia inmunoterapéutica prometedora para combatir el cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
Los cultivos se realizaron en medio RPMI 1640 complementado con Glutamax aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato de sodio 1 mM (Sigma), 100 mg /ml de gentamicina y 10% de FCS (todos de Invitrogen menos que se notifique). línea de melanoma Me275 fue proporcionada por el Profesor J-C Cerottini (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Epalinges, Suiza). líneas de melanoma COLO829 y A375, T2 y líneas K562 se adquirieron de ATCC (Normas LGC, Molsheim, Francia). línea de melanoma Mel89 fue generada en nuestro laboratorio (Figura S1). CD45 anti-humano, CD3, CD8 Abs fueron adquiridos de Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs fueron adquiridos de BD Biosciences y mela anti-humano de Sigma.
Péptidos y tetrámeros
Se utilizó la siguiente HLA-A y viral- derivado del tumor * 0201 restringimos péptidos (NeoMPS) y la correspondiente iTag HLA-A * 0201 tetrámeros (Beckman immunomics): mela
26-35 (ELAGIGILTV), GP100
209-217 (IMDQVPFSV), tirosinasa
369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3
271-279 (FLWGPRALV), FluM1
58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65
495-503 (NLVPMVATV).
PBMC, línea de pDC, pDC primaria aislamiento y mDCs generación
PBMC humano se obtuvieron de HLA-A * 0201
+ de donantes sanos por Ficoll-Hypaque centrifugación en gradiente de densidad (Eurobio). La línea de GEN2.2 PDC humana se cultivó como se ha descrito anteriormente [39]. PDC primaria fueron aisladas de la sangre de HLA-A * 0201
+ donantes sanos. Países en desarrollo se enriquece por primera vez por el agotamiento de las células no deseadas utilizando el kit de pre-enriquecimiento Pan DC (StemCell). células recuperadas se presentaron ya sea para BDCA4 + selección (Miltenyi) o etiquetados con un cóctel Lineage, CD123, HLA-DR y anticuerpos CD11c (BD) y ordenados en un BD FACSAria sobre la base de la expresión de CD123 y HLA-DR y la falta de Lin y marcadores CD11c. La pureza del PDC después de clase era más del 98%. mDCs se diferenciaron a partir de monocitos de la sangre utilizando 500 U /ml de GM-CSF y 10 ng /ml de IL-4 (TEBU Prepotech, Francia) durante 6 días. Este estudio se llevó a cabo bajo un procedimiento aprobado por la Junta de Revisión Institucional Agencia de sangre francesa. Todos los donantes firmaron formularios de consentimiento informado.
muestras de pacientes de melanoma
Las muestras se obtuvieron a partir de la etapa I a IV pacientes HLA-A * 0201 de melanoma que firmaron formularios de consentimiento informado. Utilizamos material adicional que no fue requerido para el diagnóstico o el análisis de los pacientes y no requiere procedimientos suplementarios. Por lo tanto, de acuerdo con la reglamentación francesa, no se requería la aprobación ética, pero la información y el consentimiento de los pacientes firmaron. Los parámetros clínicos se muestran en la Tabla S1. Las muestras de sangre se obtuvieron de 12 pacientes y PBMC purificadas por gradiente de densidad. muestras tumorales frescas se obtuvieron de 6 pacientes que se sometieron a cirugía de metástasis en tránsito. Las muestras se dilacerada y digeridos en 2 mg /ml de colagenasa D (Roche Diagnostics) 20 U /ml de DNasa (Sigma). A continuación, se aislaron células tumorales de la suspensión de células por adherencia y TIL enriquecidos de la fracción no adherente por gradiente de densidad.
