Extracto
La activación de la vía de señalización PI3K /AKT es una fuerza impulsora conocida por la progresión a la castración cáncer de próstata recurrente (CR-PAC), que constituye el principal fenotipo letal de la tapa. A continuación, se identifican mediante una pantalla shRNA genómico del /blanco de abajo AKT-inactivación de PI3K, foxo4, como un potencial supresor de la metástasis de CaP. los niveles de proteína foxo4 se correlacionan inversamente con el potencial invasivo de un panel de líneas celulares de CaP humanos, con la disminución de los niveles de ARNm se correlaciona con aumento de la incidencia de metástasis clínica. Knockdown (KD) de foxo4 en LNCaP células causas humanas aumento de la invasión
in vitro
y de los ganglios linfáticos (LN) metástasis
in vivo
sin afectar los índices de proliferación o la apoptosis. Aumento de la capacidad de invasión de Matrigel fue encontrado por KD de FoxO1 pero no FOXO3. La comparación de los genes expresados diferencialmente afectados por foxo4-KD en las células LNCaP en la cultura, en los tumores primarios y en metástasis LN identificado un grupo de genes upregulated, incluyendo PIP, CAMK2N1, PLA2G16 y PGC, que, de ser derribado por siRNA, podría disminuir la aumento de la capacidad invasora asociada con la deficiencia foxo4. Aunque sólo algunos de estos genes codifican sitios de unión a promotor FOXO, todos ellos son RUNX2-inducible, y la unión al promotor PIP RUNX2 se incrementa en las células foxo4-KD. De hecho, la expresión forzada de foxo4 invierte el aumento de la invasividad de las células LNCaP /shFOXO4; la expresión forzada de foxo4 no alteró los niveles de proteína RUNX2, sin embargo, disminución de la unión al promotor RUNX2 PIP, resultando en PIP regulación a la baja. Por último, hubo una correlación entre foxo4, pero no FoxO1 o FOXO3, regulación a la baja y la disminución de la supervivencia libre de metástasis en pacientes con NAC humanos. Nuestros datos sugieren fuertemente que el aumento de PI3K /AKT invasión metastásica mediada en CaP se asocia con la pérdida de foxo4, y que los mecanismos para inducir foxo4 re-expresión podría suprimir CaP agresividad metastásica
Visto:. Su B, Gao L, Baranowski C, Gillard B, Wang J, Ransom R, et al. (2014) Una pantalla de RNAi de genoma completo identifica foxo4 como un supresor de la metástasis a través Contrarrestar PI3K /AKT Señal Camino en el cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10.1371 /journal.pone.0101411
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de abril de 2014; Aceptado: 5 Junio 2014; Publicado: 1 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. los datos de microarrays se ha depositado en la Expresión Génica Omnibus con el número de GSE58403
Financiación:. IHG fue apoyado por el Departamento de Defensa, (www.army.mil) otorga PC040256 PC061246 y, Instituto Nacional del Cáncer (www.cancer .gov) conceder CA94108 (IHG), y el Centro Nacional del cáncer programa de subsidios para 2P30 CA016056. BS fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China Nº 81272380. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) sigue siendo el cáncer no cutáneo más diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer en hombres estadounidenses [1]. Las etapas iniciales de la tapa están reguladas por andrógenos, por lo tanto, terapia de deprivación androgénica ha sido el pilar de la terapia para el cáncer de próstata progresivo. La mayoría de los pacientes no inevitablemente esta terapia, progresando a castración cáncer de próstata recurrente (CR-CaP) típicamente se presenta como metástasis ósea o ganglios linfáticos cuyo crecimiento depende de sostenido del receptor de andrógenos (AR) de señalización [2]. De hecho, la focalización de CR-gorra con antiandrógenos más específicas o antagonistas de AR ha ofrecido significativo, pero transitoria, eficacia clínica, y la resistencia todavía implica una gran dependencia de AR, aunque la participación de los mutantes AR o sobreexpresión [3] - [5].
la activación de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /Akt es un importante contribuyente a la PAC progresión [6], [7] en el que el 42% de las lesiones de CaP primarias y 100% de los tumores metastásicos alteraciones de exhibición (mutaciones /deleciones, las variaciones del número de copias, la expresión génica diferencial) en uno o más componentes [8]. Esto ha llevado a varios ensayos clínicos dirigidos PI3K, AKT o TORC1 en combinación con quimioterapias estándar (taxanos, Platins) o antagonistas del eje de andrógenos o AR [6]. De hecho, la pérdida prostático específico del antagonista PI3K /AKT, PTEN, en modelos de ratones transgénicos es suficiente para inducir la neoplasia intraepitelial [9], [10].
