Extracto
En este documento, se presenta una novedosa plataforma de imágenes para estudiar los efectos biológicos de la radiofrecuencia no invasiva (RF) eléctrica hipertermia cáncer de campo. Este sistema permite un
en tiempo real microscopía intravital (IVM) de imágenes in vivo Red de alteraciones biológicas de radiofrecuencia inducida en tales como cambios en la estructura de los vasos y la perfusión del fármaco. Nuestros resultados indican que el sistema IVM es capaz de manejar la exposición a alta potencia eléctricos campos sin inducir daños en el hardware o de imagen artefactos significativos. Por otra parte, las duraciones cortas de baja potencia (& lt; 200 W) la exposición de radiofrecuencia aumento del transporte y la perfusión de trazadores fluorescentes en los tumores a temperaturas inferiores a 41 ° C. deformaciones de los vasos y la coagulación de la sangre se observaron para las temperaturas de tumores alrededor de 44 ° C. Estos resultados ponen de manifiesto el uso de nuestra plataforma integrada de imágenes GIV-RF como una nueva y poderosa herramienta para visualizar la dinámica y la interacción entre la energía de radiofrecuencia y los tejidos biológicos, órganos y tumores
Visto: Corr. SJ, Shamsudeen S, Vergara LA, Ho JC-S, Ware MJ, Keshishian V, et al. (2015) Una nueva plataforma de imaginería para los efectos biológicos Visualizando de radiofrecuencia no invasiva eléctrico-campo del cáncer de hipertermia. PLoS ONE 10 (8): e0136382. doi: 10.1371 /journal.pone.0136382
Editor: Arrate-Muñoz Barrutia, Universidad Carlos III de Madrid; Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, ESPAÑA
Recibido: 3 Junio, 2014; Aceptado: 3 Agosto 2015; Publicado: 26 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Corr et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyado por el NIH Ciencia física en el Programa de Oncología (U54CA143837), los Anderson Cancer Center subvenciones de apoyo NIH MD (CA016672), el Fundación Welch (C-0627, 616 LJW), una beca de investigación sin restricciones de la Kanzius 617 Fundación para la investigación (SAC, Erie, PA), y el Centro Nacional para el Avance de translación de Ciencias de los Institutos nacionales de Salud en números de adjudicación TL1TR000369 y UL1TR000371. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las interacciones de las ondas de radio de alta frecuencia (13,56 MHz) con los tejidos y los nanomateriales en los tejidos biológicos están siendo investigados actualmente como una plataforma terapéutica para la terapia de hipertermia cáncer no invasivo. Las propiedades dieléctricas únicas de los tejidos cancerosos favorecen de radiofrecuencia (RF) de absorción de energía y la conversión al calor y es la hipótesis de ser acelerado aún más mediante el uso de RF-absorción de energía nanomateriales tales como nanopartículas de oro y nanotubos de carbono de pared simple. calefacción tumor mejorado es debido a las pérdidas dieléctricas más grandes dentro de tejido tumoral en comparación con los tejidos normales [1], y ha encontrado aplicaciones en la hipertermia clínica [2]. Gran parte del trabajo se ha centrado en la medición e interpretación de la distribución de temperatura [3] y las propiedades dieléctricas de varios tejidos animales sanos y cancerosos a través de radiofrecuencias y microondas [4-6]. En comparación con otros hipertermia fototérmica a base de nano enfoques de terapia RF ofrece la ventaja de una mayor profundidad de penetración de tejido (~ 5-30 cm), que es debido a las longitudes de onda relativamente largas de RF (~ 22 m en 13,56 MHz), en comparación con el subsuelo profundidades de penetración milímetro de infrarrojos (IR) y del infrarrojo cercano luz (NIR).
En un intento por aumentar aún más las tasas diferenciales de calefacción y la citotoxicidad inducida por el cáncer de RF, varios estudios han demostrado las características de calentamiento [7- 12]; toxicidad biológica [13-20]; interacciones eléctricas [11, 21-24]; y la viabilidad de las interacciones de nanomateriales con energía de RF y su uso como un adyuvante potencial hipertermia médica. A pesar de la continua evolución de las diversas funciones que los nanomateriales juegan en la generación de calor localizado y la citotoxicidad, tanto dentro de las soluciones acuosas simplificados y materiales biológicos, mucho trabajo se ha logrado hacia la comprensión de la ciencia básica detrás de las interacciones de RF con los tejidos biológicos con el potencial de sinergia que existe con agentes quimioterapéuticos clínicamente aprobados, como Abraxane, cetuximab, y gemcitabina [25]. Los artículos de revisión que se hace referencia por Collins
et al
. y Liu
et al
. ofrecer una visión completa y concisa del campo [26, 27].
