Extracto
Antecedentes
El cáncer de ovario sigue siendo la principal causa de muerte en mujeres y el desarrollo de nuevas terapias es esencial. En segundo lugar mitocondrias derivado activador de la caspasa (SMAC) se ha descrito para sensibilizar para la apoptosis. Hemos explorado la actividad pro-apoptótica de LBW242, un imitador de SMAC /DIABLO, en líneas celulares de cáncer de ovario (células A2780 y A2780 quimioresistente su derivada /ADR, SKOV3 y células HEY) y en células de cáncer de ovario primario. Los efectos de LBW242 en líneas celulares de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario primario se determinó por la proliferación celular, la apoptosis y ensayos bioquímicos.
Principales conclusiones
LBW242 se añade solo provocada sólo un efecto pro-apoptótica moderada ; sin embargo, un efecto sinérgico fuertemente con necrosis tumor apoptosis relacionada con el factor de inducción de ligando (TRAIL) o medicamentos contra el cáncer en la inducción de la apoptosis de las dos líneas celulares de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario primario. Estudios mecanísticos muestran que la apoptosis inducida por LBW242 en células de cáncer de ovario se asocia con la activación de la caspasa-8. En línea con este mecanismo, la sobreexpresión de c-FLIP inhibe la apoptosis mediada por LBW242.
Conclusión
LBW242 sensibiliza a las células de cáncer de ovario a los efectos antitumorales de TRAIL y anticancerígenas fármacos de uso común en la clínica. Estas observaciones sugieren que la LBW242 imitador SMAC /DIABLO podría ser de valor para el desarrollo de estrategias experimentales para el tratamiento de cáncer de ovario
Visto:. Petrucci E, Pasquini L, M Bernabei, Saulle E, M Biffoni, Accarpio F, et al. (2012) una pequeña molécula SMAC Mimic LBW242 potencia la TRAIL y Mediada-fármaco anticanceroso muerte celular de las células de cáncer ovárico. PLoS ONE 7 (4): e35073. doi: 10.1371 /journal.pone.0035073
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: 9 Marzo 2012; Publicado: 25 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Petrucci et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los subsidios del Ministerio de Salud italiano, Progetto Oncotecnologico a UT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer es el trastorno de múltiples etapas muy complejo que implica la acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas, que en última instancia conducen a la transformación de células normales en células malignas que muestran las propiedades esenciales de cáncer: resistencia a los mecanismos de apoptosis, la independencia de las señales de crecimiento , insensibilidad a las señales de crecimiento negativos, capacidades invasivas y metastásicas, potencial de replicación ilimitado y la angiogénesis sostenida [1]. Entre estas diversas propiedades de las células cancerosas, la resistencia a la apoptosis ciertamente desempeña un papel muy relevante en el desarrollo y progresión del tumor. La capacidad de las células cancerosas para evadir la apoptosis está relacionada con diversas propiedades bioquímicas de estas células, y en particular, a la sobre regulación de genes antiapoptóticos tales como ciertos miembros de la familia Bcl-2 de proteínas y los miembros del inhibidor de la apoptosis (IAP ) la familia de proteínas [2]. En particular, tres líneas de evidencia apoyan un papel para las proteínas IAP en el cáncer: (i) niveles elevados de expresión de proteínas IAP, en particular XIAP, c-IAP1 y c-IAP2, en un número de tipos de cáncer humano se correlacionan con el grado del tumor y el pronóstico [ ,,,0],3]; (Ii) una serie de
in vitro
y
in vivo
estudios han demostrado que la regulación a la baja de XIAP o c-IAP1 por diversos agentes resultados en la sensibilización de las células cancerosas al por quimioterapia y gamma irradiation- apoptosis inducida [4]; (Iii) la región cromosómica 11q21-q23 que contiene genes c-IAP1 y c-IAP2 está sujeta a la amplificación cromosómica en diversos tumores [3], [4].
