Extracto
La heparina vinculante del factor de crecimiento epidérmico-como factor de crecimiento (HB-EGF) es un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico y tiene una variedad de funciones fisiológicas y patológicas. Modulación de la actividad HB-EGF podría tener un potencial terapéutico en el área de oncología. Hemos explorado las posibilidades terapéuticas mediante la caracterización de la
in vitro
actividad biológica del anticuerpo monoclonal anti-HB-EGF Y-142. Se probaron los receptores de EGF (EGFR) y ligando especies especificidades de Y-142. actividades neutralizantes de Y-142 contra HB-EGF se evaluaron en la señalización del EGFR y ERBB4. Las actividades biológicas de Y-142 se evaluaron en la proliferación de células cancerosas y ensayos de angiogénesis y se compararon con el cetuximab anti-EGFR de anticuerpos, la CRM197 inhibidor de HB-EGF, y el bevacizumab anticuerpo anti-factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). El epítopo de unión se determinó con barrido de alanina. Y-142 reconoce HB-EGF, así como la anfirregulina ligando EGFR, y unido específicamente a humano HB-EGF, pero no a roedor HB-EGF. Además, Y-142 neutralizó la fosforilación inducida por HB-EGF de EGFR y ErbB4 y bloquearon su señalización ERK1 /2 y AKT aguas abajo. También se encontró que Y-142 inhibió HB-EGF inducida por la proliferación de cáncer de células, la proliferación de células endoteliales, la formación de tubos, y la producción de VEGF más eficazmente que cetuximab y CRM197 y que Y-142 era superior al bevacizumab en la inhibición de HB-EGF la formación de tubos inducida. Seis aminoácidos en el dominio de tipo EGF se identificaron como el epítopo de unión Y-142. Entre los seis aminoácidos, la combinación de F115 y Y123 determinó la anfirregulina reactividad cruzada y que F115 representó la selectividad de especies. Además, se sugirió que la actividad neutralizante potente de Y-142 se deriva de su reconocimiento de R142 y Y123 y su alta afinidad a HB-EGF. Y-142 tiene una potente actividad neutralizante HB-EGF que modula múltiples actividades biológicas de HB-EGF incluyendo la proliferación de células de cáncer y las actividades angiogénicas. Y-142 puede tener un potencial para ser convertido en un agente terapéutico para el tratamiento de los cánceres de HB-EGF-dependientes
Visto:. Sato S, Drake AW, Tsuji I, J Fan (2012) Un potente anti -HB-EGF anticuerpo monoclonal inhibe la proliferación de células cancerosas y múltiples actividades angiogénicas de HB-EGF. PLoS ONE 7 (12): e51964. doi: 10.1371 /journal.pone.0051964
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2012; Aceptado: 9 de noviembre de 2012; Publicado: December 14, 2012
Derechos de Autor © 2012 Sato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. No hay corriente fuentes externas de financiación para este estudio
Conflicto de intereses:. los autores no tienen los siguientes intereses. Este estudio fue financiado por Takeda San Francisco, Inc. y Takeda Pharmaceutical Company Limited. Todos los autores son empleados de Takeda San Francisco, Inc. o de Takeda Pharmaceutical Company Limited y se pagaron como tal. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La heparina vinculante del factor de crecimiento epidérmico (EGF ) factor de crecimiento -como (HB-EGF) es un miembro de la familia EGF de factores de crecimiento que se une al receptor de EGF (EGFR) y ERBB4 [1], [2]. HB-EGF se sintetiza como una forma unida a membrana, proHB-EGF, que se sabe que es un factor de crecimiento juxtacrine [3], [4]. proHB-EGF se somete a derramamiento ectodominio por proteasas [5], así como el desprendimiento se acelera cuando las células proHB-EGF expresan están expuestos a ciertas condiciones de estrés [6], [7]. La forma soluble resultante de HB-EGF (SHB-EGF) tiene una actividad mitogénica potente a través de la activación de EGFR [1]. Tras la escisión, el fragmento de HB-EGF C-terminal se transloca en el núcleo e induce la expresión del gen de ciclina A y cyclinD2 por la supresión de la función de PLZF y BCL6, respectivamente [8], [9].