Los miembros de la familia FOXO, FoxO1, FOXO3a y foxo4 , son factores de transcripción que funcionan como proteínas supresoras de tumores de forma ubicua-expresada a través de su capacidad para reprimir la expresión de genes que codifican proliferativa, de supervivencia o anti-diferenciación funciones [11], [12]. Los roles de los miembros FOXO en la supresión de la progresión del cáncer de próstata se han descrito. Por ejemplo, FoxO1 supresión en 13q14 se asocia con la proliferación andrógeno y AR-independiente [13]. AKT, cuya actividad aumenta en progresión CaP [7], fosforila directamente miembros de la familia FOXO, antagonizando de este modo su función mediante la promoción de la asociación con las proteínas 14-3-3 y la prevención de su translocación nuclear [14], lo que lleva a su ubiquitylation mediada por la degradación del proteasoma [ ,,,0],15]. La pérdida de FOXO3a promueve la formación de cáncer en el modelo de ratón de cáncer de próstata TRAMP [16], mientras que la regulación por incremento o activación de las proteínas FOXO conduce a la detención del crecimiento y la apoptosis [17] - [19]. Un estudio realizado por Zhang et al. [20] demuestra que FoxO1 inhibe la motilidad celular y la invasión de CaP mediante la prevención de RUNX2 de la unión y la activación de genes transcripcionalmente progresión como
OP, IL8, VEGF
y
MMP13
. Aunque algunas funciones redundantes para las proteínas FOXO están implícitos en el hallazgo de que los linfomas tímicos espontáneas y hemangiomas sistémicos son inducidos únicamente a la eliminación combinada de FoxO1, FOXO3 y foxo4 [21], no hay evidencia de estudios inmunoprecipitación de la cromatina-secuenciación (chip-ss) en FoxO1 y FOXO3a de ambos genes objetivos comunes y que no se superponen [22], [23]. Para la progresión del cáncer de próstata, las funciones comunes o distintos para proteínas FOXO siguen sin estar claros.
Con el fin de identificar los genes que antagonizan CaP metástasis, las células LNCaP humanos, que exhiben invasividad débil, fueron infectadas con un lentivirus genómico shRNA codificados biblioteca y luego seleccionado por células altamente invasivas en una cámara de Boyden ensayo Matrigel-revestido. Nuestros datos sugieren fuertemente que foxo4 suprime la invasión metastásica mediante la prevención de RUNX2 de la activación de un grupo de genes pro-metastásicos incluyendo
PIP, PGC, CAMK2N1
y
PLA2G16
. El hallazgo de que foxo4 regulación a la baja se correlaciona con la enfermedad metastásica inicio más temprano en pacientes con NAC sugiere fuertemente que tapa la metástasis podría ser antagonizado por la reactivación de la expresión foxo4 o mediante la inhibición de la función RUNX2.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos se utilizaron
Los siguientes anticuerpos primarios (Ab): policlonales de conejo específico para FoxO1, FOXO3, foxo4, escindidos de la caspasa-3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); ratón anticuerpos monoclonales (mAb) incluyen HA, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Applied Materiales Biológicos, Richmond, BC, Canadá), y Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).
p> (2505 ATCC CRL) células de cultivo de la célula
2. células DU145 (ATCC HTB-81) y HEK293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% FBS. LNCaP fueron infectadas con alícuotas de la descodificación (OpenBiosystems) agrupados biblioteca lentivirus pGIPZ que codifica la shRNAs genómico (13.650 genes diana en 7 piscinas de 9.750 clones ARNhc /piscina) a una infección multiplicidad de de 1 (RPCI shRNA Core, Irwin Gelman, director), y luego seleccionados para la puromicina (2: g /ml de resistencia). Las células resistentes a la puromicina infectadas con pGIPZ vacío solo sirvieron como control negativo.
siRNA transfección
Sintético EN-TARGETplus SmartPool siRNA específico para foxo4, FoxO1 y FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), y DHarmaFECT-1 reactivo de transfección fueron adquiridos de Dharmacon (Lafayette, CO). células LNCaP se sembraron a densidades iguales en placas de 6 pocillos (5 x 10
4 por pocillo) durante la noche. Las células fueron transfectadas con 50 nM de NS-siRNA o siRNA-FOXO específica durante 24 h utilizando DharmaFECT1 siguiendo el protocolo del fabricante.