Un medio para visualizar directamente la interacción entre tejidos biológicos y eléctricos-campos de RF, lo que permite comprender los procesos fundamentales y la ciencia básica detrás de esta terapia, ha estado ausente. Hasta el momento no ha habido ningún diseño para la captura de estos eventos dinámicos, sobre todo debido a la dificultad en la integración de un generador de campo eléctrico de alta potencia en varias modalidades de imagen. Aquí, se presenta un sistema integral que combina la exposición a RF de alta resolución con microscopía intravital (IVM) (RF-IVM) para permitir
en tiempo real in vivo
imágenes fluorescentes de los efectos biológicos inducidos por RF. IVM, utilizando la tecnología de excitación multifotónica o confocal y, es una técnica poderosa para los animales vivos de imágenes en alta resolución con la capacidad de alcanzar profundidades de tejido de varios cientos de micrómetros. Con esta técnica, los investigadores son capaces de evaluar los tejidos y las respuestas celulares en el tiempo y en el espacio en tres dimensiones en el tejido vivo bajo condiciones fisiológicas naturales [28]. Los datos presentados en este estudio demuestran que: (i) un sistema generador de RF de alta potencia (200 W, ~ 15 kV /m) se puede éxito de ajuste trasero en un sistema Nikon A1R IVM y sin daños en el hardware o de imagen artefactos; y (ii) el sistema de IVM-RF integrado permite la obtención de imágenes de eventos dinámicos de hipertermia inducida por leves (& lt; 41 ° C), tales como aumento de la perfusión del tumor de trazadores fluorescentes administrados por vía sistémica (albúmina y FITC-dextrano), así como la deformación buque y la coagulación observado en todo el rango de temperatura de 44-49 ° C. Teniendo en cuenta estos resultados, podemos anticipar que el sistema de MIV-RF nos permitirá imagen eventos biológicos de RF inducida tales como cambios en la permeabilidad vascular, alteraciones en la integridad del tejido, influencia en la nanopartícula y la acumulación del fármaco, penetración en el tejido, y los eventos de migración celulares.
Materiales y Métodos
portable-RF sistema
una fotografía del sistema portátil de radiofrecuencia (RF-p) sistema junto con una representación esquemática de la configuración experimental p-RF es ilustrado en la figura 1A y 1B. dimensiones completas se pueden encontrar en la figura S1 El dispositivo es alimentado por una de 200 W de frecuencia fija (13,56 MHz) fuente de alimentación refrigerado por agua (Seren, RX01 /LX01 serie, Sistemas de Potencia Industrial, Inc.), que está conectado a través de un alto capacidad de carga -actual cable de 50 Ω coaxial. El espécimen de estar expuestos a RF se coloca entre las cabezas transmisión y recepción (TX y RX, respectivamente). Los aumentos de temperatura se registran utilizando un diámetro exterior de fibra óptica de teflón 1 mm recubierto sondas térmicas (control de Fotones, Canadá), con una precisión de temperatura de ± 0,5 ° C, o un puerto de infrarrojos (IR) de la cámara FLIR (SC 6000, FLIR Systems, Inc., Boston, MA), con una precisión de la temperatura de ± 2 ° C (640 × 512 resolución detector InSb con una mitad de longitud de onda rango espectral IR de 3,0 a 5,0 micras). datos de la sonda térmica se capturaron con una hecha a la medida de LabVIEW instrumento virtual (National Instruments, Austin, TX). La eléctrico-campo de RF generado se caracterizó usando una sonda de campo eléctrico revestido de teflón (TherMed, LLC, Erie, PA) unido a un x ajustable, y, z etapa (Thorlabs, Inc.) para el posicionamiento ajustable, como se muestra en la figura 1C y 1D. Los detalles completos de las mediciones de campo eléctrico se pueden encontrar en S2 Fig Como puede verse en la figura 1D, la zona "activa" de la exposición de campo eléctrico RF se centra ~ 6 cm alrededor del punto medio de la cabeza de TX y se extiende ~ 1 -2 cm a través del eje x, causando un perfil de calentamiento que se reduce gradualmente a medida que la muestra se encuentra más lejos de la cabeza TX.
