Extracto
Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es el tipo más común de cáncer de pulmón, que comprende aproximadamente el 75-80% de todos los cánceres de pulmón. Gemcitabina es un fármaco de quimioterapia aprobada para el NSCLC. El objetivo de este estudio fue desarrollar una nueva estrategia para mejorar la eficacia terapéutica de gemcitabina para el NSCLC por el péptido iRGD co-administrado. Hemos demostrado que las tasas de expresión positiva de αvβ3, αvβ5 y NRP-1 en la línea celular A549 fueron 68,5%, 35,3% y 94,5%, respectivamente. La cantidad de azul de Evans acumulada en el tumor del grupo de azul de Evans + iRGD fue de 2,5 veces la del grupo de azul de Evans. Las tasas de inhibición del crecimiento de los tumores del grupo iRGD, el grupo de gemcitabina y el grupo Gemcitabina + iRGD fueron 8%, 59,8% y 86,9%, respectivamente. Los resultados de los estudios mostraron que la expresión del mecanismo de PCNA en el grupo de gemcitabina + iRGD disminuyó 71,5% en comparación con el que en el grupo de gemcitabina. La tasa de apoptosis en el grupo de gemcitabina + iRGD era 2,2 vez la del grupo de gemcitabina. Por lo tanto, el péptido iRGD de penetración del tumor puede mejorar la capacidad de penetración del tumor y la eficacia terapéutica de la gemcitabina en el xenoinjerto A549. La aplicación combinada de gemcitabina con iRGD puede ser una estrategia novedosa para mejorar la eficacia terapéutica clínica de gemcitabina en pacientes con CPNM
Visto:. Zhang Q, Zhang Y, K Li, Wang H, Li H, Zheng J (2015) Una nueva estrategia para mejorar la eficacia terapéutica de gemcitabina de células no pequeñas de cáncer de pulmón por el tumor penetrante péptido iRGD. PLoS ONE 10 (6): e0129865. doi: 10.1371 /journal.pone.0129865
Editor Académico: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, ITALIA
Recibido: 25 Octubre, 2014; Aceptado: 13-may de 2015; Publicado: 12 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK2012146, http://www.jstd.gov.cn/), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81301946, http://www.nsfc.gov.cn/), Dirección Provincial de Jiangsu Fundación para la Educación de (JHB2012-34, http://www.ec.js.edu.cn/), proyecto financiado por la Fundación de china Postdoctoral Ciencia (2013M540467, http://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), y la Fundación Xuzhou Medical College (2012KJZ23, http://www.xzmc.edu.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores declaran que no tienen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo y continúa mostrando una incidencia creciente [1, 2]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es el tipo más común de cáncer de pulmón, que comprende aproximadamente 75 a 80% de todos los cánceres de pulmón [3]. El diagnóstico se hace con frecuencia en los pacientes con enfermedad en estadio avanzado, y en casi dos tercios de todos los casos, el cáncer ya se ha diseminado más allá de un área localizada en el momento del diagnóstico [4-6]. Esto limita las opciones para la terapia y conduce a un mal pronóstico, con una supervivencia media de menos de 12 meses [7, 8]. La mayoría de los pacientes con NSCLC se presentan con enfermedad no resecable, y por lo tanto, las opciones actuales de tratamiento de la quimioterapia y la radioterapia son paliativos en el mejor de [7, 9]. Muchos fármacos citotóxicos tradicionales, incluyendo vindesina, carboplatino, etopósido, ifosfamida, ciclofosfamida y mitomicina, se han utilizado como monoterapia en casos de NSCLC. En los últimos años, algunos de los nuevos agentes quimioterapéuticos tales como vinorelbina, paclitaxel, docetaxel y gemcitabina también se han aplicado para el tratamiento de NSCLC. Sin embargo, estos agentes quimioterapéuticos sólo ofrecen pequeñas mejoras en la supervivencia global [10].