MTS crecimiento de las células de ensayo
La proliferación de células LNCaP establemente infectadas con pGIPZ -FOXO4 shRNA o pGIPZ-NS-shRNA o transfectadas transitoriamente con FOXO4- o NS-siRNA se evaluó usando el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI) siguiendo el protocolo del fabricante. ensayo de MTS mide la restauración de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS) a formazán por las células metabólicamente activas.
inmunotransferencia (IB) análisis
Las células se lisaron en tampón RIPA (10 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 8% de glicerol, 1% Triton X-100, 0,1 % de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, mM Na 10
3VO4, NaF 1 mM, cóctel completo de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania)). 40 g de proteína /muestra total se separó mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno que se bloquearon durante 30 min con 5% de albúmina de suero bovino (Sigma) en 1 x TBS /T (0,1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris ) y luego probaron como se indica. formación de imágenes y la cuantificación de la señal digital se llevaron a cabo en un Chemi-Genius
2 Bio-Imager (Syngene, Frederick, MD) utilizando el software GeneTools.
transitoria transfección
pFOXO4-GFP o pFOXO4- TM-GFP, con las sustituciones de Ala en los tres sitios de fosforilación de AKT (amablemente proporcionados por Stefanie Dimmeler, Universidad de Frankfurt, Alemania) se transfectaron transitoriamente en CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 plásmido (amablemente proporcionado por Zhiping Liu, UT Southwestern Medical Center) fue co-transfectadas transitoriamente con ADN pEGFP (Clontech /Takara, Mountainview, CA) en células CWR22Rv1 utilizando Lipofectamine reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el fabricante de recomendaciones, y después se incubaron durante 40 h. células GFP positivas se anotó para la invasión y
In situ
zimografía. Para el análisis de CHIP-qPCR, las células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente con HA-RUNX2 (amablemente proporcionado por Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), HA-Myc-RUNX2 más foxo4, o vector vacío.
ensayo de invasión y selección de clones invasores
modificados ensayos de cámara de Boyden se realizaron como se describe anteriormente [24] a partir de 5 × 10
formato de 4 células /5 pocillos. Los valores para la migración se obtuvieron mediante el recuento de al menos 10 células en 6 campos por membrana (objetivo x20) y se promediaron para tres experimentos independientes. Las células con una mayor capacidad de invasión de Matrigel se aislaron después de cuatro rondas de ensayos de invasión sucesivas. Específicamente, las células invasoras (adheridas a la parte inferior de transwell membranas) se separaron por tripsinización, se agruparon sobre la base de módulos de shRNA, en placas de 6 pocillos, y después de la expansión, re-sometidas a ensayos de invasión. Después de tres rondas, las células se colocaron en placas con baja densidad en placas de 10 cm, y después de la proliferación y el aislamiento de colonias, los códigos de barras eran Sanger secuenciado (RPCI Genómica de Recursos Compartidos Core, Irwin Gelman-director) a partir de ADN aislado mediante flanquean pares de cebadores de PCR, F: 5 ' - ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 'y R: 5'-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3' o utilizando el cebador de secuenciación directa, 5'-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 '. células LNCaP [Vector] o LNCaP [shFOXO4] transfectadas transitoriamente con 1: g cada uno de los clones pGIPZ lentivirus shRNA (que expresan GFP) específicos para la adhesión PIP (# NM_002652.2; clones V2LHS170040 y V2LHS170041), CAMK2N1 (# de acceso NM_018584.5 , clones V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (# de acceso NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), PGC (# de acceso NM_002630.3, clon V2LHS169912) o RUNX2 (# de acceso NM_004348, los clones V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224 628), o pGIPZ vacío de control de vectores (OpenBiosystems) para evaluar su potencial invasor.