IAPs, y en particular c-IAP1, c- IAP2 y IAP ligada al cromosoma X (XIAP), funcionan para inhibir la apoptosis mediante la prevención de la activación de las caspasas-8 o la inhibición de la actividad de las caspasas-9, -3 y -7, respectivamente [5], [6]. C-IAP1 y c-IAP2 poseen un dominio de ubiquitina ligasa E3 que promueve la degradación del proteasoma dependiente de c-IAP1 y c-IAP2 [7]. La actividad de los PAI es antagonizado por SMAC /DIABLO (activador segundo-mitocondrias derivadas de las caspasas /inhibidor directo de la proteína de unión a la apoptosis con bajo pI) que, después de la liberación de las mitocondrias en respuesta a la apoptosis de activación, se somete a maduración y la escisión de su N región -terminal, con la consiguiente exposición de la secuencia de AVPI [8]. Este tetrapepetide une XIAP y compite con los mismos sitios de unión que están implicados en la interacción con las caspasas [9]. A través de este mecanismo, SMAC /DIABLO evita el secuestro de caspasas por IAP, facilitando de este modo la vía apoptótica. Puesto que la secuencia AVPI es capaz de promover la apoptosis, los compuestos capaces de imitar este tetrapéptido, conocidos colectivamente como SMAC-miméticos, se han representado el objetivo de intensos esfuerzos de investigación y varios de estos agentes se han desarrollado durante estos últimos años [10] - [15 ].
es importante tener en cuenta que una desregulación de IAP puede contribuir al desarrollo de tumores no sólo a través de las caspasas inactivación, pero también a través de diferentes mecanismos que no dependen de caspasas inactivación. Por lo tanto, un estudio reciente demostró claramente que: XIAP contribuye a la metástasis
in vivo
e invasión celular
in vitro
, independientemente de las caspasas y la inhibición de unión; XIAP en complejo con survivin impulsa la activación de NF-KB para promover la invasión de células y la metástasis; c-IAP1 y c-IAP2 también están involucrados en la invasión de células de cáncer [16].
Por lo tanto, la inactivación de los PAI, especialmente cuando se combina con otros tratamientos (como fármacos quimioterápicos, ligandos de muerte, incluyendo el TNF-alfa y TRAIL ), da como resultado la muerte de la mayoría de las células tumorales, por lo menos en condiciones de cultivo de tejido [11], [13], [16], [17]. Es importante destacar que la inactivación de los PAI no parece ser perjudicial para las células normales. El conjunto de estas observaciones ha apoyado el desarrollo de pequeños inhibidores farmacológicos de los PAI que se han introducido en la fase I de ensayos clínicos [5].
LBW242 es un peptidomimético de orientación IAP recientemente por Zawel y compañeros de trabajo que compite con alto afinidad con SMAC /DIABLO para la ocupación del bolsillo de unión BIR3 XIAP [17]. Este compuesto ha demostrado ser capaz de inducir la apoptosis de diversos tipos de células, incluyendo el mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, glioblastoma y melanoma [18] - [21].
En el presente estudio hemos explorado la capacidad de LBW242 para inducir la muerte celular apoptótica de las células de cáncer de ovario añadido solo o en combinación con TRAIL o medicamentos contra el cáncer. Nuestros resultados indican que LBW242 mejora la sensibilidad de la muerte celular de cáncer de ovario inducida por TRAIL o medicamentos contra el cáncer, tales como topotecan a través de un efecto relacionado con una potenciación de la activación de la caspasa-8. Estas observaciones apoyan los estudios futuros para investigar un posible papel de LBW242 en el tratamiento del cáncer de ovario
.
1A- A2780WT, A2780ADR, HEY y SKOV3 se han cultivado durante 48 horas en ausencia o en presencia de TRAIL (50 ng /ml) y, o bien en ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de LBW242 (1-10 mM) y al final del cultivo se determinó el número de células vivas. La diferencia entre el control y TRAIL fue estadísticamente significativa: p = & lt; 0,001 para A2780WT y oye; p = & lt; 0,01 para SKOV3; p = & lt; 0,05 para A2780ADR. células 1B A2780WT y SKOV3 se han cultivado como antes y después de 48 h de cultivo, la proporción de células apoptóticas se determinó mediante ensayo y yoduro propide tinción de unión a Anexina-V. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría de flujo. Los resultados representan los valores medios observados en tres experimentos separados. La diferencia entre el control y TRAIL fue estadísticamente significativa:. P = & lt; 0,01 para las células tanto A2780WT y SKOV3
Métodos
Ética declaración
Este estudio fue específicamente aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Superior de Sanidad y estaba en conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki II. El contenido informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
A2780WT, las células A2780ADR y SKOV3 han sido transfectadas de forma estable ya sea con un vector vacío (PINCO) o con el vector que contiene el cDNA de c-FLIP (FLIP) y la células resultantes se cultivaron en ausencia (control) o en presencia de LBW242 (10 M) o TRAIL (50 ng /ml) o estos dos agentes a las concentraciones anteriores. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría de flujo usando el ensayo de unión de Anexina-V /PI. Los datos representan los valores medios ± SEM observaron en tres experimentos separados. Análisis estadístico: * p = & lt; 0,05; ** P = & lt; 0,01; *** = P. & Lt; 0,001
Cell Cultura y
El cisplatino-sensibles epitelial de ovario línea celular de carcinoma A2780WT humana se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC); línea celular resistente a adriamicina A2780ADR, derivada de su parental A2780 línea celular de cáncer de ovario mediante la aplicación de paso a paso en concentraciones de adriamicina se obtuvo de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Las células A2780ADR se trataron con 10 mM adriamicina cada 10 pasajes. SKOV3 y líneas de células HEY se obtuvieron a partir de ATCC.