Gemcitabina es un análogo de la desoxicitidina que se convierte in vivo en metabolitos activos, incluyendo di- difluorodesoxicitidina y trifosfato de [11]. El análogo de trifosfato de gemcitabina sustituye a uno de los bloques de construcción de ácidos nucleicos (en este caso, citidina) durante la replicación del ADN. Este proceso de crecimiento detenciones tumor y en última instancia conduce a la apoptosis. Otro objetivo de la gemcitabina es la ribonucleótido reductasa. El análogo de difosfato se une al sitio activo de la ribonucleótido reductasa y de forma irreversible la enzima inactiva. Una vez que se inhibe la enzima, la replicación y reparación del ADN se terminan, y se induce la apoptosis [11-13]. La gemcitabina ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) como tratamiento para CPNM avanzado y metastásico, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de mama solo o en combinación con otros fármacos [14].
los ensayos clínicos han demostrado que la gemcitabina podría prolongar la supervivencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes con NSCLC avanzado [14, 15]. Algunos estudios han informado de que la gemcitabina produce una incidencia de respuesta que superan el 20% cuando se utiliza como agente único [14, 16, 17]. Sin embargo, a menudo no gemcitabina para lograr un control adecuado de las enfermedades debido a la insuficiente citotoxicidad a las células tumorales y los efectos secundarios intolerables. La mediana de supervivencia se extiende por sólo 2-4 meses, y la mayoría de los pacientes mueren de progresión de la enfermedad [7, 9]. Por lo tanto, un simple aumento de la dosis no puede mejorar la condición de los pacientes; por el contrario, esto puede dar lugar a efectos secundarios graves.
Estudios anteriores han demostrado que el cruce de la pared vascular y la penetración en el parénquima tumoral contra la presión intersticial elevada en los tumores siguen siendo un reto importante para la terapéutica eficacia de la mayoría de los fármacos clínicos [18]. Algunos fármacos contra el cáncer sólo puede penetrar una distancia de 3 a 5 diámetros celulares de los vasos sanguíneos en los tumores sólidos [19]. Por ejemplo, la concentración de doxorrubicina disminuye exponencialmente a medida que la distancia de los vasos sanguíneos del tumor aumenta, y alcanza la mitad de su concentración perivascular a una distancia de aproximadamente 40 m [20]. La distribución de Trastuzumab (Herceptin) en la región interior de xenoinjertos de tumores de mama también es muy heterogénea, lo que se traduce en una falta de exposición de muchas células tumorales a los niveles detectables de la droga [21]. Por lo tanto, el aumento de la permeabilidad de tumor puede ser un enfoque útil para mejorar la eficacia terapéutica de los medicamentos de quimioterapia.
iRGD es un péptido de penetración tumoral (CRGDK /RGPD /CE) que tiene una permeabilidad específica en los tejidos tumorales y en el vasculatura del tumor [22]. El tripéptido RGD de iRGD puede obligar a la αvβ3 y αvβ5 integrinas, las expresiones de los cuales se restringen en gran medida a los tumores (incluyendo la vasculatura del tumor y las células) [22, 23]. Cuando iRGD se une a integrinas, el enlace peptídico entre los aminoácidos K y G es proteolíticamente escindida por las proteasas asociadas a la superficie de células; a continuación, la Regla C-end críptica (CendR) motivo (CRGDK /R) está expuesto. El motivo CendR se une a neuropilina-1 (NRP-1). La activación de NRP-1 aumenta la permeabilidad de los vasos sanguíneos y los tejidos tumorales, que permite a los fármacos para penetrar en el tejido interno del tumor mucho más fácilmente [22-24]. Se ha confirmado que tiene iRGD valioso potencial como una sonda de orientación para la formación de imágenes molecular de tumores y para la administración de fármacos, y puede mejorar la eficacia de los fármacos hasta 3 veces [24].
En este estudio, hemos combinado con gemcitabina iRGD para el tratamiento de xenoinjertos de ratones desnudos de NSCLC humanos establecidos con la línea celular A549. Nuestros resultados demuestran que iRGD podría estimular eficazmente gemcitabina para inhibir la proliferación de células tumorales e inducir la apoptosis de células tumorales. La in vivo la eficacia terapéutica también fue significativamente mayor. Estos resultados sugieren que la terapia de combinación con iRGD puede ser un método prometedor para mejorar la eficacia clínica de gemcitabina para el tratamiento del NSCLC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
La A549 línea celular de NSCLC humano derivado fue adquirido de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), y se cultivaron en medio F-12K (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) con un 10% del feto de suero bovino (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) y 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.).