T específica inducción de la respuesta de células in vitro
células GEN se cargaron primero con una o varios péptido (s) de interés. Brevemente, las células se lavaron 3 veces con RPMI libre de suero y se resuspendieron a 1,10
6 células /ml. se añadieron β2-microglobulina (0,1 mg /ml final) (Sigma) y el péptido (s) (1 a 10 mM final) (NeoMPS). Después de 3 horas de incubación a 37 ° C, las células se lavaron dos veces, se irradia con 30 Gy y se resuspendieron a 2.10
5 células /ml en RPMI con 10% de FCS. Cargadas con péptido GEN fueron co-cultivadas con semi-alogénico HLA-A * 0201 PBMC en una relación de 1:10 en RPMI + 10% de FCS durante al menos 7 días. Los cultivos se volvieron a estimular semanalmente con GEN cargado con péptido y 200 U /ml de IL-2 (Proleukine; Chiron). En algunos experimentos, PDC primarias no estimuladas o mDCs maduraron con LPS (1 mg /ml) se utilizaron las mismas condiciones siguientes. En el bloqueo anti-IFN (50.000 U /ml) y anti-IFNß (25.000 U /ml) anticuerpos (PBL laboratorios médicos) o IgG de control de cabra algunos experimentos se añadieron en el día 0 y día 2 de cultivo. Las respuestas específicas de células T CD8 se midieron por medio del etiquetado tetrámero de PBMC inicialmente y en diferentes etapas de la cultura. Las células se resuspendieron en HBSS con 2% FCS, se tiñeron con CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetrámero PE, CD3 PC7, los anticuerpos CD8 APC y se analizaron por citometría de flujo utilizando un análisis de software FACSCalibur y Cell Quest (Becton Dickinson). Para determinar los niveles iniciales de tetrámero, al menos 1-2,10
6 eventos fueron adquiridas.
Los ensayos in vitro funcionales
IFN secreción y la expresión de CD107 por las células T CD8 + tetrámero.
células T se marcaron primero con iTag HLA-a * 0201 tetrámero PE durante 30 minutos a RT, se lavaron y se volvieron a estimular con células T2 pulsadas con péptido (proporción 10:01) para 5 h30. Para la secreción de IFN, 1 l /ml de Brefeldina A (BD Biosciences) se añadió para la última 3 h. Las células fueron luego con anticuerpos y presentado a IFN tinción intracelular anti-CD3 y anti-PC7 CD8 APC (BD Biosciences) marcado con superficie. Para la detección de CD107, los anticuerpos anti-CD107a y CD107b FITC (10 l /1.10
6 células) (BD Biosciences) se añadieron en el medio en el comienzo de la re-estimulación en presencia de Golgi STOP (0,67 l /ml) para la últimas 4 horas. Las células se marcaron a continuación con anti-CD3 PC7 y anticuerpos anti-CD8 de APC. IFN y tinción CD107 se analizaron en el tetrámero
+ CD8 + células T, tetrámero
-. Células T CD8 + y las células T CD4 +
Ensayo de citotoxicidad
actividad citotóxica
antígeno-específica. se midió mediante la realización de un ensayo estándar de liberación
51Cr. células T efectoras fueron ordenados desde el co-cultivo usando un kit de enriquecimiento de células T humanas EasySep (Stem Cell). Las células diana (células T2 pulsadas con péptido, K562, alogénicas o células tumorales autólogas) se marcaron con 50 Ci durante 1 hora a 37 ° C, se lavaron 3 veces y se sembraron con células T efectoras en el E indicada: relación de T en fondo redondo de 96 -Bueno placas. Después de 4 horas de incubación, se midió la radiactividad en 30 l de los sobrenadantes sobre una microplaca contador de centelleo Top Count NXT (Perkin Elmer). La media de mediciones por triplicado se expresó como un porcentaje de lisis específica mediante la fórmula:. (Liberación de la muestra - liberación espontánea) /(liberación máxima - liberación espontánea) x 100
In vivo ensayos funcionales en ratones humanizados
NOD-SCID β
2 m
- /- ratones inmunodeficientes (NOD.Cg-Prkdc
SCIDβ
2 m
Tm1Unc /J) fueron adquiridos de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor , EE.UU.) y se han criado en la Plateforme de Haute Technologie Animale (PhtA, la Tronche, Francia). Para los experimentos de terapia activa, los ratones huPBL se construyeron mediante el trasplante por vía intraperitoneal (ip) 50.10
6 PBMC de donantes sanos en subletalmente irradiados NOD-SCID β
2 m
- /- ratones (120-150 cGy). Los ratones fueron vacunados más con 5.10