A2780WT, A2780FLIP, A2780ADR, A2780ADR FLIP, las células FLIP SKOV3 y SKOV3 han crecido como se indica en la figura. 2, ya sea en ausencia o en presencia de 40 mM zVAD-fmk o zIETD-fmk y después de 48 h de incubación el porcentaje de células apoptóticas se determinó por ensayo de unión de anexina-V /PI. Los resultados representan valores medios ± SEM observaron en tres experimentos separados.
Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2 en Avanzada MEM con suero fetal bovino al 3% (FBS, Euroclone, Milán, Italia), 50 UI /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 50 mg /ml de gentamicina y 0,3 mg /ml de glutamina. Las células se revisaron de forma rutinaria para la presencia de Mycoplasma.
En el panel C se muestran tanto la longitud completa (FL) y la forma escindida (CF) de la caspasa-3. La inmunotransferencia PARP muestra dos bandas, de las cuales corresponde la parte superior a una forma de longitud completa de la PARP y la banda inferior a una forma escindida de PARP. En la figura se reportan los datos representativos observados en uno de los tres experimentos llevados a cabo.
Aislamiento y cultivo in vitro de células de cáncer de ovario primario
Se han obtenido biopsias intra-operatorias de 9 pacientes con cáncer de ovario, afectados por el adenocarcinoma seroso, se someten a cirugía de reducción de volumen, ya sea para la enfermedad primaria o recidivante. El tejido tumoral se ha disociado mecánicamente con una tijera y una suspensión de células tumorales se ha obtenido por digestión en medio de cultivo tisular (RPMI 1640) que contiene colagenasa, la desoxirribonucleasa I y hialuronidasa. La suspensión celular final del tumor se comprobó para la proporción de células tumorales por citología estándar y el porcentaje de células epiteliales por citometría de flujo (determinado después de la tinción con Ber-EP4 mAb, Dakopatt, Copenhague, Dinamarca). Brevemente, para la evaluación de alícuotas de células reactividad Ber-EP4 se tiñeron 30 min a 4 ° C con 5 mg /ml marcado con FITC anti-Ber-EP4 mAb, se lavaron y se analizaron para la emisión de fluorescencia usando un Becton Dickinson citómetro de flujo. alícuotas de células tumorales (1 × 10
6 células) se han plateado en 25 cm
3 frascos de cultivo de tejido en 10 ml de medio de cultivo celular que contiene suero de ternera fetal 10%. Después de 1 día de
in vitro Francia culture, las células no adherentes (que contienen restos de tejidos y células muertas) se han eliminado y se añadió medio fresco a la cultura y luego se incubaron durante 24 horas adicionales ya sea en ausencia o en la presencia de TRAIL, o LBW242 o ambos reactivos. A las 24 horas de células de cultivo fueron confluentes. culturas tumorales contenían al menos 80% de las células tumorales.