In situ
zimografía
cubreobjetos de vidrio se recubrieron con 0,2 mg /ml de Oregon verde de gelatina 488-conjugado, reticulado en 0,5% de glutaraldehído durante 15 min a 4 ° C, y se incubaron con 5 mg /ml NaBH
4 de 3 min. Los cubreobjetos fueron entonces desinfectados con 70% de EtOH durante 15 minutos y se lavaron en medio libre de suero durante 1 h a 37 ° C. Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos, y se incubaron a 37 ° C durante 24 h, se fijaron durante 10 min con helado de 60% de acetona /3,7% de paraformaldehído en PBS, se bloquearon con leche en polvo 3% no grasa en PBS durante 30 min a TA. Myc-foxo4 se tiñó con el ratón anti-myc (1:500), y los núcleos se tiñeron con DAPI (Invitrogen; 1:500), seguido de cabra conjugado con FITC anti-IgG de ratón (1:500; Chemicon, Temecula, CA ). Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio invertido Nikon TE2000-E equipado con cámara CCD Roper CoolSnap HQ. Invasividad se cuantificó midiendo la pérdida media del área de FITC-gelatina en diapositivas triplicado
metástasis modelo ortotópico
Las inyecciones de próstata ortotópico en lóbulos dorsales de 10
6 celdas de 50:. L de PBS en ratones desnudos masculinos incluidos en sus flancos con pastillas de testosterona se llevó a cabo como se describe anteriormente [25]. Después de 10 semanas, los ratones fueron sacrificados y se comprueban para GFP fluorescencia (Lightools Research, Encinitas, CA) en tumores primarios y en los órganos periféricos. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo la supervisión del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Roswell Park Cancer Institute bajo protocolo aprobado 1177M. La anestesia se inhala Halotano al efecto. La eutanasia fue realizada por asfixia con CO2, seguido por dislocación cervical.
La inmunohistoquímica (IHC)
Los tejidos se fijaron en 10% de formalina tamponada durante 24 h antes de la elaboración. tejidos fijados se embebieron en parafina y se seccionaron a 5: m. Las láminas fueron des-parafinized en xilenos y después se rehidratan en alcoholes graduados seguido de ddH
2O. Los portaobjetos se incubaron en 1x pH 6 tampón de citrato (Invitrogen Cat#00-5000) durante 20 min y luego en 3% H
2O
2 para 15 min. Los portaobjetos se bloquearon con suero de cabra normal al 10% durante 30 min, seguido de avidina /biotina bloque (Vector Labs Cat#SP-2001). Abs primarios a Ki67 (1:500), GFP (01:50) o caspasa 3 (1:200) se diluyeron en solución de BSA al 1% y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (RT), seguido de incubación con anti cabra biotinilado -rabbit secundaria Ab (señalización celular Cat#9661) durante 15 min. Para mejora de la señal, el reactivo ABC (Vector Labs Cat #PK 6100) se aplicó durante 30 min, seguido de incubación con el sustrato DAB (Dako Cat#K3467) durante 5 min y la contratinción con hematoxilina Harris modificado (Richard-Allan Cat Scientific#72704) durante 20 s. Los portaobjetos se lavaron en PBS, se selló con cubreobjetos y escaneado en un Aperio ScanScope CS, el uso de software ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).