(a) sistema de RF portátil consta de la unidad de transmisión (TX) y la cabeza de recepción (RX) que genera un campo eléctrico de alta potencia a través de la muestra (por ejemplo, ratón). El sistema es accionado por un amplificador de potencia variable fija RF (0-200 W, 13,56 MHz) que se enfría durante la operación de un enfriador de agua. La producción de calor se controla mediante una cámara de infrarrojos (IR) o la inserción directa de sondas de fibra óptica. representación (B) Circuito del sistema de RF portátil. (C) Configuración para la extracción de las intensidades de campo eléctrico. Una sonda de campo eléctrico (EFP) se coloca en puntos específicos a lo largo de los ejes x y el eje z en entre las cabezas de TX y RX y mide la tensión en cada punto de 20 W RF-poder. (D) El campo eléctrico se deriva de los datos de voltaje y se representa como un gráfico de intensidad de contorno.
El sistema de p-RF en sí es relativamente pequeña (longitud de ~ 60 cm) en comparación con nuestra mayor modelos de RF [1, 7, 14]. Al igual que en nuestros generadores de RF anteriores, el diseño ofrece una fuerte alterna (13,56 MHz) campo eléctrico a través de las cabezas de TX y RX [29] utilizando una red LC en cascada. Sin embargo, a diferencia de nuestros sistemas anteriores, este sistema no es capacitivamente acoplada y no modela una configuración de condensador de placas paralelas ideales donde el campo eléctrico sería de aproximadamente uniforme a través de las cabezas de TX y RX. En su lugar, este sistema transmite un campo eléctrico que disminuye gradualmente a través de las cabezas TX-RX y por lo tanto se clasifica como una "configuración de terminar como combustible de transmisión".
MIV-RF sistema
Un cuadro del sistema de p-RF reequipamiento en un Nikon A1R
+ IVM se muestra en la figura 2A. La Nikon A1R
+ es un microscopio confocal de barrido láser equipada con dos mecanismos de exploración, un sistema impulsado galvanómetro convencional y un escáner de resonancia. El A1R
+ está equipado con 4 láseres de estado sólido (405, 488, 561 y 640 nm) y 4 detectores de fluorescencia, incluyendo dos PMT GaAsP. El A1R
+ también está equipado con una etapa de gran plataforma motorizada (ZDeck Prior Scientific) y una colección de objetivos con la distancia de trabajo larga que van desde la ampliación baja, amplio campo de visión (4x 0.2NA y 10x 0,4 NA), hasta alta resolución, inmersión en agua (16x 25x 0,8 NA y 1.2NA) lentes. El funcionamiento del sistema de adquisición de imágenes y son controlados por el software de Nikon NIS Elementos (v 4.0). Una vez que el instrumento de RF se ajustó a la IVM, nuestra evaluación inicial del sistema integrado implicado gradualmente aumentando la potencia p-RF (sin muestra), mientras que el control de la tensión inducida a través del chasis IVM mediante la conexión de una sonda de osciloscopio a las patillas de tierra de electrodos situados detrás de la lente del objetivo del sistema de IVM. En todos los niveles de potencia, incluyendo la mayor potencia de 200 W RF, la tensión inducida en el chasis fue de menos de 500 mV, que se considera insignificante y no se predijo para interferir con hardware. Este procedimiento de ensayo se llevó a cabo para asegurarse de que la energía de RF no fue acoplando directamente al microscopio IVM, que lo más probable causa daños electrónicos y estructurales irreversibles en el sistema de IVM. interferencias menores incluyeron mal funcionamiento del software en la forma de las ventanas del navegador abiertas al azar y texto apariencias-nos llamó a este efecto "escritor fantasma" y descubrió el origen de este efecto que se debe a los campos de RF de acoplamiento para el teclado del ordenador. Envolver el cable del teclado en torno a un balun núcleo de ferrita para reducir la interferencia de RF resuelto este problema. También se observó interferencia con la platina motorizada, que fue resuelto mediante el aislamiento de la caja del controlador de joystick con papel de aluminio.