6 pulsadas con péptido células irradiadas GEN por ip o sc rutas una vez a la semana. Respuesta a la vacunación se analizó en diferentes puntos de tiempo en la sangre, el lavado peritoneal, el bazo y los ganglios linfáticos. Los órganos fueron digeridos 30 min a 37 ° C con 2 mg /ml de colagenasa D (Roche Diagnostics). suspensiones de células resultantes se lavaron con HBSS + 2% de FCS, teñidas utilizando los siguientes anticuerpos anti-humanos (CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetrámero PE, CD3 PC7, CD8 APC) y sometido a análisis de citometría de flujo. Para evaluar la eficacia terapéutica, 1.10
6 células tumorales humanas se implantaron por vía subcutánea en el flanco de los ratones humanizados ya sea 5 días después de (profiláctico) o 4 días antes (terapéutico) de la primera vacunación. La vacunación se repite cada semana. El tamaño del tumor se monitorizó cada 2-3 días y el volumen del tumor calcula utilizando la fórmula: (diámetro corto)
2 × diámetro largo /2. Para el análisis de las células T específicas en el sitio del tumor y en DLN, los tejidos se digirieron tal como se describe anteriormente y las suspensiones celulares fueron sometidos a tetrámero etiquetado y análisis de citometría de flujo. Todos los experimentos in vivo han sido aprobados por el Comité Regional de Ética Animal Rhône-Alpes (CREEA) afiliada a la CNRS.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso de Mann-Whitney no paramétrica U test y test t no apareado utilizando el software Prism.
Resultados
HLA humano acertaron PDC alogénicos inducen respuestas de células T específicas de antígeno de PBMC donante sano con una fuerte eficacia in vitro
para investigar el potencial de HLA compatibles alogénico pDC en antígeno-específica de células T respuestas de inducción, se comparó la capacidad del péptido-cargado pDC primaria ordenados a partir de sangre de donantes sanos para inducir respuestas de células T específicas en autólogo y alogénico HLA-a * Los ajustes de 0201 emparejados. pDC condujo a una inducción significativamente mayor de células T específicas en HLA-A * 0201 igualaron configuración alogénicas en comparación con condiciones autólogas (amplificación del número absoluto de células T mela-específicas en 7 días: 35,6 ± 8,9 vs 17,9 ± 8,7, media ± SEM , p = 0,02) (Figura 1A y 1B, cuatro experimentos realizados con tres donantes diferentes). A medida que la escasez de PDC primaria impide su uso terapéutico de ancho, se utilizó la línea celular humana PDC (GEN) establecida a partir de leucémica HLA-A * 0201
+ PDC como fuente de HLA-A * 0201 igualaron PDC alogénicos. Para evaluar si el irradiada HLA-A * 0201
+ línea de PDC puede inducir respuestas de células T específicas como PDC primaria in vitro, alogénico HLA-A * 0201
+ PBMC de donantes sanos fueron estimulados con el irradiados cargados con péptidos células gen. Tanto para el tumor (MELA) y virales (gripe) péptidos derivados, se obtuvo una amplificación masiva de células T específicas después de sólo 7 días de cultivo tal como se detecta por medio del etiquetado tetrámero (Figura 1C, Figura S2). Esta inducción se vio reforzada por las estimulaciones de serie cada 7 días con la línea PDC cargado con péptido, en combinación con IL-2. Se obtuvieron de forma rutinaria 5-25% de tetrámero + células T CD8
después de 7 días, el 40-60% después de 15 días, y hasta el 98% después de 40 días (Figura 1C). Tales respuestas altas se reprodujeron con células de 14-20 donantes sanos y con diversos antígenos derivados del tumor de melanoma tales como mela, GP100, TYR, MAGE-3 (Figura 1D), así como antígenos derivados de virus (Figura S2). -Tumoral específica tetrámero
+ respuestas de células T alcanzaron un promedio de 22% para mela (rango 2-60%), 0,3% para GP100 (rango 0-3%), 1,2% para TYR (rango 0-8%) y 0,84% para MAGE-3 (rango de 0 a 4%) en 20 días. respuestas Multi-específicos también se indujeron usando células GEN cargados con varios péptidos diferentes (no mostrados). Por lo tanto, HLA compatibles PDC primarios alogénicos o la línea PDC provocar fuertes respuestas de células T específicas de antígeno primario y de memoria in vitro a partir de donantes sanos.