array de expresión génica
El ARN total se preparó utilizando Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante a partir de seis muestras: LNCaP [shFOXO4] línea celular, LNCaP [Control pGIPZ] línea celular, LNCaP [shFOXO4] tumor primario, LNCaP [Control pGIPZ] tumor primario, LNCaP [shFOXO4] ganglio linfático metástasis y LNCaP [pGIPZ de control] metástasis en los ganglios linfáticos. Las muestras de ARN se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (Thermo Scientific /NanoDrop) y se evaluó la degradación usando un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Las muestras con ARN Valor de Integridad (RIN) & gt; 7 se procesaron para el análisis conjunto de la expresión génica utilizando la matriz de todo el genoma humano HT-12 la expresión génica BeadChip (v4) (Illumina, San Diego, CA). 500 ng de RNA total se convirtió en cDNA, seguido por
in vitro
transcripción para generar marcado con biotina cRNA usando el kit Ambion Illumina TotalPrep de amplificación del ARN (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) según las instrucciones del fabricante. 750 ng de las sondas marcadas se mezclaron a continuación con reactivos de hibridación y se hibridó durante la noche a 58 ° C para los BeadChips HT-12V4. Tras el lavado y la tinción con conjugado de estreptavidina-Cy3, los BeadChips fueron imágenes utilizando un lector de iScan Illumina para medir la intensidad de la fluorescencia en cada sonda. La intensidad de la señal corresponde a la cantidad de los respectivos ARNm en la muestra original. archivos de datos fueron analizados con BeadChip GenomeStudio (v2011.1; Illumina) Módulo de la expresión génica (v1.9.0) para informar tanto, los niveles de señal de expresión génica antecedentes corregido un-normalizados y normalizados por cuantiles. Los niveles de señal de expresión génica se analizaron a continuación mediante el Bioconductor paquetes de programas y Lumi LIMMA (http://www.bioconductor.org). Los genes con & gt;. Se identificaron 2 veces los cambios de expresión
PCR transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total (1 mg /reacción) aislado utilizando el reactivo Trizol fue sometido a transcripción inversa reacciones con cebadores hexámeros aleatorios usando el cDNA transcripción reversa kit (Life Technologies /Applied Biosystems) de alta capacidad. QRT-PCR se realizó en un sistema de detección de secuencias 7900HT (Life Technologies /Applied Biosystems) utilizando el kit FastStart universal SYBR Green Master (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores (Tabla S2) fueron diseñados utilizando Primer -blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH se utilizó como gen de mantenimiento para las reacciones de QRT-PCR. Cada ensayo se realiza en el triple replicación y la 2
-ΔΔCt método [26] se utilizó para calcular la expresión de genes.
Co-inmunoprecipitación (Co-IP) de foxo4 y RUNX2
células HEK293T fueron co-transfectadas con Myc-foxo4 plus HA-RUNX2, HA-RUNX2 solo o vector vacío solo. Después de 48 h, las células se lisaron en tampón RIPA y IP se realizó usando HA Ab, seguido de IB con el Ab se indica, o se realizó IP usando Myc Ab, seguido de IB
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). - se llevaron a cabo qPCR
ensayos de chip como se ha descrito previamente (9) con modificaciones menores. Brevemente, las células LNCaP y HEK93T cultivaron en placas de 10 cm (80 a 90% de confluencia) se reticularon mediante la adición de 10% de formaldehído a medios de cultivo para 6-7 min a TA, seguido de la adición de glicina a 125 mM. La cromatina se sometió a ultrasonidos para producir 100-300 bp fragmentos en SDS tampón de lisis (0,1% de SDS, EDTA 5 mM, 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 2% de NP-40, 0,5% desoxicolato, pH 8,1) que contiene 1 mM de fenilmetanosulfonilo fluoruro y mezcla de inhibidor de proteasa. (Roche Applied Science) Después de pre-compensación con perlas magnéticas de proteína A /G (Millipore), la cromatina se incubó durante la noche a 4 ° C con 5 g de la siguiente Ab como se indica: HA, RUNX2, o IgG de ratón normal. Inmunocomplejos fueron derribadas con perlas magnéticas proteína A /G. Crosslinks tanto para chip y de entrada de ADN se invirtieron a 65 ° C durante 5 h y las proteínas se digirieron con proteinasa K, y el ADN se recuperó mediante extracción con fenol /cloroformo y precipitación con etanol con 20 g de glucógeno como vehículo como se describe [27]. fragmentos precipitados fueron cuantificados por qPCR, y el porcentaje de valores de entrada se corrigieron para las regiones de control negativo donde se indica. Los cebadores para la amplificación por PCR de PIP como se describe anterior [28].