(A) El sistema de RF integrado en el microscopio intravital (IVM) para la formación de imágenes en tiempo real bajo la exposición a RF . (B) la manipulación del ratón por la imagen-se hace una incisión para exponer y suavemente manipular el tumor 4T1 para obtener imágenes de IVM. (C) 4T1 tumor con IVM iluminación con una lente de objetivo x4.
Los modelos animales
ratones Nude (4-6 semanas de edad) se obtuvieron de Charles River Laboratories, Inc. ( Wilmington, MA). Los tumores de mama se establecieron utilizando fluorescente 4T1 células cancerosas td-Tomate Bioware Ultra ratón rojo mamarias comprados a Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA). Los ratones se trataron y la imagen cuando los tumores alcanzaron un tamaño ~ 8 a 10 mm de diámetro. Al término de la sesión de imágenes, animales fueron sacrificados a través de CO
2 la exposición seguido por dislocación cervical. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales institucional en Houston Metodista Instituto de Investigación y de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
RF-IVM manipulaciones animales
ratones portadores de tumores 4T1 fueron expuestos por una pequeña incisión en la línea media por lo que la fascia entre la piel y el músculo fue interrumpido con un bastoncillo de algodón. Un colgajo de piel invertida se elevó con una gasa de algodón laminado. Las imágenes de los ratones manipulados para ser RF-IVM se muestran en la figura 2B y 2C. Los ratones fueron anestesiados utilizando isoflurano 2-3% (Aerrane; Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EE.UU.) se administra a través de un sistema de vaporizador de isoflurano (E-Z Systems, Palmer, PA, EE.UU.). Los ratones fueron mantenidos en un cojín de calentamiento durante los experimentos de preparación y formación de imágenes quirúrgicas para mantener la temperatura corporal central. Durante las grabaciones de imágenes del tumor se humedeció continuamente con solución salina y la temperatura se controló usando recubierto de teflón sondas de fibra óptica y /o una cámara de infrarrojos. Para imágenes con lentes de inmersión en agua, un cubreobjetos se coloca suavemente en la parte superior de la superficie de imágenes humedecido utilizando un micromanipulador manual (Kite, WPI). grabaciones con lapso de tiempo fueron capturadas en campos seleccionados de la vista a velocidades de cuadro de 10-30 fps.
trazadores fluorescentes
Los trazadores fluorescentes utilizados en estos experimentos fueron albúmina-Alexa Fluor 647 (MW ~ 66 kDa) y isotiocianato de fluoresceína dextrano (FITC-dextrano, MW ~ 70 kDa). Ambos se obtuvieron de Life Technologies, Grand Island, Nueva York. Los ratones recibieron 50 inyecciones retro-orbital mu l de cualquiera de Alexa 647 o FITC-dextrano (o ambos) a concentraciones de 10 mg /Kg (en suspensión en solución salina tamponada con fosfato, PBS). Los ratones fueron sometidos a la exposición a RF con o sin formación de imágenes IVM simultánea. los marcadores fluorescentes se usaron en este estudio para contrastar los vasos sanguíneos del tumor y para investigar la extravasación, debido al aumento de la permeabilidad vascular, y la difusión de los marcadores en los tumores. Las células cancerosas se identificaron por su expresión de la proteína tdTomato fluorescente. señales de fluorescencia de FITC-dextrano, Td-Tomate y albúmina-647 se detectaron de forma secuencial utilizando líneas de excitación láser a 488, 561 y 640 nm, mientras que la emisión se registró utilizando filtros de paso de banda estrecha (ancho de banda de 30-50 nm) a 520, 600 y ya de 640 nm, respectivamente. Tres imágenes del canal fueron capturados unos 512x512 tamaños de cuadro con diámetros de agujero de alfiler fijado en 1 unidad de Airy (AU) calculado en 561 nm.