(A, B) autólogo o alogénico HLA-A * 0201
+ primaria pDC ordenadas de la sangre de donantes sanos fueron pulsadas con péptido mela y se utiliza para estimular el HLA-a * 0201
+ PBMC. La respuesta específica de células T se analizó en d7, mediante el etiquetado tetrámero. (A) Porcentaje de células T específicas mela (cerrada en las células T CD8 +). Se muestra un experimento representativo. (B) La amplificación del número absoluto de células T específicas de d0 a d7 (4 experimentos independientes realizados con 3 donantes diferentes). (C, D) alogénico HLA-A * 0201
+ PBMC de donantes sanos se estimularon con la irradiado cargado con péptido HLA-A * 0201
+ línea de PDC y se volvieron a estimular semanalmente en presencia de IL2. La especificidad de las células T se determinó por medio del etiquetado tetrámero y citometría de flujo análisis. (C) gráficas de puntos representativos cerradas en las células T CD8 + (panel izquierdo) y porcentajes (panel derecho) de mela tetrámero células
+ T en la cultura inicialmente y en diferentes puntos de tiempo después de la estimulación con la línea PDC cargado con péptido mela. tetrámero gripe se utilizó como control. (D) gráficos de puntos representativos cerradas en las células T CD8 + (panel izquierdo) y porcentajes de tetrámero
+ células T CD8 + obtenidos en los días 7, 14 y 20 de la cultura hacia la mela (n = 18), GP100 (n = 16 ), TYR (n = 16) y MAGE-3 (n = 16) antígenos tumorales.
Las células T específicas inducidas por HLA emparejado alogénico pDC exhibió vitro la actividad HLA restringido funcional en
además, examinó la funcionalidad de las células T específicas inducidas por el HLA-A * 0201 emparejado línea pDC alogénico. Hemos analizado la primera capacidad de las células T específicas de tumor para secretar IFN y expresar CD107 en la reestimulación. Cuando, células T específicas mela-co-cultivadas con células T2 cargadas con péptido secretado IFN y expresaron CD107 en presencia de la pertinente pero no el control de péptido (Figura 2A). Se obtuvo dentro de las células T de las medias reactiva con el tumor de 25% IFN
+ tetrámero
+ CD8 T células tras la reestimulación específica en comparación con 5% en condiciones de control (p = 0,007), y 50% CD107
+ tetrámero células
+ CD8 T en el momento de la reestimulación específica en comparación con el 24% en condiciones de control (p = 0,02) (datos no mostrados). A continuación se probó su citotoxicidad mediante la realización de un ensayo de liberación
51 Cr utilizando células T2 cargadas con péptido y líneas tumorales de melanoma como objetivos. células T mela-específicos mostraron una actividad citotóxica fuerte para con las células T2 cargadas con el pertinente pero no con el péptido de control (Figura 2B). Se obtuvieron 88% de específica de matar frente al 13% bajo condiciones de control (media de 8 experimentos, p & lt; 0,001) (no se muestra). Además, las células T mela-específicos fueron capaces de lisar HLA-A * 0201
+ mela
+ (Me275) pero tampoco HLA-A * 0201
+ mela
- (A375) ni HLA -A * 0201
-MelA
+ (COLO829) células tumorales de melanoma (Figura 2B, Figura S1) que demuestran el HLA-A * 0201-restricción y especificidad de antígeno de esta actividad. Además, esta lisis se inhibió por EGTA-MgCl2 o por el agotamiento de CD8 de células T (no mostrado), que junto con la expresión de superficie CD107 a reestimulación específica, sugiere un mecanismo que implica la exocitosis de gránulos citolítica de las células T CD8. No se observaron tales capacidades funcionales con células T tomadas en diferentes puntos de tiempo de la cultura 7-40 días. Un análisis similar realizado con células T específicas del virus demostró la capacidad de la gripe tetrámero
+ células T para secretar IFN y expresar CD107 sobre la re-estimulación específica, y sus propiedades citotóxicas (Figuras s3a y S3B). Es importante destacar que se observó una inducción única respuesta alogénica de menor importancia como lo atestigua el pobre activación de tetrámero no específica
- células T CD8 + y CD4 + células T hacia células de la GEN. Esto se observó después de una estimulación (respuesta a la gripe) (Figura S3C y S3D) pero estimulaciones también después de repetidas con la línea de PDC (respuesta MELA), mediante la medición de IFN-secretoras (Figura 2C) y CD107-que expresan las células T (Figura 2D) a la re-estimulación con células T2 o GEN. También se observó la ausencia del tetrámero
actividad de las células T frente a las células + GEN cargadas con un péptido irrelevante. Por lo tanto, la línea PDC provoca células T específicas de antígeno completamente funcionales con espectadoras respuestas alogénicas menores.