Los análisis estadísticos
significaciones estadísticas entre los grupos se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas, con barras de error que significa S.E.M. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Una pantalla shRNA de todo el genoma para identificar los genes supresores de metástasis candidato
Con el fin de entender los componentes genéticos. necesaria para la metástasis, se utilizó un enfoque de detección shRNA de alto rendimiento para identificar genes capaces de suprimir Matrigel invasividad, un parámetro de la cascada metastásica [29]. células LNCaP, que exhiben baja invasivo potencial [30], fueron infectadas con módulos de pGIPZ (que expresan GFP) lentivirus módulos de codificación de shRNAs genómicas humanas en una MOI = 0,7 (para minimizar las células transducidas con múltiples shRNAs), y después de la selección de puromicina resistencia, las células se sometieron a triplicados Matrigel Boyden ensayos de cámara de invasión. células invasoras (que se adhieren a la parte inferior de las membranas transwells) se eliminaron por tratamiento con tripsina, se reunieron entre triplicados, expandidas en cultivo y después se sometió a dos rondas más de los ensayos de invasión similares. LNCaP infectado con (células LNCaP [Vector]) pGIPZ vacío se ejecuta en paralelo para evaluar cualquier selección de aumento espontáneo en la invasividad (fig. 1A). Asumimos que las células con el aumento de la invasividad resultante de la pérdida de una función de supresor se enriquecen con rondas de ensayo sucesivas. Después de tres ciclos de selección, las colonias se aislaron de los módulos 2, 3, 6, y 7, que mostraron el aumento de la invasividad relación al nivel de la ronda 3 de controles LNCaP [Vector] (Fig. 1B). El análisis de secuencia (código de barras y la secuencia shRNA) y la búsqueda BLAST banco de datos (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) identificaron varios clones de caja forkhead O4 (
foxo4
), quinesina miembro de la familia 3B (
KIF3B
), la señal de transducción molécula adaptadora (dominio SH3 y motivo ITAM) 1 (
STAM
), y el portador de soluto Homo sapiens familia 17 (
SLC17A4
) (Tabla S1), que acumulaban & gt; 94% de todos los clones secuenciados. Dada la creciente entender para los papeles de las proteínas FOXO como reguladores negativos de la progresión del cáncer [31], [32], y un estudio reciente que muestra que la sobre regulación de ANXA8 por foxo4 inhibe las características de la célula migratorias y metastásicos de células colangiocarcinoma [33], nos hemos centrado en el posible papel de foxo4 como un potencial supresor de la metástasis.
a. Resumen esquemático de la pantalla. Se utilizó un enfoque de detección shRNA de alto rendimiento para identificar los genes cuya caída inducida por invasión tumoral, un proceso esencial para la metástasis. Altamente se seleccionaron variantes invasivos de LNCaP usando ensayos de cámara de Boyden invasión recubiertos con Matrigel. B. Incremento de la capacidad de invasión inducida por grupos de clones shRNA más de 3 rondas de selección.
Panel superior
: imágenes representativas de las células que expresan GFP-invasivos de control (pGIPZ vector) o shRNA (alícuota#2) después de tres rondas de selección.
Panel inferior
:. Potencial invasivo de células agrupadas en cada uno de los 7 módulos de infección durante tres rondas de selección, en comparación con las células LNCaP [Vector]
El descenso de regulación de foxo4 en metastásico humana líneas de células y tejidos de CaP metastásico
Para probar si la expresión génica foxo4 se correlaciona con la invasión de células de CaP, lo primero que comparó la expresión de proteínas foxo4 en un panel de líneas celulares de CaP con diferentes potenciales invasivos y metastásicos. Hubo una correlación inversa entre Matrigel invasión y los niveles de proteína foxo4 (Fig. 2A), especialmente cuando se comparan LNCaP a dos variantes metastásicos, LN3 y C4-2. Una búsqueda en la base de datos Oncomine (http://www.oncomine.org) reveló que foxo4 fue significativamente las reguladas en cáncer de próstata metastásico en comparación con cáncer primario in situ y /o muestras normales de dos estudios individuales (Figura 2B). Además, el análisis de los casos de CaP metastásico del estudio de Taylor et al. [8] en el
CBIO
sitio web (http://www.cbioportal.org/public-portal/) mostró que aquellos con regulación a la baja foxo4 correlacionado con una más rápida aparición de metástasis en comparación con aquellos que no tienen alterada foxo4 expresión (Fig. 2C). No hubo evidencia de la correlación de foxo4 regulación a la baja en la metástasis del cáncer de mama, aunque había una pequeña regulación a la baja en la metástasis del cáncer de colon (Fig. S1), lo que sugiere que cualquier función metástasis supresor putativo por foxo4 sería del tipo de tejido específico. FoxO1 niveles también fueron regulados a la baja en cáncer de próstata metástasis (Fig. S2A), sin embargo, no pudimos determinar si la pérdida FoxO1 correlacionado con el aumento de metástasis en pacientes con NAC (Fig. S2B) debido a underpowering debido al bajo número de pacientes. Por el contrario, los niveles de expresión FOXO3 no mostraron correlación con CaP metástasis (figuras S2C & amp;. D).