imágenes de inmunofluorescencia
La completa macro-perfusión y captación de los trazadores fluorescentes en toda se analizó el tumor en RF y ratones no tratados RF
ex vivo utilizando imágenes de inmunofluorescencia. los vasos sanguíneos del tumor se visualizaron utilizando anticuerpos para CD31 para evaluar la penetración del tejido por la albúmina extravasado o FITC-dextrano. secciones de tumores congeladas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se bloquearon con 5% de suero de caballo normal y 1% de suero normal de cabra en PBS, y immunofluorescently teñidas utilizando anticuerpos para CD31 (BD Biosciences, San Jose, CA). Las secciones fueron incubadas con anticuerpo de cabra anti-IgG de rata Alexa Fluor 488 de anticuerpos (Jackson ImmunoResearch, West Groove, PA) [30]. Las imágenes fueron capturados utilizando nuestra Nikon A1R
+ microscopio confocal y analizados mediante el software Nikon NIS-Elements AR (v3.2). La relación de píxeles de toda la imagen que tiene la intensidad de fluorescencia mayor que el umbral (de fondo) se muestra como fracción de área positiva [31, 32]. Los datos se muestran como la media ± SD de secciones representativas de más de 5 imágenes de tumores.
Algoritmos para la cuantificación de la perfusión del marcador fluorescente
Para cuantificar la acumulación del marcador fluorescente en el tumor y la extravasación de los vasos sanguíneos, se utilizó un algoritmo simple basado en la segmentación de umbral global y técnicas de enmascaramiento binarios aplicados a las imágenes adquiridas en animales vivos. Por umbralización el componente de fluorescencia Td-tomate, que primero crear una imagen binaria, que se utiliza para generar una máscara para el tumor. Dilatar y erosionar las operaciones se utilizan para eliminar los agujeros y suavizar los bordes de esta máscara. Un método similar se utiliza para crear una máscara vasculatura basado en los valores de intensidad alta de la FITC-dextrano o albúmina-647 señales. Los dos máscaras se combinan entonces para encontrar el componente extravascular de la zona del tumor y esta máscara resultante se utiliza para cuantificar la cantidad de tinte trazador, que ha migrado en el tumor.
Resultados y Discusión
modulación de la temperatura del tumor
las pruebas iniciales del sistema RF-IVM incluye la exposición de un ratón 4T1 portadores de tumores a la energía de RF, sin imágenes, para confirmar la calefacción del tumor. La figura 3A representa la configuración experimental. El ratón se coloca en una etapa de teflón especialmente diseñado cubierto con una película delgada de cinta de cobre para conectar a tierra eléctricamente el animal: la prevención de la superficie de acumulación de carga eléctrica que podrían causar lesión térmica. La etapa cargada animal se colocó entre las cabezas del sistema de p-RF TX y RX. Tres sondas térmicas de fibra óptica se inserta directamente en el ratón en diferentes posiciones que rodean el tumor y a distancias únicas de la cabeza TX. Sonda#1 (la más cercana a la cabeza TX) se inserta bajo la piel pero por encima de la masa tumoral; sonda#2 se inserta bajo la piel entre el área donde el tumor se proyecta desde el cuerpo principal del ratón; y la sonda#3 se inserta por encima de la cavidad intraperitoneal expuesto. Dado que el tejido situado cerca de la sonda#1 probablemente calentar el mayor debido a su proximidad a la cabeza TX, hemos utilizado esto como una referencia en el encendido y apagado del sistema de RF en diferentes puntos de temperatura: 45 ° C, 43 ° C y 41 DO. La temperatura del tejido se enfrió a alrededor de ~ 30 ° C (debido a la sala de operaciones de aire acondicionado) entre cada exposición a la RF. La potencia total necesaria para generar estos perfiles de calentamiento fue de 90 W. Como se ve en la figura 3B, la temperatura tumor aumentado inicialmente a partir de 30 ° C a 45 ° C en ~ 250 s, teniendo ~ 375 s para enfriar de nuevo a 30 ° C. En este punto la RF se vuelve a encender y el tumor se calentó a 43 ° C antes de ser desactivado de nuevo. Esto se repitió a una temperatura final del tumor de 41 ° C. Los datos de temperatura de las sondas#1-#3 demostraron una reducción en el calentamiento del tejido debido a la disminución en la intensidad de campo eléctrico de la cabeza TX. Si el campo eléctrico iban a ser constante a través de las cabezas de transmisión y recepción, como la que se acerca a la condición de un modelo ideal condensador de placas paralelas, a continuación, las fluctuaciones y variaciones en la temperatura lo más probable es ser atribuidas a diferencias en la permitividad y la conductividad entre los tejidos , órganos y tumores del ratón, como se discutirá.