La citometría de flujo
Un total de 1 × 10
6 células A549 se incubaron con anticuerpos marcados con fluorescencia diluidos en 100 de solución salina tamponada con fosfato l (PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron, se suspendieron y se evaluaron con una máquina de FACS (FACSCanto II, Becton-Dickinson, EE.UU.). Un anticuerpo control de isotipo emparejado se utilizó en todos los análisis. Por último, todos los datos se analizaron mediante el software FlowJo (Árbol Star, EE.UU.). anticuerpo integrina αvβ3 conjugado con FITC de ratón anti-humana y la integrina αvβ5 anticuerpos se adquirieron de Chemicon (CA, EE.UU.). El anticuerpo de control de isotipo emparejado, ratón conjugado con FITC IgG1k, se adquirió de eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.). ratón conjugado con PE anti-humano NRP-1 anticuerpo y su control de isotipo se adquirieron de MACS Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Renania del Norte-Westfalia, Alemania).
Los ratones y los experimentos in vivo
experimentos in vivo fue de 6 semanas de edad ratones hembra Balb /c desnudos (River Laboratory Animal Vital Technology Co., Ltd, Beijing, china), que se encuentra en las instalaciones de animales libres de patógenos específicos of Experimental Animal Center, Xuzhou Medical College (china ). Los animales se alojaron con un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, de la temperatura (22 +/- 1 ° C) y humedad (55 +/- 5%) ambiente controlada. Todos los ratones se les permitió libre acceso al agua estéril y la comida. Todas las jaulas alojan hasta 6 animales y virutas de madera contenidas y un sistema de suministro de aire independiente. Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados y revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Academia Provincial de Jiangsu de la medicina china (SCXK 2012-0005). Durante los experimentos in vivo, los animales en todos los grupos experimentales se examinaron diariamente para la actividad física. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical.
modelo de tumor
Se estableció el modelo de NSCLC humano como se describe anteriormente [25]. En resumen, 1 × 10
7 células A549 se inyectaron en las axilas de las extremidades anteriores de izquierda de 6 ratones BALB /c ratones desnudos. Cuando los tumores crecieron hasta aproximadamente 150 mm
3, los tumores se cosecharon y se segmentan en bloques de tejido (4-6 mm
3 de tamaño). Luego, las extremidades anteriores de las axilas izquierda de ratones BALB /c ratones desnudos fueron inoculados s.c. con los bloques de tejido utilizando un trocar. Los ratones fueron tratados cuando los tumores crecieron hasta el tamaño deseado.
inmunofluorescencia tinción
Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm
3, los ratones fueron sacrificados y los tumores se disecaron y se seccionaron en un criostato. Las secciones de los cuatro grupos (n = 3) se incubaron durante la noche a 4 ° C con el mismo αvβ3 anti-humano, αvβ5 y sus anticuerpos de control de isotipo como los utilizados en el análisis de citometría de flujo. Las secciones de los dos grupos se tiñeron durante la noche a 4 ° C con una NRP-1 anticuerpo anti-humano de conejo primario (Abcam, Beverly, MA, EE.UU.) y su anticuerpo de control de isotipo (Abcam, Beverly, MA, EE.UU.). A continuación, las secciones se tiñeron con una cabra 549 conjugado anti-IgG de conejo DyLight (H + L) anticuerpo secundario (EarthOx, San Francisco, CA, EE.UU.) a 37 ° C durante 1 hora. Todas las secciones fueron observadas y fotografiadas con un microscopio de fluorescencia (DS-Ri1, Nikon, Japón).
Tumor de ensayo de permeabilidad
Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 150 mm
3, un total de 50 mg /kg de azul de Evans, 4 mg /kg iRGD, 50 mg /kg Evans Blue + 4 mg /kg iRGD en 200 l de PBS como vehículo, o 200 l de PBS solo se inyectaron en los cuatro grupos de ratones portadores de tumores (n = 3), respectivamente. Treinta minutos después, los ratones fueron anestesiados por el hidrato de cloral y se perfundieron a través del corazón con PBS con 1% de BSA. A continuación, se recogieron los órganos y los tejidos tumorales. Para Evans Blue cuantificación, 10 l se añadió N, N-dimetilformamida por cada 10 mg de tejido. Después de la homogeneización, las mezclas se incubaron a 37 ° C durante 24 horas, las mezclas se centrifugaron a continuación, y se cosecharon los sobrenadantes. Por último, la cuantificación se realizó mediante la medición de la absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro (BioTek Epoch, EE.UU.).