Las células T específicas mela-(A) inducidas por la línea PDC secretan IFN y expresan CD107 en la superficie sobre la re-estimulación específica. Las células de cultivo (día 14) fueron sometidos a etiquetado tetrámero y volvieron a estimular con células T2 pulsadas con un péptido relevante o control. la producción de IFN se evaluó mediante tinción intracelular y la expresión de CD107 mediante la adición de anti-CD107a + b anticuerpos durante la re-estimulación. Dotplots son cerradas en tetrámero
+ células T CD8 +. Representante de 8 experimentos llevados a cabo con 3 donantes en el día 8-40 de la cultura. Las células T específicas mela-(B) inducida por la línea de PDC son citotóxicos. Se seleccionaron las células T a partir del cultivo y se sometieron a un ensayo de liberación
51Cr utilizando células T2 cargadas con péptido y células tumorales de melanoma como objetivos. Representante de 8 experimentos realizados con 4 donantes en d13-40 de la cultura. (C, D) se evaluaron la secreción y CD107 expresión de IFN tal como se describe en (A) después de tres estimulaciones de PBMC y se analizaron en el tetrámero
+ células T CD8 + (barras blancas) y en el tetrámero no específica
- Las células T CD8 + (barras grises) y las células T CD4 + (barras negras) sobre la re-estimulación con células T2 pulsadas con péptido o gen (4 experimentos para cada condición).
El HLA-péptido cargado acertaron alogénico pDC línea provoca fuertes respuestas de células T específicas de antígeno in vivo en ratones humanizados Hoteles en
El uso de HLA compatibles PDC alogénicos como una vacuna requiere la inducción de respuestas de células T específicas de antígeno in vivo. Por lo tanto se evaluó el potencial de vacuna de la línea de PDC en un modelo de ratón humanizado [42] construido por xenotransplanting PBMC humana en inmunodeficientes NOD-SCIDβ
2 m
- /- ratones (huPBL modelo SCID). Veinticuatro horas después de la transferencia intraperitoneal, CD45 humano
+ células hematopoyéticas se han encontrado en el sitio de la inyección, sino también en la circulación y los órganos linfoides (no mostrado). Una sola inyección intraperitoneal del péptido-cargado irradiado HLA-A * 0201 igualó la línea PDC alogénicas inducida por las respuestas de células T específicas de antígeno fuertes hacia viral (FluM1, CMVpp65) y el tumor (MELA) antígenos en huPBL ratones (Figura 3A). tetrámero humano células T CD8 +
se encuentran no sólo en el sitio de la inmunización (lavado peritoneal), sino también en la circulación (de la sangre) y de los órganos linfoides (bazo, ganglios linfáticos) (Figura 3A). A continuación, evaluaron si varias inyecciones semanales de la línea PDC péptido-pulsado podrían mejorar el nivel de la respuesta. Curiosamente, el antígeno viral (Flu) induce una alta respuesta que alcanzó su punto máximo 7 días después de la primera vacuna y la disminución después, mientras que la respuesta al antígeno de tumor (MELA) siguió aumentando en reestimulaciones posteriores (figura S4). Dentro de todos los ratones huPBL vacunados (n = 22, 18 y 38) se reconstituye con PBMC humano (niveles de referencia de las células T CD8 + tetrámero + fueron 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) y 0,01% (MELA) tetrámero
+ T células) los niveles de células T específicas recuperados en los diferentes órganos variaron desde 0,7 hasta 1,9% para FluM1, 1.1 a 5.9% para CMVpp65, y de 0,2 a 1% para MELA (Figura 3B). Por lo tanto, la línea PDC pulsadas con péptido induce respuestas de células T específicas de antígeno fuertes y generalizadas en vivo