(A) térmica de colocación de la sonda de fibra óptica. Sondas#1-3 están situados (i) debajo de la piel pero por encima del tumor; (Ii) bajo la piel en entre el tumor y el cuerpo principal; y (iii) debajo de la piel junto a la cavidad intraperitoneal. (B) extrajeron los datos de la sonda térmica. La temperatura registrada de las sondas fue modulada por el encendido y apagado del sistema de RF (RF + y-RF). El sistema se apaga una vez que la temperatura del tumor (sonda#1) llegó a 45 ° C, 43 ° C y 41 ° C, respectivamente, y se enciende cuando todas las sondas tenían valores en el rango de ~ 29-31 ° C. (C) La cámara de infrarrojos mide simultáneamente la temperatura superficial de los puntos donde se encontraban las sondas térmicas.
La intensidad del campo eléctrico alrededor del tumor, así como propiedades dieléctricas de los tumores son quizás los dos más importantes parámetros físicos que regulan las velocidades de calentamiento de tumores individuales. Dieléctrico en este caso se refiere a la cantidad de energía eléctrica de un material absorberá y convertir al calor, y es dependiente de la frecuencia. Una publicación reciente ha demostrado efectos antitumorales derivadas de RF no invasivo [1]. En su estudio, Rauf
et al
. ratones sometidos llevan hepatocelular humano ortotópico xenoinjertos implantado y pancreáticas para la exposición a RF semanales. Sus resultados indicaron que RF-solo fue suficiente para causar un efecto anti-tumor en carcinomas hepatocelulares y podría explicarse puramente en el principio de las propiedades dieléctricas de los tumores son más grandes que los tejidos normales y saludables. La capacidad de un material para almacenar y disipar la energía eléctrica en forma de calor puede ser descrita por el real (
ε '
) e imaginario (
ε "
) partes de la función de la permitividad compleja (ε * ). Esta relación viene dada por la ecuación 1: (1) donde
ω
es la frecuencia radial (
2πf
). El término real de la ecuación 1 proporciona información en cuanto a la cantidad de energía eléctrica se pueden almacenar en un material, mientras que el término imaginario indica qué parte de esta energía se convierte en calor.
En una situación clínica puramente ideal, lo imaginario valores para los tejidos tumorales serían significativamente mayor que la de los tejidos normales, sanos, por lo que el tumor se calentaría rápidamente hasta temperaturas que inducen sea a la hipertermia (que conduce a los mecanismos de muerte celular programada naturales) o la ablación completa y necrosis. Las propiedades dieléctricas de los tejidos cancerosos y normales se midieron por Raoof
et al
. (Usando un analizador de permitividad), y se muestra a ser más grandes para los tumores que las células normales. La relación entre la constante dieléctrica de un material y su efecto sobre la producción de calor cuando se expone a un tiempo que varía de campo eléctrico viene dado por la siguiente ecuación: (2) donde
ε
0 es
la permitividad del vacío,
ε "
es la parte imaginaria de la permitividad compleja,
e
es la intensidad del campo eléctrico en la muestra,
ρ es la densidad
, y
c
p
la capacidad de calor específico. En esta ecuación de gobierno fundamental, todas las variables físicas relevantes están contenidos que describen cómo una muestra responderá a la exposición a un campo eléctrico. Esta ecuación, especialmente la fuerte dependencia de la intensidad del campo eléctrico, puede ayudar aún más a explicar la disminución en la producción de calor:. Las sondas de temperatura se encuentran más lejos de la cabeza TX con la fuerza del campo eléctrico disminuye gradualmente
En este estudiar, la temperatura superficial de los lugares en que se encuentran las sondas térmicas también se capturaron utilizando una cámara de infrarrojos, como se muestra en la figura 3C. Como puede verse, hay similitudes y diferencias significativas cuando se comparan con los datos de la sonda térmica. Los datos de IR indica una disminución de la temperatura final de tejido en comparación con la medición de la sonda#1 de ~ 5 ° C, y una disminución en la temperatura de ~ 3 ° C para la sonda#2. Las temperaturas son similares para la sonda#3. A fin de probar las diferencias y el margen de error entre la cámara IR y datos de la sonda térmica, las tres sondas se sumergieron en 1,3 ml de PBS contenidos en una cubeta de cuarzo y expuestos al campo de RF. Los datos de temperatura se muestra en la figura 4. Hay una estrecha relación entre la cámara IR grabado y datos de la sonda térmica con un margen de error entre 0,2-0,5 ° C. Se esperaba que esta similitud como la cubeta de cuarzo es casi ópticamente transparente en toda la gama de longitudes de onda IR 3,0-5,0 micras. Dadas las similitudes entre la cámara IR y datos de la sonda térmica, las diferencias en los ratones de calentamiento mostrado en la figura 3 es más probable debido al desajuste entre la colocación de la sonda y la ubicación cursor IR. Por ejemplo, la posición de la sonda#1 es en realidad más profunda bajo la piel del ratón de la sonda#3 (así como estar más cerca del tumor) de manera probable mostrará la producción de calor más grande debido al calentamiento del tumor en comparación con el mediciones de la cámara de infrarrojos de la superficie. Además, las mediciones de superficie son generalmente probable que sea menor que las temperaturas inter-tejido debido al efecto de enfriamiento del medio ambiente la temperatura ambiente. Finalmente, las pérdidas ópticas y la absorción de la propagación de la energía IR a través de la piel lo más probable es reducir la intensidad de los fotones IR en la superficie del ratón, que están siendo detectada usando la cámara IR.