Transducción de A2780WT, las células A2780ADR y SKOV3
A2780WT, las células A2780ADR y SKOV3 que expresan bien el vector vacío PINCO-GFP (PINCO) o la vector PINCO-GFP que contiene el c-FLIP
L (FLIP) de genes humanos se han obtenido como se informó anteriormente [22]. Las células transducidas se analizaron de forma rutinaria para la expresión de GFP usando un citómetro de flujo y de c-FLIP
L expresión por Western Blot.
evaluación de la apoptosis mediante tinción con anexina V-
Después de los tratamientos de drogas, células se resuspendieron en 200 l de solución colorante (que contiene fluoresceína Anexina-V y yoduro de propidio en un tampón Hepes, Anexina-V-FITC Kit de Detección de apoptosis, Pharmingen, San José, CA, EE.UU.). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 min., Las células se analizaron por citometría de flujo. Anexina-V se une a las células que expresan la fosfatidilserina en la capa externa de la membrana celular, y yoduro de propidio tiñe el ADN celular de las células con una membrana celular comprometida. Esto permite la discriminación de las células vivas no teñidas (ya sea con fluorocromo) de las células apoptóticas (teñidas únicamente con anexina V) y células necróticas (teñidas con tanto con anexina-V y yoduro de propidio).
La cuantificación de la apoptosis y de células el análisis del ciclo de células activadas por yoduro de propidio /fluorescencia Ordenando
Las células se recogieron con tripsina, se lavaron, se incubaron primero con un tampón de detergente espermina tetrahidrocloruro que contiene tripsina para digerir las membranas celulares y citoesqueletos, a continuación, con un tampón de citrato que contiene un inhibidor de la tripsina y ribonucleasa a para inhibir la actividad de la tripsina y para digerir el ARN y, por último, se resuspendieron en 400 l de yoduro de propidio (PI) solución (50 mg /ml PI, 0,1% de Triton X-100, y citrato de sodio al 0,1% en PBS) (ciclo Plus DNA kit de tinción, Becton Dickinson, EE.UU.). Las células fueron analizadas por citometría de flujo utilizando un software dedicado para el análisis de ADN (software ModFit LT, Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.). Se cuantificaron las células con contenido de ADN subdiploide para determinar el porcentaje de células que contienen ADN apoptótico y fragmentado.
Los reactivos utilizados para inducir la apoptosis de las células tumorales
células de cáncer de ovario se preincubaron con un pan-caspasa inhibidor, N-benciloxi-carbonil-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zVADfmk) o N-Glu-Ile-benciloxi-carbonilo (OMe) Thr-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zIETDfmk), (ambos de Sigma, St Louis, EE.UU.) antes de la adición de los diversos compuestos que estimulan la apoptosis.
los anticuerpos monoclonales agonistas de TRAIL-R1 (mapatumumab) y TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) son anticuerpos completamente humanos de isotipo IgG1 [23 ], [24] y fueron generosamente proporcionado por el Genoma humano Ciencia (Rockville, MD, EE.UU.).
El tratamiento con medicamentos contra el cáncer
En algunos experimentos las células de cáncer de ovario han sido incubadas con algunos medicamentos contra el cáncer de uso común en la terapia del cáncer de ovario: cis-diamineplatinum cloruro de (II) (CPLAT); paclitaxel (Taxol); Topotecan Hydrichloride hidrato (TOPO); Etopósido (ETOPO); Clorhidrato de Doxorubicina (DOXO). Todos estos fármacos se adquirieron de Sigma Co (St Louis, EE.UU.) y se añadieron
in vitro
en dos dosis: una dosis baja en relación con su nivel de pico media en el plasma observado durante las infusiones de drogas a los pacientes con cáncer (es decir, 1,67 M durante CPLAT; 2,45 M para el taxol; 0,21 M; 8,5 M durante ETOPO;. 0,17 M durante DOXO) y una dosis alta, que corresponde a una dosis de cinco veces mayor que la dosis baja
Western blot Análisis
se obtuvieron extractos de células enteras de lisis de las células en un tampón que contiene HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, EGTA 2 mM, 0,5% NP-40, 1 mM de DTT, PMSF 0,1 mM, 2 g /ml leupeptina, 2 mg /ml de aprotinina, NaF 25 mM y 10 mM Na
3Vo
4. Después de incubación durante 30 min en hielo, los lisados de proteínas se borran de los desechos mediante centrifugación a 10.000 g durante 10 min. La concentración de proteína en el sobrenadante soluble, se determinó utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, VA, EE.UU.).