(AB) inmunodeficientes NOD-SCIDβ
2 m
-. /- Ratones fueron reconstituidos por vía intraperitoneal con 50.10
6 humana HLA-A * 0201
+ PBMC y vacunados por la misma vía con 5.10
células GEN cargadas con péptido 6 irradiados donantes sanos. la inducción de células T específicas se analizó en el lugar de la inyección (lavado), en la circulación (de la sangre) y de los órganos linfoides (bazo, LN), mediante el etiquetado tetrámero de células T humanas en las suspensiones de células. (A) La vacunación con células de la GEN cargadas con péptido indujo respuestas específicas de células T in vivo. gráficos de puntos representativos de las células T tetrámero marcado inducidos después de una sola vacunación con células GEN cargadas de péptidos en diferentes órganos en el día 8 para la vacuna anti-virales (gripe, CMV) y el día 10 para la vacuna antitumoral (MELA) (cerrada en CD8 células
+ T). Se muestra un ratones por grupo. Los niveles iniciales de células T específicas dentro de PBMC fueron 0,04%, 0,14% y 0,003%, respectivamente. (B) Los niveles de células T específicas antes (día 0) y después de la vacunación con GEN cargado con FluM1 (n = 22 ratones, 4 donantes, 1 vacuna), CMVpp65 (n = 18 ratones, 2 donantes, 1 de vacuna) y MELA ( n = 38 ratones, 4 donantes, 2-3 vacunas) péptidos en los tiempos indicados en diferentes órganos. Cada punto representa una vacunaron ratones huPBL (barras de media).
La vacunación con el péptido-cargado HLA compatibles alogénico línea PDC proteger a los ratones humanizados de la progresión del tumor en los dos ámbitos profilácticas y terapéuticas
a continuación se investigó el potencial terapéutico de esta estrategia en ratones humanizados injertados adicionalmente con tumor humano. NOD-SCIDβ
2 m
- /- ratones fueron reconstituidos por vía intraperitoneal con el HLA-A humana * 0201
+ PBMC y subcutánea vacunados semanal con células GEN pulsadas con péptido irradiados antes o después de ser desafiados con tumor de melanoma Células. En un entorno profiláctica, la inyección de ratones huPBL con células GEN cargados-mela, en comparación con las células GEN cargados con la gripe, inhibe HLA-A * 0201
+ mela
+ crecimiento del tumor (Me275) en cinco experimentos independientes (tumor tamaño en el día 27 = 12 vs 77 mm
3, p & lt; 0,0001) (Figura 4A y 4C). Por el contrario, el crecimiento de HLA-A * 0201
-MelA
+ (COLO829) y HLA-A * 0201
+ mela
- (A375), los tumores de melanoma no se vio afectada después de la inyección de mela o Flu-cargado células GEN en tres experimentos independientes (Figura 4C), lo que demuestra el HLA-a * 0201-restricción y el antígeno específico de la terapia. Por otra parte, el PDC cargado con péptido también provocar respuestas inmunitarias protectoras contra los tumores ya establecidos. La vacunación de ratones huPBL portadores de tumores con células cargadas GEN-mela inhibió el crecimiento tumoral en comparación con células de la GEN cargados-Flu (el tamaño del tumor en el día 25 = 6 vs 36 mm
3, p = 0,01) (Figura 4D-4F). Notablemente, tetrámero
+ se encontraron células T CD8 + en el sitio del tumor y en el LN de drenaje (figuras 4B y 4F), lo que sugiere que las células T reactivas a tumores inducidos por el HLA emparejado alogénico pDC había migrado al sitio de antígeno expresión y las células T eran capaces de matar las células tumorales
(AC) inmunodeficientes NOD-SCID β
2 m
-. /- ratones reconstituidos por vía intraperitoneal con HLA-A * 0201 humana