Estudios recientes han revelado una variedad de funciones fisiológicas de HB-EGF, incluyendo el desarrollo de tejidos [10] - [12], la cicatrización de heridas [13], y el embarazo [14], [15]. HB-EGF también se ha encontrado para ser asociado con procesos patológicos, incluyendo la hipertrofia cardíaca [16], la hipertensión pulmonar [17], aterosclerosis [18], [19], y la transformación oncogénica [20]. Más recientemente, el aumento de la evidencia ha demostrado que HB-EGF es sobre-expresa en múltiples tipos de cáncer [21] - [25] y la sobreexpresión se ha demostrado que se correlaciona con mal pronóstico [24], [26], [27 ]. Debido a estos hallazgos, agentes anti-HB-EGF se han buscado activamente para aplicaciones terapéuticas. Un inhibidor de HB-EGF del mutante de toxina de la difteria, CRM197, es en la Fase I de desarrollo clínico para el tratamiento de cánceres de ovario avanzado [28]. Anti-HB-EGF anticuerpos U3-1565 y KHK2866 están actualmente en Fase I de ensayos clínicos para cánceres sólidos [29]. Se espera que un anticuerpo monoclonal terapéutico anti-HB-EGF para tener una vida media más larga en comparación con CRM197 [30], [31], pero la generación de anticuerpos anti-HB-EGF potentes ha sido difícil y pocos anti-HB-EGF anticuerpos monoclonales con una actividad funcional se ha informado [29], [32], [33]. Recientemente, se informó de la generación de anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-HB-EGF [34]. En este estudio, se presenta la caracterización de uno de los anticuerpos monoclonales anti-HB-EGF, Y-142, mediante el análisis de sus actividades funcionales y de unión a epítopo. La potente actividad biológica de Y-142 se comparó con los de la cetuximab anticuerpo anti-EGFR, de la CRM197 inhibidor de HB-EGF, y de bevacizumab anticuerpo anti-VEGF.
Materiales y Métodos
Materiales
humano, ratón, rata y SHB-EGF, y EGFR-hFc se prepararon previamente del sobrenadante de cultivo de células 293F (Invitrogen) transfectadas con cada plásmido de expresión [34]. ligandos de EGFR, anti-anfirregulina (-ARG anti) anticuerpo monoclonal, anti-EGFR, anti-ERBB4, anti-HB-EGF y anti-ARG anticuerpos policlonales, marcado con FITC anti-CD31, anti-VEGF, biotinilado anti-VEGF , peroxidasa de rábano marcado (marcados con HRP) anticuerpos anti-fosfotirosina se compraron de R & amp; D Systems. Anti-fosforilados ERK1 /2 y anticuerpos anti-AKT fosforilados se adquirieron de Cell Signaling Technology. anticuerpo IgG anti-conejo marcado con Alexa488 se obtuvo de Invitrogen. IgG de ratón control, estreptavidina marcada con HRP, marcado con HRP anti-ratón, los anticuerpos IgG anti-cabra, cabra marcado con Cy5 anti-ratón IgG Fc gamma anticuerpo específico, y el anticuerpo IgG Fc anti-humano se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories. Cetuximab y CRM 197 eran de ImClone y Sigma Aldrich, respectivamente. Sulfo-tagged anticuerpo anti-ratón y estreptavidina sulfo-etiquetados fueron adquiridos de Meso Escala Discovery. Sulfo-etiquetados anticuerpo anti-fosfotirosina se preparó mediante el etiquetado de anticuerpo anti-fosfotirosina (Millipore) con el reactivo sulfo Tag MSD (Meso Escala Descubrimiento).
Generación de anticuerpos
anticuerpo monoclonal
Anti-HB-EGF Y-142 se generó previamente [34]. En breve, Y-142 se preparó mediante la inmunización de ratones BALB /c (Japan Clea) con inyecciones subcutáneas de lapa ojo de cerradura hemocianina conjugado SHB-EGF y las inyecciones abdominales de 293F células transfectadas transitoriamente con un plásmido de expresión de proHB-EGF. Y-142 se purificó a partir de su sobrenadante de cultivo de hibridoma con rProteinA Sepharose (GE Healthcare). El estudio en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de Takeda Pharmaceutical Company Limited (Número de Permiso: 2802).
Cell Cultura y
línea celular de cáncer de ovario SK-OV-3, de mama línea celular de cáncer T47D, y línea celular de cáncer colorrectal SW480 fueron adquiridos de American Type Culture Collection y se mantienen con de McCoy 5A, RPMI1640, y Leibovit'z L-15 suplementado con 10% de suero, respectivamente. Fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron adquiridos de Lonza y mantenidos con MGF-2 y EGM-2 kits (Lonza), respectivamente.