(A) de tres térmica sondas fueron lugares en una cubeta de cuarzo llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a 200 W de RF. La cámara de infrarrojos capturado la temperatura superficial de los puntos de cursor situadas junto a las sondas térmicas para el tiempo de exposición de RF 0 s-380 s (B y C, respectivamente). (D) Comparación de la sonda térmica y los datos de calefacción de la cámara de infrarrojos.
Multi-canal de imágenes GIV-RF y la degradación del buque de alta temperatura
La figura 5 representa en tiempo real de varios canales formación de imágenes IVM-RF en un tumor 4T1 expuesta. Tres canales separados se obtuvieron imágenes: FITC (vasos con dextrano), Texas Red (4T1 transfectadas tumor), y Cy5 (células rojas de la sangre, los glóbulos rojos). La figura 5A muestra los canales combinados, mientras que los canales individuales se muestran en la Fig 5B-5D. Figura 5E-5H muestra los cambios en la arquitectura del buque para los cuatro puntos de tiempo diferentes, ilustrados como el punto 1 hora a 5 en la figura 5I (NB: el punto número 1 corresponde al tiempo de la formación de imágenes antes de la adición de la exposición a RF). También se muestra en la figura 5I es el gráfico de la temperatura del tumor y la potencia de RF en función del tiempo. temperatura del tumor en este caso se controló utilizando una sonda de temperatura colocada en el tumor. Una película de tiempo comprimido de estos canales individuales fusionadas y se puede encontrar en la película S1.
(A) Superposición de los canales independientes (IVM FITC, Texas Red, y Cy5). vasos (B) de los tumores se destacan el uso de trazadores fluorescentes FITC-dextrano, (C) de emisión fluorescente de la línea celular tumoral 4T1 transfectadas, (D) Cy5 emisiones de los Glóbulos Rojos hizo manchados. La figura (A) - (D) se tomaron a tiempo = 78 s. Figura (E) - (H) representan el canal FITC (vasos) a diferentes puntos de tiempo: 762, 1650, 2382, y 2742 s, respectivamente. Figura I ilustra la temperatura de tumor con respecto al tiempo y se aplica potencia de RF. Los números 1-5 Se muestra en la parte inferior izquierda de cada figura corresponden a los 5 diferentes puntos de tiempo resaltados en la figura I.
Como se puede observar a partir de estos resultados, los vasos del tumor comienza a estrecho y constreñir una vez que la temperatura del tumor se eleva por encima de 41 ° C. A una temperatura final del tumor de 44 ° C, las células intravasculares son completamente estancada y los vasos han dejado de funcionar. Esto también se puede ver en la S1 de la película con respecto a la circulación de los glóbulos rojos. Una vez que la temperatura se eleva por encima de 41 ° C, el flujo de los glóbulos rojos se vuelve irregular y hay algunas secciones del buque, donde el flujo de sangre ha cesado por completo. Tenga en cuenta, con respecto a los puntos de tiempo en que la potencia de RF se terminó de manera intermitente con el fin de evitar el sobrecalentamiento del tumor. El uso de un perfil de calentamiento en rampa nos permite adaptar la alimentación una vez que se alcanza la temperatura designada de modo que una temperatura de ajuste preciso puede ser mantenido. Esto se puede ver a partir de los puntos de tiempo 2 y 3, donde la potencia se redujo rápidamente a continuación, se incrementó gradualmente para permitir un perfil de calentamiento más suave.