A- HEY células han sido incubadas durante 24 h en ausencia ( control) o en presencia de LBW242 (30 mM) o de cualquiera de cisplatino (CPLAT en 1,6 o 8 M) o paclitaxel (Taxol en 2,5 o 12,5 M) o Topotecan (TOPO a 0,2 o 1 mM) o etopósido (ETOPO a 8 o 40 mM) o doxorrubicina (DOXO a 0,17 o 0,85 M) solo o en combinación con LBW242 y analizados para la inducción de la muerte celular por citometría de flujo. Los datos representan los valores medios ± SEM observaron en tres experimentos separados. Análisis estadístico: * p = & lt; 0,05; ** P = & lt; 0,01; *** P = & lt; 0,001. B - HEY células han sido incubadas durante 24 h en presencia de concentraciones crecientes de LBW242either en ausencia (control) o en presencia de cisplatino (1,6 M) o paclitaxel (2,5 M) o Topotecan (0,2 M) y se analizaron para la inducción de la muerte celular por citometría de flujo. Los datos representan el valor medio ± SEM observado en tres experimentos separados. Las diferencias entre el control y topotecan (p = & lt; 0,001), el control y paclitaxel (p = & lt; 0,001) y el control y cisplatino (p = & lt; 0,05). Fueron todas significativas
A- LBW242 potencia el efecto proapoptótico de hidrocloruro de topotecan, un inhibidor de topoisomerasa I. A2780WT PINCO y FLIP (
paneles superiores
) y SKOV3 PINCO y FLIP (
paneles inferiores
) células han sido incubadas durante 24 h en ausencia (control) o en presencia de DMSO 0,01% o zVAD- fMK 40 mM, hidrocloruro de topotecan 1 M, TRAIL 50 ng /ml o LBW242 + zVAD- fMK, LBW242 + hidrocloruro de topotecan, TRAIL + zVAD- fMK, TRAIL + hidrocloruro de topotecan, topotecan clorhidrato + zVAD- fMK, LBW242 + TRAIL, TRAIL LBW242 + + zVAD- fMK, LBW242 + Clorhidrato de topotecan + zVAD- fMK y analizados para la inducción de la apoptosis por citometría de flujo. Los datos representan los valores medios ± SEM observaron en tres experimentos separados. En A7280 WT PINCO y en las células SKOV3 PINCO LBW242 + TOPO indujo una proporción de células muertas mayor que la observada con cualquiera LBW242 (p = & lt; 0,05) o TOPO (p = & lt; 0,05). B y C - Evaluación de las caspasas-8 de activación en las células A2780 y A2780ADR incubadas en ausencia (control) o en presencia de LBW242 o de topotecan o de ambos LBW242 y Topotecan. Caspasa-8 actividad en las células intactas se midió utilizando un sustrato específico fluorigenic caspasas-8. resultados originales de un análisis representativo se presentan en la B, mientras que los valores medios ± SEM de los porcentajes de células se presentan son reportados en C. caspasa-8 activación El porcentaje de células que muestran activa caspasas-8 fue mayor tanto para las células WT y de ADR en LBW242 que en las células NT (p = & lt; 0,05) y en LBW242 + TOPO que en LBW242 o células tratadas con TOPO (p = & lt; 0,05) guía empresas
Los anticuerpos
anti. -caspase -9, -3 fueron adquiridos de Upstate (Upstate Biotechnology Lake Placid NY, EE.UU. y el amplificador de I +; D Systems Inc. Minneapolis, MN, EE.UU.); Anti-XIAP y anti-Bcl-2 se compraron de BD Pharmingen (BD Pharmingen, San Diego, EE.UU.); anti-survivina y anti-PARP fueron adquiridos de I + amp; D System (I + amp; D System Inc., Minneapolis, MN); anti-FADD se adquirió de Biosource (Biosource, Camarillo, CA, EE.UU.); anti-c-FLIP (NF6 clon) y anti-c-IAP se adquirieron de Alexis (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EE.UU.); anti-actina de Oncogene (productos de investigación Oncogene, Cambridge, MA), se utilizó como control de carga.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa Graph Pad. se informó de todos los parámetros como medias ± SEM. Para comparar las diferencias entre grupos, se realizó ANOVA robusto. Los valores de p comunicados fueron de dos caras. Un valor de p inferior a 0,05 indica significación estadística. isobologram análisis se realizó utilizando el programa de software Calcusyn (Biosoft, MO, y Cambridge, Reino Unido). Un índice de combinación (IC) de menos de 1,0 indica sinergismo, un un CI de 1,0 indica actividad aditivo [25].