In vivo estudios de eficacia
Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm
3 después de 10 días, los ratones se dividieron en cuatro grupos (n = 6). En total, 100 mg /kg de gemcitabina (Merck, Darmstadt, Alemania), 4 mg /kg iRGD, 100 mg /kg de gemcitabina + 4 mg /kg iRGD en 200 l de PBS como vehículo, o 200 l de PBS solo se inyecta en el los ratones de los cuatro grupos a través de la vena de la cola. Las inyecciones se realizaron dos veces por semana durante un total de 8 veces. El volumen de los tumores se midió en dos direcciones perpendiculares con un calibre y el peso de los ratones nude se calculó cada tres días. El volumen se midió utilizando la siguiente fórmula: V = 0,5 x (W
2 × L), donde el volumen V = tumor, W = menor perpendicular diámetro y L = el más grande perpendicular diámetro. En el día 30, se sacrificaron los ratones, se recogieron y se pesaron los tumores. La relación de inhibición del crecimiento tumoral (TGIR) se calculó utilizando la fórmula TGIR = (W - W
t) /W × 100%, en donde W es el peso medio del tumor del grupo de control y W
t es el promedio el peso del tumor del grupo de tratamiento. Todos los tumores se cortaron en dos partes, respectivamente, y se procesaron de la siguiente descripción.
tinción inmunohistoquímica
Una media de cada tumor cosechada al final del estudio de tratamiento fueron fijadas en 10% neutro formalina tamponada, a continuación, incrustado en parafina, y se corta en secciones 3-5μm [26]. Los experimentos se realizaron con un sistema de estreptavidina-peroxidasa (SP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (ZSGB-BIO, Beijing, China). pcna (PCNA) se detectó con un anti-PCNA anticuerpos (Abcam, Beverly, MA, EE.UU.). Imaging se realizó mediante microscopía de fluorescencia (DS-Ri1, Nikon, Japón). Para determinar el índice de IOD de PCNA, cinco áreas visuales representativas que fueron positivos para PCNA se examinaron a partir de cada tumor. El índice de PCNA para cada área seleccionada se analizó mediante software IPP.
ensayo TUNEL
Las secciones de parafina se prepararon como se ha descrito anteriormente. Se detectaron las células apoptóticas usando un Kit mediada por TdT fin de etiquetado dUTP nick (TUNEL) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche, Mannheim, Alemania). El número de células TUNEL positivas se contó en cinco campos seleccionados al azar de cada tumor, y el índice de apoptosis para cada campo se calcula como el porcentaje de células TUNEL positivas con relación a 100 células seleccionadas al azar.
Western blot El análisis
La otra mitad de cada tumor fue congelaron en nitrógeno líquido. A continuación, se extrajo la proteína total. PCNA se detectó por transferencia Western normal con el mismo anticuerpo anti-PCNA que el utilizado en el experimento de inmunohistoquímica. IRDye 800CW IgG de cabra anti-conejo (H + L) de anticuerpos (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.) se utilizó como anticuerpo secundario. β-actina se detectó también como un control interno. Las imágenes se obtuvieron por Odyssey (LI-COR, EE.UU.) y cuantificaciones de intensidad de las bandas de Western blot se realizaron mediante el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
El análisis estadístico
versión
SPSS 16.0 para Windows fue utilizado para todos los análisis. Los datos cuantitativos se presentan como la media ± desviación estándar (SD); una comparación entre dos grupos se realizó por muestra independiente t-test, mientras que múltiples muestras se compararon con ANOVA de una vía, con α = 0,05 como un nivel para la prueba. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0.05.