Encuadernación prueba de especificidad
humano, ratón, rata o SHB-EGF fue inmovilizado en una placa de 384 pocillos MSD (Meso Escala Descubrimiento). La unión no específica se bloqueó con PBS que contenía 1% de BSA. entonces Y-142 se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con sulfo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió MSD Leer tampón T (Meso Escala Descubrimiento) y la quimioluminiscencia se midió con un Imager Sector 6000 (Meso Escala Descubrimiento). EGFR ligando especificidad de Y-142 se determinó por incubación de varias concentraciones de Y-142 durante 1 hora en una placa de 384 pocillos ligando inmovilizado EGFR seguido por incubación de anticuerpo IgG marcado con HRP anti-ratón durante 1 hora a temperatura ambiente. TMB peroxidasa EIA sustrato (BioRad) y luego se añadió a la placa de 384 pocillos y la reacción se detuvo después de 15 minutos mediante la adición de 1N H
2SO
4. la unión a ligando de EGFR de anticuerpos entonces se detectó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un instrumento SPECTRA MAX (Molecular Devices).
Biophysical Medición de K
D
KinExA experimentos se realizaron utilizando un instrumento KinExA 3200 (Sapidyne) a 22 ° C. SHB-EGF se reconstituyó en PBS. SHB-EGF y Y-142 muestras se prepararon en tampón desgasificado al vacío HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, y 0,005% de Tween-20) a partir de GE Healthcare con filtrada BSA 0,01% y azida sódica al 0,02%. Para el anticuerpo de detección, de cabra marcado con Cy5 anti-IgG de ratón, se utilizó Fc gamma específico. Para cada experimento KinExA, 20 g de SHB-EGF se diluyó en 1 ml de carbonato de sodio 50 mM (pH 9,2) que se añadió directamente a 50 mg de perlas de azlactona (UltraLink biosoporte, Thermo Scientific), y se balanceó durante la noche a 4 ° C . Después de balanceo, las perlas se lavaron una vez con 1 M Tris-HCl (pH 8,5) que contiene 1% de BSA y sacudieron durante 1 hora a temperatura ambiente en el mismo tampón. perlas acopladas se añadieron al depósito del talón en el instrumento KinExA y se diluyeron a 30 ml con HBS-N (HEPES 10 mM y NaCl 150 mM, GE Healthcare) que contiene 0,02% de azida de sodio, que también fue el tampón de ejecución para el instrumento KinExA. Todas las perlas de antígenos acoplados se utilizaron inmediatamente después de su preparación.
Para K
D-experimentos controlados, 12 concentraciones de SHB-EGF en un rango de 4,04 FM-207 pM se equilibraron a temperatura ambiente durante 72 horas con 13:03 Y-142 sitios de unión. El volumen fluyó a través del paquete de perlas para cada muestra en el K
titulación D controlado-fue de 23 ml a un caudal de 0,25 ml /min. Para los experimentos de anticuerpos controlados, 12 concentraciones de SHB-EGF en una gama de 4,67 FM-239 pM se equilibraron a temperatura ambiente durante 24 horas con sitios de unión de 35,6 pM Y-142. El volumen fluyó a través del paquete de perlas para cada muestra en la titulación de anticuerpos controlado fue de 3 ml a una velocidad de flujo de 0,25 mL /min. K
D-controlada de datos y los datos de anticuerpos controlado se ajusten al mismo tiempo con un modelo de cooperatividad positiva de doble curva utilizando el software KinExA (versión 3.13, Sapidyne).