+ PBMC (huPBL ratones) fueron vacunados por vía subcutánea semanal con mela irradiado o células cargadas GEN-Flu y desafió a 5 días más tarde con células tumorales de melanoma en el flanco. (A) El seguimiento de la progresión tumoral. Un experimento representativo de 5. (B) el etiquetado de tetrámeros de tumor y que drenan las suspensiones de células LN de ratones vacunados con células huPBL GEN-mela cargadas que muestran la presencia de células T específicas mela-(cerrada en las células T CD8 +). (C) Los efectos terapéuticos de la vacuna son HLA-A * 0201-restringida y específica de antígeno. el tamaño del tumor comparativo células GEN 27 días después de la implantación de Me275, COLO829 y células de melanoma A375 en ratones huPBL vacunados con mela o Flu-cargado (piscina de 3 experimentos independientes para cada tipo de tumor se realiza con 6 a 14 ratones por grupo). (DF) inmunodeficientes NOD-SCID β
2 m
- /- ratones reconstituidos por vía intraperitoneal con humano HLA-A * 0201
+ PBMC (huPBL ratones) fueron desafiados primero con células tumorales de melanoma Me275 en el flanco y luego por vía subcutánea vacunados con mela irradiado o células cargadas GEN-Flu semanal a partir de 4 días más tarde. (D) El seguimiento de la progresión tumoral. Un experimento representativo de tamaño 2. (E) del tumor comparativo 25 días después de la implantación del tumor (grupo de 2 experimentos independientes, 8 ratones /grupo). (F) el etiquetado de tetrámeros del tumor y el drenaje de suspensiones de células LN de ratones vacunados con células huPBL GEN-mela cargadas que muestran la presencia de células T específicas mela-(cerrada en las células T CD8 +).
El HLA línea de pDC alogénico emparejado cargado con péptidos derivado de melanoma induce respuestas de células T específicas de múltiples y altamente funcionales ex vivo a partir de la fase I-IV de melanoma pacientes
a continuación se investigó la relevancia de esta estrategia en pacientes con cáncer. Pusimos a prueba la capacidad de la línea PDC péptido-pulsado para activar ex vivo las respuestas específicas de tumor de PBMC y linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) aisladas de la etapa IV HLA-A * 0201
+ pacientes con melanoma (cuadros S1 y S2 ). estimulaciones semanales de PBMC de los pacientes con la línea pDC pulsadas ya sea con MELA, GP100, TYR o MAGE 3-péptido dado lugar a la amplificación masiva de células T CD8 + específicas para al menos 2 de los 4 antígenos de melanoma (Figuras 5A y 5B). El tetrámero específico de tumor
las respuestas de células T CD8 + alcanzó un promedio de 23% para mela (rango de 0,4 a 62%), 1,2% para GP100 (rango de 0,05 a 3,5%), 0,3% para TYR (rango de 0,01-2,5% ) y 0,2% para MAGE-3 (intervalo de 0,03-0,72%) después de 20 días (tetrámero línea de base + células T CD8 + osciló 0,02-0,03% en d0). Un paciente fue excluido del análisis debido a una respuesta extremadamente intenso (85% tetrámero
+ células T en el día 14) hacia TYR (Figura S5). Además, repetidas estimulaciones de patients'TIL con la línea de pDC en impulsos con una mezcla de los 4 péptidos de melanoma condujeron a la amplificación masiva de células T específicas para al menos 3 antígenos (Figuras 5C y 5D). -Tumoral específica tetrámero
+ respuestas de células T CD8 alcanzado promedios de 39% para mela (rango 12-59%), 7,4% para GP100 (rango de 0,2 a 24%), 0,3% para TYR (rango de 0,05 a 1,2%) y 1,1% para MAGE-3 (intervalo de 0,1 a 4,3%) después de 20 días con los niveles de referencia días 0 formato 1.7, 0.2, 0.05 y 0.3%, respectivamente.