A. El análisis de la expresión del IB foxo4 en líneas celulares de CaP humanos (
panel superior
), cuantificado y comparado con relativa capacidad de invasión de Matrigel en el
panel inferior
. Las barras de error, SE de tres análisis independientes IB cuantificaron por densitometría (para los niveles foxo4) o ensayos de invasión de Matrigel. El nivel foxo4 relativa en DU145 se fijó en un valor = 1 (línea de puntos). B. Oncomine estudia foxo4 niveles de expresión de ARN en la HPB, primaria in situ (1 °) gorra o metástasis (MET) de LaTulippe et al. [45] y Yu et al. [46]. C. Análisis del gráfico de Kaplan-Meier (http://www.cbioportal.org/public-portal/) de aparición de metástasis en función del tiempo a la aparición de 37 casos de metástasis tapa de Taylor et al. [8] en el que 12 casos (32%) muestran foxo4 regulación a la baja y se correlacionó con una más rápida aparición de metástasis en comparación con los 25 casos que mostraron ningún cambio en los niveles de expresión foxo4.
pérdida foxo4 en LNCaP células de CaP contribuye a altamente potencial metastásico
para determinar si la regulación por disminución de foxo4 contribuyó al aumento de la capacidad invasiva de las células LNCaP, las células LNCaP se transdujeron de forma estable con lentivirus clones foxo4 shRNA, diferente de la identificada en el original pantalla, o transfectadas con siFOXO4, y estas células, frente a vector o revueltos siRNA (SCR) controles, se ensayaron para determinar la invasividad. La caída de foxo4 por SH- o siFOXO4 dio lugar a de 2,5 a 4 veces los aumentos de invasividad LNCaP (Fig. 3A). Por el contrario, las células CWR22Rv1 transitoriamente cotransfectadas con pEGFP más ya sea en peso-foxo4 o un mutante constitutivamente activo foxo4 (TM, por "triple mutante", pérdida i.e.- de los tres sitios de fosforilación de AKT) produjo una reducción de la invasividad (Fig. 3B). La pérdida de foxo4 de shRNA o siRNA no tuvo ningún efecto sobre las tasas de LNCaP proliferación en cultivos 2D (Fig. S3a), sugiriendo que el aumento de los niveles de invasión después foxo4 no se debían a cambios en las tasas de proliferación. Además, se analizaron cómo foxo4 controla la invasividad de las células de CaP sembradas sobre cubreobjetos recubiertos con gelatina marcados con Oregon Green 488. knockdown foxo4 en LNCaP dio como resultado en un aumento de la digestión localizada de gelatina marcada con 488 Oregon Green matriz extracelular en comparación con las células que expresan no específica shRNA (Fig. 3C) mientras que la sobreexpresión de Myc-foxo4 en células CWR22Rv1 disminuyó la digestión localizada (Fig. 3D).
A. células LNCaP establemente transducidas con shRNA o transfectadas con siRNA contra foxo4 transitoriamente (frente al control revueltos) se ensayaron para determinar la invasividad. foxo4 caída se evaluó mediante IB (
panel superior
) y su efecto sobre la capacidad de invasión de Matrigel se cuantificó (
panel inferior
). Las barras de error, S. E. de triplicados experimentos. *, P & lt; 0,01. B. La expresión ectópica de foxo4 WT o constitutivamente activa (TM) disminuye CWR22Rv1 invasividad. Foxo4 ectópico fue evaluada por IB (
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) y su efecto sobre la capacidad de invasión de Matrigel se cuantificó (
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). Las barras de error, S. E. de triplicados experimentos. *, P & lt; 0,01. C. La invasión local de LNCaP [Vector] (
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) vs LNCaP [shFOXO4] (
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) se evaluó para las células sembradas sobre la gelatina marcado con Oregon Green 488, con células marcadas por DAPI. D. El mismo análisis que en C, excepto la comparación CWR22Rv1 expresan de forma estable vector o Myc-foxo4. E. pulmón, hígado, riñón y LN de ratones portadores de tumor individuo con LNCaP [Vector] (control) o LNCaP [shFOXO4] fueron imágenes utilizando la luz visible (
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) o luz fluorescente (
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). Flechas, LN y renales metástasis. F. lesiones metastásico LN de una LNCaP [shFOXO4] portadores de tumor de ratón teñida para H & amp; E o GFP (por IHC). Triángulos, ejemplos de células metastásicas positivas para GFP.