SHB-EGF inhibición de unión a EGFR
la actividad inhibidora de Y-142 contra la unión de SHB-EGF a EGFR-hFc se detectó como se describe anteriormente [34]. En resumen, el anticuerpo IgG Fc anti-humano se inmovilizó sobre una placa de 96 pocillos durante la noche a 4 ° C. Después de que las placas se bloquearon con PBS que contenía Immunoblock (Dainippon Sumitomo Pharma), se añadió 20% EGFR-hFc y se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añadió Y-142 y se incubó a una concentración de 6,7 nM en presencia de 0,63 nM biotinilado SHB-EGF y 25 ng /ml de heparina sódica durante 1 hora a 37 ° C, seguido por la adición de estreptavidina marcada con HRP y la incubación durante 1 hora a 37 ° C. A continuación se añadió SureBlue TMB micropocillos de sustrato y la reacción se detuvo después de 15 minutos mediante la adición de 1N H
2SO
4. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando SPECTRA MAX. La unión de SHB-EGF a EGFR-hFc en presencia de Y-142 se calculó como el porcentaje de la unión que se midió de SHB-EGF de unión a EGFR-hFc en ausencia de Y-142 máximo. Se detectó la señal de control de unión mínimo en ausencia de SHB-EGF y Y-142.
se detectó EGFR Ensayo de fosforilación
fosforilación de EGFR como se describe anteriormente [34]. Brevemente, las células SK-OV-3 se sembraron a 1 x 10
4 células /pocillo en medio 5A de McCoy que contenía 1% de suero en una placa de 96 pocillos. Después de un cultivo de 1-día, las células fueron incubadas con 10 nM SHB-EGF o 10 nM ARG junto con Y-142 o el anticuerpo monoclonal anti-ARG durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se lisaron en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) con un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Applied Science) y un cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma Aldrich). Los lisados celulares se incubaron a continuación en una placa recubierta con anticuerpo policlonal anti-EGFR durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación con el anticuerpo anti-fosfotirosina marcado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una incubación con peroxidasa TMB EIA de sustrato durante 15 minutos, la reacción se detuvo mediante la adición de 1N H
2SO
4. fosforilación de EGFR se detectó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). la fosforilación del EGFR en presencia de Y-142 o el anticuerpo anti-ARG se calculó como el porcentaje de la fosforilación de EGFR máxima medida en ausencia de Y-142. El control mínimo fosforilación se detectó señal en ausencia de SHB-EGF, ARG, Y-142, y anti-ARG anticuerpo.
ERBB4 Ensayo de fosforilación
células T47D se sembraron a 2,5 x 10
4 células /pocillo en una placa de 96 pocillos con medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero y se cultivaron durante 1 día. Después de ser plateado, las células se privaron de suero durante 1 día y después se trató con 10 nM SHB-EGF junto con diversas concentraciones de Y-142 durante 30 minutos a 37 ° C. Los lisados celulares se prepararon como en el ensayo de fosforilación de EGFR se ha descrito anteriormente y después se incubaron en un MSD placa de 384 pocillos recubiertos de anticuerpo policlonal anti-ERBB4 durante 1 hora a temperatura ambiente. Para detectar la fosforilación del receptor, anticuerpo anti-fosfotirosina sulfo-etiquetado se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. MSD Lee tampón T después se añadió como sustrato y la quimioluminiscencia se midió con un fosforilación ERBB4 Imager Sector 6000. en presencia de Y-142 se calculó como el porcentaje de la fosforilación máxima ERBB4 medida en ausencia de Y-142. El control mínimo fosforilación se detectó señal en ausencia de SHB-EGF y Y-142.
ERK1 /2 y AKT fosforilación Ensayos
Para la detección de la fosforilación de ERK1 /2 o AKT , se sembraron SK-OV-3 células como se describió anteriormente. Las células cultivadas en placas se fijaron con 3,8% de paraformaldehído durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (tampón de lavado) tres veces, y se bloquearon con tampón de lavado que contiene 1% de BSA, 2% de suero de cabra, 0,3% gelatina de pescado fría piel, 0,1% Triton X-100, y azida sódica al 0,05%. Las células fueron incubadas con anti-fosforilados ERK1 /2 de anticuerpo o anticuerpo AKT anti-fosforilada durante la noche a 4 ° C, se lavaron tres veces con tampón de lavado, y se incubaron con anticuerpo IgG anti-conejo marcado con Alexa488 durante 2 horas a temperatura ambiente. Con el fin de medir la proteína total en cada pocillo, se incubaron las células con éster de succinimidilo Alexa647 (Invitrogen) en tampón de lavado. Fosforilados ERK1 /2 y AKT, así como la proteína total se detectaron con un instrumento ImageXpress Micro (Molecular Devices). Los niveles de fosforilación de ERK1 /2 y AKT se normalizaron con la cantidad total de proteína en cada pocillo. los niveles de fosforilación se calcularon como el porcentaje de los niveles máximos de fosforilación detectado en ausencia de Y-142. Se detectó la señal de control mínimo en ausencia de EGF y SHB-Y-142.