Una repetición de este experimento (pero sin la tinción RBC) se muestra en la Fig 6. El efecto de la degradación de recipiente es más pronunciado en estas imágenes. Al mirar a los cuatro puntos diferentes de tiempo se puede observar que algunos bajo nivel de degradación del buque es evidente para temperaturas de entre 41,5 a 41,8 ° C (llevamos a cabo este intervalo de temperaturas durante ~ 10 minutos). Después de esto, tras la aplicación de más potencia de RF, el aumento de la producción de calor tumor (hasta ~ 49 ° C) dio como resultado una grave degradación y el cierre completo de los vasos del tumor. Una película llena de estos efectos se puede ver en la película S2. Los resultados mostrados en las figuras 5 y 6 ilustran el efecto de las altas temperaturas en la arquitectura del vaso y la dinámica de flujo de RBC. Aunque es bien sabido que la lesión de los vasos puede ocurrir por temperaturas mayores de 41 ° C, se ha demostrado que el aumento de permeabilidad de los vasos y la perfusión circulantes de macromoléculas, agentes quimioterapéuticos, y las drogas se pueden esperar para temperaturas en el rango de 39 ° C-41 ° C (el artículo de revisión referenciada por Roussakow ofrece una visión completa y concisa del campo [33])
(a) - (D) Efecto de la exposición a la RF en la arquitectura del vaso en cuatro diferentes puntos de tiempo:. 0 : 22, 6:53, 16:18, y 20:31 minutos, respectivamente. Las temperaturas tumorales y potencia de RF en esos tiempos se muestran en las secciones laterales parte media alta y superior derecha, respectivamente. Figura (E) ilustra el cambio en la temperatura y la potencia con respecto al tiempo. la degradación del buque se puede ver por las temperaturas & gt; 41 ° C. Una ruptura completa de la arquitectura buque pueda ser visto por las temperaturas & gt; 47 ° C.
transporte del marcador fluorescente inducida por RF y la perfusión en tumores 4T1
Los ratones con tumores 4T1 se prepararon quirúrgicamente por RF-IVM como se describe en la sección de métodos. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas de 50 l de albúmina-Alexa-Fluor 647 de colorante (10 mg /Kg) a través de la inyección de retro-orbital y la imagen con y sin RF (como control). Para todos los experimentos la RF se apaga una vez que la temperatura del tumor alcanzó 41 ° C (a menos que se indique lo contrario) tal como se indica por la cámara IR. Fig 7A-7D representan la perfusión del trazador de albúmina de los vasos sanguíneos y en el tumor durante una duración del tratamiento de RF de 4,5 minutos. perfusión tumor mejorada es particularmente evidente al comparar la figura 7A y 7B para el inicio y los puntos finales (0 y 4,5 minutos, respectivamente) para la única (azul) canal de albúmina. Los archivos de vídeo completos (editado para eliminar la fluctuación de la imagen debido a la respiración del ratón) están en S3 y S4 Películas. Para un control, el mismo experimento fue fotografiada sin la exposición a RF (Fig 7E) durante 30 minutos. Una alteración de la barrera de perfusión es evidente como no albúmina de penetración en el tumor durante la sesión de formación de imágenes (30 min, la figura 7E). Esta alteración de la perfusión es característico de tumores debido a la alta presión, vasculatura caótico, y la compresión resultante recipiente de tumor [34, 35]. Se observó perfusión vascular limitada en varios ratones durante la exploración sesiones que duran hasta una hora.
exposición a RF muestra transporte de albúmina unida con fluorescencia través de la barrera de perfusión en la región del tumor. La figura (A) y (B) representan el canal de imagen azul (albúmina) antes y después (4,5 min) la exposición a RF. Estos datos se muestran superpuesta con el canal de tumor (rojo) en la figura (C) y (D). Figura ratón (E) Control (sin RF) fue fotografiada durante 30 minutos en ambos canales. No hay transporte de la albúmina en el tumor a través de la barrera de perfusión. (F) el tiempo transcurrido imágenes de los datos mostrados en la figura (A) y (B).