Extracto
El cáncer de páncreas es una neoplasia agresiva que se diagnostica con frecuencia en una etapa avanzada con mal pronóstico. Aquí reportamos los efectos quimioterapéuticos de proantocianidinas bioactivos a partir de semillas de uva (GSP), que se calcularán utilizando
in vitro
y
En Vivo
modelos. El tratamiento de células de cáncer pancreático humano (MIAPaCa-2, PANC-1 y AsPC-1) con GSP
In Vitro
reducción de la viabilidad celular y el aumento de G2 /M fase de la detención del ciclo celular que conduce a la inducción de la apoptosis en una dosis y tiempo dependiente. La apoptosis inducida por GSP de células de cáncer pancreático se asoció con una disminución en los niveles de Bcl-2 y Bcl-XL y un aumento en los niveles de Bax y la caspasa-3 activada. Tratamiento de MiaPaCa-2 y PANC-1 células con GSP también disminuyeron los niveles de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la fosforilación de Akt en Ser
473. siRNA desmontables de PI3K a partir de células de cáncer de páncreas también reduce la fosforilación de Akt. Además, la administración dietética de GSP (0,5%, w /w) como una dieta de control AIN76A complementado inhibió significativamente el crecimiento de MIAPaCa 2-xenoinjertos tumorales pancreáticas cultivadas por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos, que se asoció con: (
i
) la inhibición de la proliferación celular, (
ii
) la inducción de la apoptosis de las células tumorales, (
iii
) aumento de la expresión de Bax, la expresión reducida de las proteínas anti-apoptóticas y la activación de la caspasa-3 células positivas, y (
iv
) disminución de la expresión de PI3K y p-Akt en los tejidos de xenoinjertos tumorales. En conjunto, estos resultados sugieren que los GSP puede tener un potencial efecto quimioterapéutico en el crecimiento de células de cáncer de páncreas
Visto:. Prasad R, M Vaid, Katiyar SK (2012) Uva Procianidólicos cáncer pancreático Inhibición de Crecimiento Celular
In Vitro Opiniones y
En Vivo
través de la inducción de la apoptosis y por la orientación de la PI3K /Akt. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10.1371 /journal.pone.0043064
Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de mayo de 2012; Aceptado: July 16, 2012; Publicado: 8 Agosto 2012
Copyright: © Prasad et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de la concesión de la revisión (SKK) Administración de Veteranos de Mérito. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas se considera que es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con cáncer en los Estados Unidos. Es una neoplasia agresiva que se diagnostica con frecuencia en una etapa avanzada con mal pronóstico; la tasa de supervivencia global a los 5 años es & lt; 5% [1], [2]. Sólo el 20% de los pacientes con cáncer de páncreas son elegibles para la resección quirúrgica, que sigue siendo la única terapia potencial curativo [3]. Aunque una combinación de quimioterapia y terapia de radiación puede mejorar la supervivencia, la mayoría de los pacientes mueren de progresión de la enfermedad que a menudo se asocia con la resistencia adquirida o intrínseca a la quimioterapia [4], [5]. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas que pueden dirigirse las moléculas asociadas con el crecimiento del tumor de páncreas y evitar o superar la resistencia a la apoptosis puede conducir a mejores resultados en los pacientes que sufren de cáncer de páncreas.
fitoquímicos no tóxicos ofrecen prometedora opciones para el desarrollo de estrategias quimioterapéuticos eficaces para diversos tipos de cáncer. Algunos estudios epidemiológicos de casos y controles apoyan el concepto de que el consumo de fitoquímicos bioactivos en la dieta reduce el riesgo de cáncer de páncreas [6], [7]. proantocianidinas de semillas de uva (GSP) son fitoquímicos bioactivos que han mostrado actividad anti-cancerígena en algunos modelos animales de tumores [8], http://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 - B10#B10and parecen exhibir un mínimo de toxicidad en animales de laboratorio [9], [10]. GSP se extraen fácilmente de uva semillas, y son una mezcla de dímeros, trímeros, tetrámeros y oligómeros de catequinas monoméricos y /o (-) - epicatequinas [9], [10]. GSP han demostrado tener propiedades anti-inflamatorias, anti-oxidantes y anti-metastásicos tanto en
in vitro
y
in vivo
modelos [8] - [12]. Inhiben por radiación ultravioleta y la carcinogénesis de la piel inducidos por carcinógenos químicos en modelos de ratón [9], [13]. Recientemente, hemos demostrado que la administración dietética de GSP con dieta de control AIN76A resultó en una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento de no pequeñas xenoinjertos de tumor de cáncer de pulmón de células [14]. GSP inhiben el potencial invasivo de melanoma y la cabeza y las células de carcinoma de células escamosas del cuello como evaluados utilizando
in vitro y modelos [11], [12]. Sin embargo, el potencial de anti-cancerígeno de GSP contra el cáncer de páncreas es en gran parte sin explorar.