se añadieron Ensayo de proliferación celular
SK-OV-3 células a los 3 × 10
3 células /pocillo en medio 5A de McCoy que contenía 1% de suero y HUVEC se añadieron a la misma densidad en EBM-2 medios de comunicación (Lonza) que contiene 5% de suero tratado con carbón vegetal (Hyclone) a placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 1 día. Las células se cultivaron en presencia de 10 nM SHB-EGF con Y-142, cetuximab, o CRM197 durante 3 días. Varias concentraciones de cetuximab y CRM 197 se utilizaron de acuerdo con estudios anteriores [35], [36]. La proliferación celular se detectó con CellTiter-Glo (Promega) usando Envision. La proliferación celular de SK OV-3-células y HUVEC se calculó como el porcentaje del nivel de proliferación medido en ausencia de SHB-EGF, Y-142, cetuximab, y CRM197.
Tubo Formación Ensayo
NHDF se sembraron a 1 x 10
4 células /pocillo con un kit de MGF-2 en un negro placa de 96 pocillos de fondo transparente y se cultivaron durante 3 días. Un millar de HUVEC se sembraron sobre la monocapa de NHDF con EBM-2 medio que contiene 2% de suero tratado con carbón vegetal en presencia de 50 nM SHB-EGF con varias concentraciones de Y-142, cetuximab, CRM197, o bevacizumab. Se utilizó el amplio intervalo de concentración de cetuximab, CRM 197, o bevacizumab, de acuerdo con estudios anteriores [35] - [37]. Después de un período de incubación de 4 días, HUVEC se tiñeron con anticuerpo anti-CD31 marcado con FITC. Se detectaron células CD31-positivas usando un instrumento Acumen EX3 (TTP Labtech). la formación de tubos en presencia de Y-142, cetuximab, CRM197, o bevacizumab se calculó como el porcentaje de la formación de tubos detectado en presencia de SHB-EGF, Y-142, cetuximab, CRM197, y bevacizumab.
(a) La actividad de unión de Y-142 a EGFR ligandos por ELISA. Las diversas concentraciones de Y-142 se incubaron en una placa de ligando inmovilizado EGFR. La unión luego se detectó con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar (DE) de los valores adquiridos por duplicado. (B) La actividad de unión de Y-142 a humano, ratón, rata y HB-EGF por ELISA. La actividad de unión a diferentes especies HB-EGF se midió por ELISA utilizando una tecnología basada en electroluminiscencia. Las diversas concentraciones de Y-142 se incubaron en una placa inmovilizada-SHB-EGF. La unión se detectó con anticuerpo anti-IgG de ratón sulfo-etiquetados. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por duplicado. alineación de ácido (C) amino del dominio de tipo EGF de los ligandos de EGFR. Un punto indica un aminoácido diferente de HB-EGF. Un guión representa una brecha. Las puntas de flecha etiquetados con un número indican los Y-142 epítopos de unión identificados en la Fig. 6. alineación ácido (D) amino del dominio de tipo EGF de humano, ratón, rata y HB-EGF. Un punto indica un aminoácido idéntico al humano HB-EGF. Las puntas de flecha etiquetados con un número indican los Y-142 epítopos de unión identificados en la Fig. 6.
anticuerpo monoclonal VEGF Medición
Anti-VEGF se inmovilizó en una gran placa de unión MSD durante la noche a 4 ° C. Cada pocillo se bloqueó con PBS que contenía 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. se añadió sobrenadante del cultivo del ensayo de formación de tubo descrito anteriormente a continuación, en cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. anticuerpo anti-VEGF biotinilado después se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación con estreptavidina sulfo-etiquetados durante 1 hora a temperatura ambiente. Lee T Buffer A continuación se añadió como sustrato y la quimioluminiscencia se midió con un instrumento 6000 Sector Imager. La cantidad de VEGF en el sobrenadante del cultivo se calcula como un porcentaje de la cantidad de VEGF en presencia de SHB-EGF.