Resultados
La expresión de NRP-1, ανβ3 y ανβ5 en la línea celular A549 NSCLC humano derivado
La expresión de las integrinas se limita en gran medida a los tumores (incluyendo la vasculatura del tumor y las células), y otros sitios de la angiogénesis o reparación de tejidos [22, 27]. Neuropilina 1 también se sobreexpresa en muchos tumores [22, 28]. La capacidad de penetración de tumor de iRGD depende principalmente de las moléculas de ανβ3, ανβ5 y NRP-1 sobreexpresado en las células del cáncer [18]. Con el fin de confirmar la expresión de estas moléculas en la línea celular A549 NSCLC humano, se realizó un análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la figura 1A, las tasas de expresión positiva de αvβ3, αvβ5 y NRP-1 fueron 68,5%, 35,3% y 94,5%, respectivamente. Este resultado demuestra que la línea celular A549 se puede usar para establecer un modelo de NSCLC humano para estudiar los efectos de co-administrado iRGD
.
(A) Análisis de la expresión de αvβ3, αvβ5 y NRP-1 en las células A549 por citometría de flujo. (B) Análisis de la expresión de αvβ3, αvβ5 y NRP-1 en xenoinjertos A549 por tinción de inmunofluorescencia. Por ejemplo, el grupo experimental; CG, grupo de control. Tanto αvβ3 y αvβ5 se tiñen de verde. NRP-1 se tiñe de color rojo. Los núcleos se tiñen de color azul. Ampliación, × 400; Las barras de escala = 50 micras.
Para confirmar la expresión de ανβ3, ανβ5 y NRP-1 en el tejido tumoral, hemos desarrollado un modelo de xenoinjerto c desnudos BALB /ratón con la línea celular A549 NSCLC humano. La expresión de αvβ3, αvβ5, y NRP-1 se detectó además por la tinción de inmunofluorescencia. Como se muestra en la figura 1B, αvβ3 (izquierda), αvβ5 (medio) y NRP-1 (derecha) se sobreexpresa en los tejidos de xenoinjerto.
Tumor-penetración de Evans Blue se coadministra con iRGD
para confirmar el efecto in vivo de la iRGD péptido de penetración del tumor, colorante azul de Evans fue utilizado como un fármaco modelo para determinar si iRGD puede promover la absorción de un fármaco en un tumor [18]. Azul de Evans es un colorante de unión a la albúmina que puede penetrar en los órganos a través de la sangre y los órganos teñir azul. En comparación con los controles, los tumores del grupo de azul de Evans + iRGD se tiñeron de un azul más profundo, que era visible a simple vista. Sin embargo, el color azul de los órganos normales, incluyendo el corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón, no era evidente (Fig 2A y 2B). Para confirmar aún más que el efecto de iRGD para promover específicamente la absorción de colorante azul de Evans en el tejido tumoral, el azul de Evans en los tumores y los órganos se extrajo y se analizó cuantitativamente por espectrofotometría. Los resultados mostraron que, en general, la cantidad de azul de Evans en el grupo de azul de Evans y en el grupo de Evans Blue + iRGD fue mayor que en el grupo de PBS o iRGD (Fig 2C). La cantidad de azul de Evans en los tumores del grupo de azul de Evans + iRGD fue de 1,5 veces mayor que en el grupo de azul de Evans (Fig 2C). Con respecto a los otros órganos, no se observó ninguna diferencia aparente entre el grupo de azul de Evans y el grupo de Evans Blue + iRGD (Fig 2C). Estos datos demostraron que iRGD tiene el potencial de promover específicamente la absorción de drogas y les permiten penetrar en el tumor
.
(A) Las imágenes representativas de la acumulación de azul de Evans en los órganos normales y en tumores de los ratones que recibieron diferentes tratamientos. La intensidad de color azul indica la cantidad de azul de Evans acumulada. (B) Las imágenes del tumor en (A). (C) Cuantificación de azul de Evans se extrae de los tumores y órganos en (A) por OD600 medición. n = 3; Las barras de error, media ± SEM; ***
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La eficacia terapéutica de gemcitabina co-administrado con iRGD
Para determinar la concentración apropiada de gemcitabina para los experimentos in vivo, cuatro dosis de gemcitabina (80 mg /kg, 100 se han usado mg /kg, 120 mg /kg y 140 mg /kg) para el tratamiento de cuatro ratones del grupo dos veces una semana para dos semanas, respectivamente. Dos semanas después, los ratones de 80 mg /kg y 100 mg /kg grupos apareció normal. Sin embargo, era evidente que los ratones de 120 mg grupo /kg carecía de energía y experimentó una pérdida de apetito. Además, los ratones de 140 mg grupo /kg tuvo diarrea. Para reducir el impacto de los efectos secundarios, se optó por la dosis de 100 mg /kg para los experimentos in vivo.