Dado que los miembros de la familia FOXO comparten algunas funciones redundantes [31], se analizaron los niveles de FoxO1 y FOXO3 en células de CaP y puesto a prueba su capacidad para controlar la invasividad. En contraste con foxo4, niveles FoxO1 y FOXO3 parecían aumentar en las variantes más invasivos de LNCaP y PC-3 células (figuras S4A & amp;. B). Curiosamente, la caída de FoxO1, pero no FOXO3, en las células LNCaP inducida invasividad mayor (Fig. S4C), sin embargo, la expresión forzada de cualquiera FoxO1 o FOXO3 fracasaron en reducir la invasividad de las células CWR22Rv1 (Fig. S4D). Así, mientras que FoxO1 puede estar involucrado con la capacidad invasora de LNCaP, foxo4 es a la vez involucrado con y suficiente para el control de la invasividad.
A continuación, si la prueba de caída foxo4 podría promover la metástasis espontánea
in vivo
. ratones desnudos machos incrustados con gránulos de testosterona de liberación prolongada se inyectaron en sus lóbulos dorsales con LNCaP [vector] o células LNCaP [shFOXO4], y después de diez semanas, se sacrificaron los ratones y se analizaron para la fluorescencia de GFP como un marcador de pGIPZ. Aunque los [shFOXO4] Los tumores primarios del sitio LNCaP fueron ligeramente más pequeñas que las inducidas por las células LNCaP [Vector], esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. S3B). Es importante destacar, no había diferencia en su expresión de GFP relativa (Fig S3C.), O sus tasas de proliferación o apoptosis
in vivo
basado en Ki67 o escindido tinción de caspasa-3 IHC (Figs S3D & amp;. E, respectivamente) . knockdown foxo4 dio lugar a la mayor incidencia de macrometástasis que expresan GFP a ganglios linfáticos de drenaje local (LN), riñón (Fig. S3E) y de pulmón en comparación con las células control (Tabla 1). En concreto, el 82% (9/11) del grupo shFOXO4 tenía metástasis LN, en comparación con el 31% (5/16) en el grupo control; 27% (3/11) y 9,1% (1/11) en el grupo shFOXO4 tenían renales y pulmonares metástasis, respectivamente, mientras que las metástasis se encontraron en ninguna (0/16) del grupo de control. Además, se confirmó que las lesiones LN expresan la proteína GFP usando específica de GFP IHC (Fig. 3F).
Análisis de genes pro-metástasis foxo4-regulado
Dado que FOXO proteínas funcionan como represores de la transcripción, hemos explorado si el aumento de la invasividad después de la pérdida foxo4 podría ser debido al incremento de la expresión de genes pro-metástasis. Por lo tanto, el análisis de la expresión de genes en todo el genoma se realizó en LNCaP [Vector] vs LNCaP [] shFOXO4 células cultivadas, tumores primarios y metástasis de sitio LN. Desmontables de foxo4 en cada uno de estos conjuntos de la muestra fue confirmada por IB (Fig. S5A). Este análisis identificó 535 genes cuya expresión cambiado ≥1.5 veces (Fig. S5B). De éstos, 54 cambios fueron comunes a los tres conjuntos de muestras (Fig. 4A, la Fig. S5C), y de éstos, 19 genes regulados positivamente (15, 4) Downregulated se asociaron con foxo4 desmontables (Fig. 4B). Con el fin de centrar el análisis, se analizaron mediante el software Ingenuity IPA, que la firma de 19 genes estuvo involucrado en los procesos asociados a metástasis, tales como la motilidad celular, invasión, la quimiotaxis o la supervivencia celular. Ocho genes regulados en las metástasis LN-shFOXO4 asociados (
PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP
, y
PGC
) fueron identificados como potencialmente implicados en la metástasis (Fig . 4C,
top of). (Ver Fig. 2).