Western Blot
SHB-EGF y ARG se hirvieron en tampón de muestra Laemmli ( BioRad) con o sin ditiotreitol 10 mM durante 5 minutos a 95 ° C. El no reducido o reducido SHB-EGF o ARG continuación, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. SHB-EGF se detectó ya sea con 3 mg /ml de Y-142 o 3 mg /ml de anti-HB-EGF anticuerpo policlonal como el anticuerpo primario, seguido de incubación con HRP marcado con anti-ratón de anticuerpos IgG o anti marcado con HRP -goat anticuerpo IgG, respectivamente, como el anticuerpo secundario. ARG se detectó ya sea con 3 mg /ml de Y-142 o 3 mg /ml de anticuerpos anti ARG-anticuerpo policlonal como el anticuerpo primario, seguido de incubación con HRP marcado con anti-ratón de anticuerpos IgG o anticuerpo IgG anti-cabra marcado con HRP , respectivamente, como anticuerpo secundario.
mapeo de epítopos
estudio de mapeo de epítopos se llevó a cabo como se describe anteriormente [33]. En resumen, los plásmidos de expresión de mutantes de alanina proHB-EGF se prepararon con un kit de mutagénesis Plus KOD (Toyobo). Cada plásmido de expresión se transfectó en células SW480 con Lipofectamine Plus LTX con reactivo (Invitrogen) en placas de 96 pocillos. Dos días después de la transfección, las células se lavaron una vez con PBS (+) (PBS con mM CaCl 0,5
2 y MgCl 0,5 mM
2) y después se incubaron en 1% PBS durante 30 minutos a 4 ° que contiene BSA- DO. Las células fueron lavadas tres veces con PBS (+) y se incubaron con 200 nM Y-142 o anti-HB-EGF anticuerpo policlonal durante 30 minutos a 4 ° C. Después de las etapas de lavado, marcado con HRP anti-IgG de ratón marcado con HRP o-se añadió anti-IgG de cabra-anticuerpo para detectar Y-142 o anti-HB-EGF anticuerpo policlonal, respectivamente. Después de lavar dos veces con PBS (+), TMB peroxidasa EIA de sustrato se añadió a cada pocillo y se incubó durante 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 1N H
2SO
4. Unión de los anticuerpos se detectó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un instrumento Envision. Con el fin de tener en cuenta las diferencias entre los niveles de expresión proHB-EGF, la unión de Y-142 a cada mutante proHB-EGF se normalizó con la del anti-HB-EGF anticuerpo policlonal por cada mutante. La unión de Y-142 por ciento se calcula entonces utilizando la siguiente fórmula: (%) = (A /B) /(C /D) x 100, donde A representa la absorbancia a 450 nm de Y-142 en Y-142 de unión mutante proHB-EGF, B representa la absorbancia (450 nm) de anti-HB-EGF anticuerpo policlonal en el mutante proHB-EGF, C representa la absorbancia (450 nm) de y-142 de tipo salvaje proHB-EGF, y D representa la absorbancia (450 nm) de anti-HB-EGF anticuerpo policlonal de tipo salvaje proHB-EGF.
Resultados
especificidad de unión de Y-142
la neutralización de anti anticuerpos HB-EGF se generaron previamente por un enfoque de hibridoma [34]. En el estudio, que caracteriza uno de los anticuerpos monoclonales anti-HB-EGF, Y-142. Primero probamos el perfil de unión de Y-142 a EGF ligandos utilizando ELISA (Fig. 1A). Y-142 mostró comparable unión a HB-EGF y anfirregulina (ARG), pero no a los otros cuatro ligandos de EGFR. A continuación, examinó la especificidad de especie de Y-142 mediante pruebas de su unión a humanos, de ratón y de rata HB-EGF. Como se muestra en la Fig. 1B, Y-142 con destino a humano SHB-EGF, pero no para ratón y de rata HB-EGF.