Para determinar si la eficacia terapéutica de gemcitabina se verá reforzada cuando se administra en combinación con iRGD, gemcitabina y iRGD se administraron conjuntamente para el tratamiento de los ratones con xenoinjertos A549 como se describe en la sección Métodos. Como se muestra en la figura 3A, los tumores del grupo de gemcitabina + iRGD crecieron más lentamente que los del grupo de gemcitabina, y esta diferencia fue estadísticamente significativa. Esta observación también se confirmó mediante un análisis del peso del tumor (Fig 3B). se analizó aún más la tasa de inhibición del crecimiento de los tumores. El grupo iRGD, el grupo de gemcitabina, y el grupo de gemcitabina + iRGD mostraron una tasa de crecimiento de inhibición de tumor de 8%, 59,8% y 86,9%, respectivamente. Estos resultados demostraron que iRGD podría mejorar la eficacia terapéutica de gemcitabina para xenoinjertos de NSCLC humanos cuando fueron administrados conjuntamente. El análisis cuerpo cambio de peso de los ratones experimentales mostró que el peso corporal de los ratones, tanto en el grupo de gemcitabina y el grupo Gemcitabina + iRGD disminuyó aproximadamente 5% al final del experimento. Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre estos dos grupos (figura 3c). Estos resultados demostraron que iRGD obviamente no exacerbar los efectos secundarios de la gemcitabina.
(A) La curva de volumen del tumor durante el tratamiento. Las flechas indican el momento de la inyección. El día cuando el tratamiento comenzó se registró como día 0. El volumen del tumor se midió una vez cada tres días hasta el día 30. (B) de peso medio del tumor de cada grupo al final del tratamiento. (C) La curva de cambio de peso corporal de los ratones durante el experimento. n = 6. Las barras de error, media ± DE; ns: no significativo; ***
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La inhibición de la proliferación de las células después del tratamiento con la administración conjunta de gemcitabina y iRGD
La gemcitabina ejerce un efecto terapéutico contra el cáncer a través de la inhibición de la síntesis de ADN en las células cancerosas y interrupción de su progreso de G1 a la fase S [3, 29, 30]. PCNA, una proteína de 36-kDa, se expresa principalmente durante la fase S y la fase G2 temprana del ciclo celular en células en proliferación [31]. Por lo tanto, PCNA se puede utilizar como un marcador de la proliferación celular. Para confirmar aún más la función de iRGD en el aumento del efecto antitumoral de la gemcitabina, el nivel de expresión de PCNA en los tumores se detectó por tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en la figura 4A, el nivel de expresión de PCNA se redujo significativamente en los ratones que fueron tratados con gemcitabina (con o sin iRGD) en comparación con el nivel de expresión en ratones que recibieron PBS o iRGD; el nivel de expresión de PCNA fue menor en los ratones que fueron tratados con gemcitabina + iRGD comparación con los ratones que fueron tratados con gemcitabina sola. Para el análisis cuantitativo de la figura 4A, el nivel de expresión de PCNA en el grupo de gemcitabina + iRGD se redujo aproximadamente 71,5% en comparación con la del grupo de gemcitabina, y esta diferencia fue estadísticamente significativa (Fig 4B). Además, el tejido tumoral del grupo de gemcitabina + iRGD mostró anomalías estructurales en nidos de cáncer y cambios morfológicos en la mayoría de los núcleos. Los cambios morfológicos en los núcleos se describirán en detalle más adelante en el manuscrito