Resultados
LBW242 mejora la muerte celular mediada por TRAIL de líneas celulares de cáncer de ovario
en nuestros estudios anteriores se demostró el efecto pro-apoptótica de SMAC /DIABLO compuesto mimético 3 en líneas celulares de cáncer de ovario resistente A2780WT y su homólogo A2780DDP y A2780ADR [26]. En el presente estudio, se investigó el efecto de otro mimético SMAC /DIABLO, LBW242, en modelos de cáncer de ovario. En primer lugar, hemos explorado la proliferación celular en una prueba de dosis-respuesta de LBW242 solo y en combinación con TRAIL (Fig. 1A). El A2780WT línea celular (
Panel superior izquierdo
) fue sólo ligeramente inhibidas en su crecimiento por LBW242 añadió solos; sin embargo, el tratamiento combinado de LBW242 con TRAIL resultó en una inhibición sinérgica marcada del crecimiento celular. Se observó el mismo tipo de sensibilidad para la línea de células HEY (
panel inferior izquierdo
). análisis de isobolograma confirmó la actividad anti-tumor sinérgico de LBW242 más TRAIL (por A2780WT CI = 0,77 y HEY CI = 0,80). La interacción sinérgica de LBW242 y TRAIL en A2780WT y líneas de células HEY se pueden intuitivamente visualizaron mediante el trazado de los datos de crecimiento celular usando mediciones en LBW242 0 M con y sin TRAIL como 100% y todas las medidas posteriores expresan en relación con su propio control (ver Fig. S1). Esta cifra revela una reducción adicional del número de células causado por la adición de LBW242 en la parte superior de la inducida por TRAIL solo (Fig. S1).
Las barras grises representan los valores medios ± SEM. células de cáncer de ovario aislados de biopsias de tumores han sido cultivados durante 24 horas o bien en ausencia o en presencia de LBW242 (10 mM) o de TRAIL (50 ng /ml) o ambos agentes a las concentraciones anteriores.
El panel inferior de la derecha
: La proporción de células muertas fue mayor en LBW242 o TRAIL o LBW242 + células que las células en el control no tratados (-; p = 0,01 & lt) TRAIL-tratados; Además, el porcentaje de células muertas fue menor en LBW242 + TRAIL que en las células LBW242 tratados con TRAIL o (por tanto p = & lt; 0,05).
El panel inferior de la izquierda
: El número de células fue significativamente menor en LBW242 + TRAIL que en TRAIL o células tratadas con LBW242 (por tanto p = & lt; 0,05)
el A2780ADR y SKOV3 (
paneles de la derecha
) líneas celulares fueron los más sensibles al efecto inhibidor de LBW242 sobre la proliferación celular, el cual fue moderadamente aumentado por la adición de TRAIL. análisis de isobolograma mostró un efecto aditivo de LBW242 más TRAIL en la inhibición del crecimiento de estas líneas celulares (por A2780ADR CI = 0,97; para SKOV3 IC = 1,0).
Los mismos tratamientos se realizaron en A2780WT y líneas celulares SKOV3 a evaluar el efecto de LBW242 en el porcentaje de células apoptóticas (Fig. 1B). Las células A2780WT eran apenas sensibles a los tratamientos individuales, ya sea con o LBW242 TRAIL solo, pero muy sensible al tratamiento combinado (CI = 0,70). SKOV3 eran sensibles al efecto pro-apoptótica de LBW242, pero apenas sensible a TRAIL; la adición combinada de los dos fármacos aumentó aún más la tasa de apoptosis (CI = 0,79) (Fig 1B).
Estos datos indican que:. líneas celulares de cáncer de ovario son sensibles a LBW242 efectos, en particular en el tratamiento combinado con SENDERO; LBW242 ejerce una sinérgicos o aditivos actividad anti-tumor con TRAIL en líneas celulares de cáncer de ovario.