Biofísica medición de k
D para Y-142 a HB-EGF
La K
valor D de Y-142 a humano HB-EGF se midió utilizando el método de ensayo de exclusión cinética (KinExA). K
datos de valoración D controlados se obtuvieron mediante el uso de un intervalo de concentraciones SHB-EGF equilibrada con una concentración constante Y-142 sitio de unión (2 × la concentración molecular) de 13:03. Para los experimentos de anticuerpos controlada, varias concentraciones de SHB-EGF se equilibraron con una concentración de sitio de unión Y-142 constante de 35,6 pM. En un análisis de doble curva, la K
curva D controlada contiene la mayor parte del K
D información mientras que la curva anticuerpo controlado devuelve un valor para la concentración de sitio de unión del anticuerpo monoclonal. Este último parámetro se puede comparar con la concentración nominal sitio de unión del anticuerpo monoclonal que puede determinar si el K estimado
D debe ajustarse para la actividad del antígeno en algunos casos [38]. El K
D-controlado datos de valoración y los datos de titulación de anticuerpos fueron inicialmente controlados en forma en un análisis de doble curva con un modelo de unión 1:01 equilibrio estándar. Se observó, sin embargo, que las curvas de valoración recogidos en virtud tanto K
D- y las condiciones de anticuerpos controlado disminuyeron con una pendiente más pronunciada que el descrito por el modelo estándar 01:01. Esta pendiente más pronunciada sólo puede explicarse por el uso de un modelo de cooperatividad positiva. En el modelo de cooperatividad positiva, la unión de HB-EGF a un sitio de unión del anticuerpo monoclonal hace que la afinidad del segundo sitio de unión del anticuerpo para aumentar [39]. Por lo tanto, se utilizó un modelo de equilibrio cooperatividad positiva para ajustar los datos de titulación de doble curva que proporciona un mejor ajuste al conjunto de datos de doble curva, produciendo una efectiva K
D = 13:50 (Fig. 2). Además, el coeficiente de Hill resultante (n = 1,68) fue mayor que 1 que también indica cooperatividad positiva (n = 1 significa independiente de unión) [39].
Dual-curva KinExA equilibrio titulación de SHB-EGF de unión a Y-142. K
D-controlado datos (curva ajustada inferior) fueron adquiridos por equilibrar SHB-EGF a un intervalo de concentración de 4,04 FM-207 pm con sitios de unión 13:03 Y-142. los datos de anticuerpos controlados (curva superior entallada) fueron adquiridos por equilibrar SHB-EGF a un intervalo de concentración de 4,67 FM-239 pm con sitios de unión de 35,6 pM Y-142. Todos los puntos de datos fueron adquiridos por duplicado. Ambas curvas fueron simultáneamente ajustaron a un modelo cooperatividad equilibrio positivo estándar, produciendo una efectiva K
D = 13:50 (0.31) donde el número entre paréntesis es el intervalo de confianza del 95% del ajuste, y un coeficiente de Hill n = 1,68.
actividad neutralizante de y-142 contra SHB-EGF y ARG Señalización
a medida que la sobre-expresión de HB-EGF se ha informado en tejidos de cáncer [21] - [25] , se espera que la neutralización de la funcionalidad SHB-EGF como un potencial terapéutico prometedor. por lo tanto, la actividad neutralizante de Y-142 contra SHB-EGF se evaluó en dos ensayos bioquímicos y basados en células. EGFR es uno de los receptores de HB-EGF, y la unión de SHB-EGF a EGFR conduce a la fosforilación de EGFR y la activación de su señalización aguas abajo. Se encontró que la unión de SHB-EGF a EGFR-hFc se bloqueó completamente con Y-142 (Fig. 3A). La actividad de bloqueo SHB-EGF de Y-142 fue traducido con la inhibición completa de la fosforilación de EGFR inducida por SHB-EGF (Fig. 3B). Además de EGFR, SHB-EGF se une y activa ERBB4 vía de señalización [2]; de hecho, hemos demostrado que Y-142 podría neutralizar la fosforilación inducida por EGF de SHB-ERBB4 expresado de forma endógena en las células T47D (Fig. 3C). Es importante destacar que la actividad neutralizante de Y-142 EGFR afectada aguas abajo de señalización de eventos. Como se muestra en las Figs. 3D y 3E, Y-142 neutralizan la fosforilación inducida por EGF de SHB-ERK1 /2 y AKT, respectivamente. En conjunto, nuestros resultados mostraron que SHB-EGF se une y activa el EGFR y ERBB4, y que Y-142 puede neutralizar la señalización de EGFR y ERBB4 inducida por SHB-EGF.