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(A) análisis de tinción inmunohistoquímica. células PCNA positivas en las secciones se tiñen de color marrón. Los núcleos se tiñen de azul. se dan cifras representante de cada grupo; n = 6; Ampliación, × 400; Barras de escala = 50 m. (B) Los correspondientes resultados de los análisis cuantitativos de PCNA se muestran en (A). Cinco campos de cada sección de tejido del tumor fueron seleccionados al azar para el cálculo del valor IOD de la región positiva a través de software IPP, lo que indica la cantidad de la expresión del antígeno. (C) Análisis de transferencia Western. Se extrajo la proteína total de los tejidos tumorales. PCNA se detectó con β-actina como control interno. n = 3. (D) Los resultados de los análisis cuantitativos de PCNA se muestran en (D). La intensidad de cada banda se analizó mediante software ImageJ. Las intensidades medias de PCNA fueron normalizados a ß-actina. Las barras de error, media ± DE; ns: no significativo; ***
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Para confirmar aún más el nivel de expresión de PCNA, se extrajo la proteína total de los tejidos tumorales en cada grupo. Los niveles de PCNA se detectaron por transferencia de Western con β-actina como control interno. Cada tira se desea digitalizar y un análisis cuantitativo se realizó con el software ImageJ. El nivel de expresión de PCNA en el tejido tumoral de los ratones en el grupo de gemcitabina + iRGD fue significativamente reducido en comparación con la de los ratones en el grupo de gemcitabina (Fig 4C y 4D).
conjunto, estos resultados confirman además que el la eficacia terapéutica de gemcitabina se mejoró cuando se co-administra con el péptido de penetración tumor iRGD.
inducción de apoptosis por co-administrado gemcitabina y iRGD
se ha demostrado que la gemcitabina puede inhibir la replicación y reparación del ADN, lo que conduce finalmente a la celda apoptosis [3]. Para confirmar la eficacia terapéutica mejorada de co-administrado gemcitabina y iRGD, se detectaron células apoptóticas en los xenoinjertos tratados usando un ensayo de TUNEL. Como se muestra en la figura 5A, las células apoptóticas más eran visibles en los tumores del grupo de gemcitabina + iRGD que en los tumores del grupo de gemcitabina. El índice apoptótico se definió como el porcentaje de células TUNEL positivas en comparación con el número total de células. De acuerdo con el análisis estadístico se muestra en la figura 5B, la tasa de apoptosis del grupo Gemcitabina + iRGD era 2,2 vez la del grupo de gemcitabina. Estos resultados confirmaron además que iRGD mejora la eficacia terapéutica de la gemcitabina en los xenoinjertos de NSCLC.
células (A) apoptóticas en los tejidos tumorales se detectaron mediante un ensayo de TUNEL. núcleos TUNEL-positivas se tiñen de color marrón, y los núcleos TUNEL-negativas se tiñen de azul. Los valores indicados son representativos de los seis tumores en cada grupo. Las flechas indican los cuerpos apoptóticos. Ampliación, × 400; Barras de escala = 50 m. (B) Análisis cuantitativo del índice de apoptosis en cada grupo. El porcentaje de células TUNEL-positivas se contarán a partir de 100 células tumorales seleccionadas al azar por sección. Cinco secciones se contaron por tumor. n = 6; Las barras de error, media ± DE; ***
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Discusión
Este estudio tuvo como objetivo volver a evaluar el uso de péptidos iRGD, demostró que aumentaba la acumulación y la eficacia terapéutica de los medicamentos en el xenoinjerto de NSCLC establecida con células A549 línea que mostró una alta expresión de αvβ3, αvβ5 y NRP-1. Nuestros datos muestran que iRGD era capaz de aumentar significativamente el tumor-penetración de Evans Blue, así como la eficacia terapéutica de gemcitabina en el xenoinjerto de NSCLC humano. La evaluación posterior demostró que la proliferación y la apoptosis de las células tumorales en el grupo iRGD + gemcitabina fue más inhibió significativamente que en los grupos de control.