Los experimentos llevados a cabo utilizando agonista pruebas anti-TRAIL-R1 (mapatumumab) o-R2 anti-TRAIL mAbs (LEXATUMUMAB) siempre que este último añadió junto con LBW242 indujo una alta tasa de apoptosis de las cuatro líneas celulares de cáncer de ovario aquí estudiados (datos no mostrados).
c-FLIP
L sobreexpresión inhibe el efecto pro-apoptótico de LBW242
en estudios anteriores se demostró que bajo estimulación TNF, caspasa-8 es una proteasa crítico apoptótica en IAP muerte celular inducida por antagonistas [27] - [30]. Para explorar un posible papel de la activación de la caspasa-8 en la muerte celular mediada por LBW242, se utilizaron las líneas celulares transfectadas de forma estable con c-FLIP
L (FLIP A2780WT, FLIP FLIP A2780ADR y SKOV3), un inhibidor natural de la caspasa-8. células A2780WT, A2780ADR y SKOV3 expresan niveles bajos de c-FLIP, c-FLIP
L siendo la única isoforma detectable en estas células (Fig. 2 y la Fig. S2). En contraste, como se espera, FLIP A2780WT, FLIP A2780ADR y FLIP SKOV3 expresan altos niveles de c-FLIP
L (Fig. 2 y la Fig. S2). C-FLIP
S fue indetectable en todas estas líneas celulares (Fig. S2).
Panel Cabe destacar que en A2780WT, las células de ADR y SKOV3 (Fig. 2,
dejaron
s
) transfectadas con el vector vacío (PINCO), el tratamiento individual con LBW242 o TRAIL induce un efecto apoptótico moderado, mientras que el tratamiento combinado de LBW242 con TRAIL induce un notable aumento de la muerte celular. En aquellas células que sobreexpresan c-FLIP
L (Fig. 2,
panel de la derecha
s
) el efecto del tratamiento LBW242 solo o en combinación con TRAIL es altamente inhibido, lo que apoya la hipótesis de que SMAC /DIABLO mimético puede actuar a través de la inducción de una ruta de activación de la caspasa-8
Para este fin las células fueron también tratados con un inhibidor de pan-caspasa zVAD, o con un inhibidor específico de la caspasa-8, zIETD.; en la Fig. 3 se informó el porcentaje de muerte celular. Como era de esperar zVAD protege las células de la apoptosis efecto de ambos tratamientos individuales y de combinación, lo que indica la implicación en la activación de caspasa LBW 242 + la muerte celular mediada por TRAIL. Por otra parte, es posible tener en cuenta que el efecto de zIETD es comparable a la de zVAD, lo que indica un papel clave de la activación de la caspasa-8 bajo la acción combinada de LBW242 y tratamientos de TRAIL (Fig. 3,
Panel
s
).
LBW242 añadió junto con TRAIL inducida por la caspasa-8 activación
los análisis bioquímicos se realizaron mediante la investigación de la expresión de diferentes proteínas implicadas en la vía apoptótica en A2780WT PINCO, A2780ADR PINCO, SKOV3 PINCO y FLIP A2780WT, A2780ADR FLIP y líneas celulares FLIP SKOV tratados como se mencionó anteriormente. En la Fig. 4 A, B y C después de 24 h los tratamientos, es posible observar que los niveles de XIAP no se ven afectados por LBW242. Este resultado está en línea con estudios anteriores que muestran que inhibe la actividad LBW242 XIAP, sin afectar su expresión [17] - [21]. Como era de esperar sobre la base de los informes anteriores [17] - [21], LBW242 downmodulates drásticamente los niveles de c-IAP1, un fenómeno claramente en todas las líneas celulares, incluidas las que sobreexpresan c-FLIP
L. El tratamiento de líneas celulares de cáncer de ovario con LBW242 indujo un efecto sobre la expresión de c-IAP2 muy diferente de la observada para c-IAP1. De hecho, 24 h de exposición de las células a LBW242 indujo una clara upmodulation de los niveles de c-IAP2 (Fig. 4), de acuerdo con un informe anterior [31]. Como se espera, c-FLIP
L sobreexpresión no modificó el efecto de LBW242 en los niveles de c-IAP2 (Fig. 4). Por otro lado, TRAIL induce un aumento moderado de c-IAP2, un hallazgo en línea con estudios anteriores [32]. En particular, la sobreexpresión de c-FLIP impidió el efecto estimulante de TRAIL en los niveles de c-IAP2 (Fig. 4). El tratamiento combinado con LBW242 y TRAIL resultó en una upmodulation marcada de los niveles de c-IAP2 (Fig. 4). Además, LBW242 no inducir o bien la caspasa-8, caspasa-9 o caspasa-3 de activación, como se puede deducir de la ausencia de cualquier reducción significativa de la procaspasa 8, -9 y -3 niveles y de la aparición de la caspasa activa fragmentos escindidos (ver Fig. 4 a a C y Fig. S3). De acuerdo con estos hallazgos, LBW242 no para inducir la escisión de PARP, un objetivo sensible de la caspasa-3 (Fig 4A a C).