(A) La actividad inhibidora de Y-142 a SHB-EGF de unión a EGFR. EGFR-hFc se incubó en una placa recubierta con anticuerpo IgG Fc anti-humano. entonces Y-142 se incubó a una concentración de 6,7 nM en presencia de 0,63 nM biotinilado SHB-EGF durante 1 hora a 37 ° C. SHB-EGF unido a EGFR en HFC fue detectado por estreptavidina marcada con HRP. SHB-EGF de unión a EGFR-hFc en presencia de Y-142 se calculó como un porcentaje de la "control" SHB-EGF de unión a EGFR que se produjo sin Y-142. Los puntos de datos representan la media + SD de los valores adquiridos por triplicado. (B) la actividad neutralizante de Y-142 contra la fosforilación de EGFR. células SK-OV-3 fueron tratados con 10 nM SHB-EGF y 67 nM Y-142. Los lisados celulares se incubaron en una placa recubierta con anticuerpo anti-EGFR, seguido de una incubación con el anticuerpo anti-phosphorytosine marcado con HRP. la fosforilación del EGFR en presencia de Y-142 se calculó como un porcentaje de la "control" de la fosforilación de EGFR que se produjo sin Y-142. Los puntos de datos representan la media + SD de los valores adquiridos por triplicado. (C) actividad neutralizante de Y-142 contra la fosforilación ERBB4. Los lisados celulares de células T47D como se preparó en la Fig. 3A se incubaron en una placa recubierta con anticuerpo anti-ERBB4. La fosforilación de ERBB4 se detectó mediante un anticuerpo anti-fosfotirosina sulfo-etiquetados. fosforilación ERBB4 en presencia de Y-142 se calculó como un porcentaje de la "control" fosforilación ERBB4 que se produjo sin Y-142. Los puntos de datos representan la media + SD de los valores adquiridos por duplicado. (D) y (E) la actividad de Y-142 neutralizantes contra (D) ERK1 /2 fosforilación y (E) la fosforilación de AKT. En (D) y las células (E) SK-OV-3 tratados con 10 nM SHB-EGF y 200 nM Y-142 se tiñeron con un ERK1 2 anticuerpo anti-fosforilado /o un anticuerpo AKT anti-fosforilado, respectivamente, seguido de un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Alexa488. ERK1 fosforilada /2 y AKT fosforilada fueron detectadas tanto con un instrumento ImageXpress Micro y calculan como un porcentaje de los niveles de fosforilación de "control" que se produjo sin Y-142. Los puntos de datos representan la media + SD de los valores adquiridos por duplicado. (F) la actividad neutralizante de Y-142 a ARG. SK-OV-3 células fueron tratadas con 10 nM ARG más diversas concentraciones de Y-142 (2 nM, 6,7 nM, 20 nM, y 67 nM). anticuerpo monoclonal Anti-ARG (67 nM) se utilizó como control positivo. Los lisados celulares se incubaron en una placa recubierta con anticuerpo anti-EGFR seguido por una incubación con un anticuerpo anti-phosphorytosine marcado con HRP. fosforilación de EGFR se calculó como un porcentaje de la "control" de la fosforilación de EGFR que se produjo sin Y-142. Los puntos de datos representan la media ± desviación estándar de los valores adquiridos por triplicado.
En una prueba de especificidad de unión, Y-142 reconoce ARG, así como SHB-EGF, que son ambos ligandos de EGFR (Fig. 1A) . A continuación, prueba si Y-142 podría neutralizar la actividad biológica de ARG. La hipótesis de que Y-142 sería capaz de neutralizar la funcionalidad de ARG debido a su actividad neutralizante contra SHB-EGF y reactividad cruzada con ARG. Sin embargo, hemos sido capaces de demostrar que la fosforilación de EGFR inducida por ARG se neutralizó sólo parcialmente por Y-142 (Fig. 3F), mientras que Y-142 bloquea completamente la fosforilación de EGFR inducida por SHB-EGF (Fig. 3B). Estos resultados sugieren que Y-142 podría neutralizar las actividades funcionales tanto SHB-EGF y ARG, aunque la actividad de ARG en EGFR sólo es parcialmente bloqueado por Y-142.
Comparación de SHB-EGF actividad neutralizante de Y-142 con los de cetuximab, CRM 197, y Bevacizumab
la actividad neutralizante de y-142 contra SHB-EGF se comparó con dos inhibidores conocidos de la vía EGFR: cetuximab y CRM197. Cetuximab, un anticuerpo monoclonal anti-EGFR se utiliza como un agente terapéutico del cáncer, suprime el crecimiento de células de cáncer dependiente de EGFR mediante la inhibición de la activación de EGFR. CRM197, una toxina de difteria mutante, se une a proHB-EGF y la internalización subsecuente de CRM197 provoca la inhibición de la síntesis de proteínas. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.