En 2009, Teesalu et al. primero reportado el péptido regla C-terminal (iRGD), y demostró que el péptido posee la actividad de la célula, vascular, y la penetración del tejido NRP-1 dependiente de [32]. Los informes posteriores mostraron que iRGD podría mejorar la difusión y la eficacia antitumoral de la doxorubicina intratumoral [33-35], paclitaxel [36, 37] y endostatina [38] mediante la conjugación con estos fármacos o vehículos cargados con el fármaco en experimentos con animales. Los otros informes demostraron que iRGD también podría mejorar la acumulación y antitumoral eficacia intratumoral de paclitaxel, doxorrubicina, Transtuzumab [24, 39], cisplatino [40], por co-administración con estos fármacos. En 2014, Akashi et al. La gemcitabina se informó que coadministrated con iRGD para tratar el cáncer de páncreas en modelos murinos [41]. A nuestro entender, este estudio demostró en primer lugar, la eficacia de la co-administrado iRGD y gemcitabina en el xenoinjerto de NSCLC humana establecida con la línea celular A549.
El informe de Akashi mostraron que los modelos de cáncer de páncreas que sobreexpresan NRP-1 son sensibles a las iRGD coadministración. El tratamiento con gemcitabina más iRGD péptido resultó en una reducción significativa del tumor en comparación con la monoterapia con gemcitabina en los modelos de cáncer de páncreas establecidos con las líneas de células [41]. Nuestros resultados mostraron que ανβ3, ανβ5 y NRP-1, que median la actividad tumoral-penetración de iRGD, se sobreexpresa en la línea celular A549 humana NSCLC y xenoinjerto establecida con esta línea celular. La eficacia terapéutica de gemcitabina fue significativamente mayor de co-administrado iRGD en murino modelo de cáncer de NSCLC. En conjunto, estos estudios confirmaron los efectos de iRGD para mejorar la difusión intratumoral y la eficacia contra el cáncer en modelos de cáncer sobreexpresados-NRP-1.
La gemcitabina es un análogo de nucleósido ampliamente utilizado como la quimioterapia de primera línea del CPNM avanzado [42 ]. et al Gridelli. informó que la tasa de respuesta (RR) entre 233 pacientes recibieron gemcitabina fue del 16%, mientras que la mediana del tiempo hasta la progresión y la supervivencia global (SG) fueron de 17 semanas y 28 semanas, respectivamente [43]. Las millas-2G estudio de fase 2 de gemcitabina como agente único en pacientes ancianos con CPNM avanzado mostró un RR de 17,6%, una mediana de tiempo hasta la progresión de la enfermedad de 16,1 semanas y la mediana de SG de 41,3 semanas [44]. Varios otros estudios que emplean la gemcitabina sola mostraron misma actividad con RR y la mediana de la SLP y la SG que van desde 16-38.5%, 3-5.4 y 6.6-7.7 meses, respectivamente [45-48]. Por lo tanto, la eficacia terapéutica de gemcitabina para NSCLC tiene el espacio para ser mejorado aún más. Nuestros resultados muestran que el péptido iRGD aumenta los efectos de co-administrado gemcitabina en el xenoinjerto NSCLC. Estos resultados demostraron la posibilidad de que iRGD mejora el efecto de la gemcitabina en pacientes con CPNM.
Sin embargo, la eficacia de iRGD sólo es apreciable en la línea celular que emplea. La aplicación clínica debe ser considerado cuidadosamente. La comprensión actual del mecanismo por el que iRGD mejora la eficacia terapéutica de gemcitabina para el NSCLC es limitado. Aunque no se observaron efectos secundarios evidentes en nuestro estudio, la seguridad de esta terapia de combinación todavía necesita más evaluación. El motivo de CendR iRGD también puede ser utilizado por los virus y toxinas microbianas con el fin de ganar la entrada en las células y se extendió dentro de los tejidos del cuerpo [49, 50]. iRGD también puede promover la absorción de gemcitabina en los tejidos normales que están dañados, y la reparación de los tejidos que sigue puede causar más daño al cuerpo.
Conclusión
En resumen, a través de un A549 NSCLC humano nude modelo de xenoinjerto de ratón, se confirmó que iRGD puede promover la inhibición de la proliferación de células tumorales y la inducción de apoptosis por gemcitabina y por lo tanto mejorar la eficacia terapéutica de gemcitabina in vivo. La co-administración de gemcitabina y iRGD puede ser una nueva estrategia para mejorar la eficacia terapéutica clínica de gemcitabina en pacientes con CPNM.