Cuando se añadió LBW242 junto con TRAIL marcadamente potenció el efecto de este ligando de muerte en la caspasa-8 y la caspasa-3 de activación y la escisión de PARP en A2780 WT, A2780 ADR y SKOV líneas 3 de células transfectadas con los vectores vacíos, pero no en aquellos que sobreexpresan c-FLIP
L (Fig. 4 a a C) . Es importante tener en cuenta que la activación de la caspasa-8, provocada por TRAIL y en su mayoría por LBW242 + TRAIL, conduce a la degradación de OFERTA, logrando así la activación de la vía apoptótica intrínseca (Fig. 4 A a C). la degradación de la subasta se impidió casi por completo por c-FLIP-expresión (Fig. 4 A a C).
LBW242 mejoró el efecto pro-apoptótica de medicamentos contra el cáncer en células de cáncer ovárico
El tratamiento médico estándar de cáncer de ovario consiste en primera instancia el uso de platino y anticancerígenos taxol drogas. Por lo tanto, parecía de interés para evaluar un posible efecto cooperativo de algunos fármacos contra el cáncer, tales como cisplatino, taxol, topotecan, etopósido y doxorrubicina en combinación con LBW242. Así, en una primera serie de experimentos se trataron HEY células con cisplatino o paclitaxel o topotecan o etopósido o doxorubicina, añadimos a dos dosis, una dosis clínica inferior correspondiente a la dosis máxima observada durante la infusión de estos medicamentos a pacientes con cáncer y un 5 veces mayor dosis supraclinical, solo o en combinación con una dosis de meseta LBW242 (30 M). Los resultados de este experimento muestran claramente que LBW242 fue capaz de potenciar los efectos citotóxicos de todos estos fármacos (Fig. 5A). análisis de isobolograma mostró actividad sinérgica anti-tumor de LBW242 más cisplatino (CI = 0,82) o más paclitaxel (CI = 0,70) o más topotecán (0.72) o más etopósido (IC = 0,73) o más doxorrubicina (p = 0,78). En un segundo experimento se evaluó la capacidad de varias dosis de LBW242 para mejorar la citotoxicidad inducida por una dosis clínica de cisplatino, taxol o topotecán. Este experimento mostró que LBW242 de una manera dependiente de la dosis aumentó la respuesta citotóxica a estos fármacos, la consecución de los efectos máximos a 20-30 M dosis (Fig. 5B). isobologram análisis mostró que la actividad antitumoral sinérgica de LBW242 más topotecán (IC = 0,70) o Taxol (IC = 0,71) o cisplatino (IC = 0,82).
Sobre la base de estos hallazgos, en una segunda serie de experimentos, se centrado nuestra atención en la capacidad de LBW242 para mejorar los efectos de topotecan, un fármaco utilizado en el tratamiento del cáncer de ovario y conocido como un potencial caspasa-8 activador [33].
en la Fig. 6A es posible observar que Topotecan ejerce un marcado efecto pro-apoptótico cuando se añade en combinación con LBW242 y TRAIL en células PINCO A2780WT; la muerte celular de las células tumorales causadas por estos agentes cuando se usan en combinación es inhibida en gran medida por el pan-caspasa zVAD inhibidor-fmk y por lo tanto está mediada principalmente a través de la activación de caspasa.
En las células FLIP A2780WT la inducción de apoptosis desencadenada por la asociación entre LBW242, TRAIL y topotecan es casi completamente inhibida, lo que sugiere un papel importante de la caspasa-8 en la inducción de la muerte de las células tumorales (Fig. 6A)
.
Estas observaciones han sido confirmadas en SKOV3 y PINCO células SKOV3 FLIP (Fig. 6A). Un papel para la activación de las caspasas-8 en la muerte inducida por topotecan de las células de cáncer de ovario fue apoyado además por experimentos de cuantificación de la activación de las caspasas-8.