El fosfatidilinositol 3'-quinasa (PI3K) /Akt es una vía de señalización fundamental que media varios procesos celulares, incluyendo la proliferación celular, el crecimiento , la supervivencia celular y la motilidad [15]. Aumento de la activación y la desregulación de los componentes de la vía PI3K /Akt se han implicado en muchos tumores malignos y en conferir resistencia a la quimioterapia [16]. Akt es un bien caracterizado de serina /treonina quinasa. El aumento de la actividad de Akt se ha implicado en varios tipos de cánceres, en la que promueve la supervivencia celular a través de efectos sobre numerosos objetivos de abajo, incluyendo la inactivación de las proteínas pro-apoptóticas, la activación de genes anti-apoptóticos y la progresión del ciclo celular [17]. La activación de Akt es un evento frecuente en el cáncer de páncreas y se asocia con pobres resultados variables pronósticas y [18] - [20]. Un estudio reveló que el 59% de los adenocarcinomas de páncreas mostró hiperactivación de Akt [18]. Algunos estudios indican que la inhibición de la vía PI3K /Akt sensibiliza a las células de cáncer de páncreas a la apoptosis efecto de la quimioterapia tanto
in vitro
y
in vivo
[21] - [23].
en el presente estudio, se evaluó el efecto quimioterapéutico del cáncer de páncreas GSP en el uso de las líneas de páncreas humano MiaPaCa-2, PANC-1 y AsPC-1 de células de cáncer como
y modelos de cultivo celular in vitro. Para comprobar los
in vitro
de datos, se realizó
in vivo
estudios de xenoinjertos de tumores. Nuestros resultados muestran que el tratamiento de células de cáncer pancreático con GSP como resultado la inhibición de la proliferación celular, la inducción de apoptosis y la inhibición de la PI3K /Akt.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos primarios se obtuvieron de la siguiente manera: anticuerpos específicos para Bax, Bcl-2, Bcl-XL, se escindió de la caspasa-3, PI3K, Akt, p-Akt y β-actina fueron adquiridos de Cell Signaling Technology (Beverly, MAMÁ); Ciclina B1, CDC25B, Cdc25C, Ki-67, y los anticuerpos secundarios, que se conjugaron-peroxidasa de rábano picante, se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). El kit de PI3K siRNA se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). La Anexina V-conjugado Kit de Detección de Apoptosis AlexaFluor488 se adquirió de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). El kit de ensayo de proteína era de Bio-Rad (Hercules, CA). MTT (3- [4,5-dimetil-2-il] -2,5-difenil bromuro de tetrazolio) y todos los otros productos químicos fueron de grado analítico y adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Los GSP se obtuvieron de la Kikkoman Corporation (Japón). La composición química y la estabilidad de los GSP se han descrito anteriormente [9], [10].
Células y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer de páncreas humano, ASPC-1, PANC-1 y MiaPaCa -2, se obtuvieron de American Type Culture Collection (Rockville, MD), y se cultivaron como se recomienda como monocapas en DMEM suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina de Invitrogen (Carlsbad, CA) en un incubador humidificado a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera. Los GSP se disolvieron en una pequeña cantidad de dimetilsulfóxido (DMSO, 100 l) antes de la adición a los medios de comunicación. La concentración máxima de DMSO en los medios no superó el 0,1% (v /v). Las células tratadas con DMSO sólo sirvieron como control del vehículo.
viabilidad celular y la muerte celular ensayos
El efecto de los GSP sobre la viabilidad de las células de carcinoma de páncreas se determinó usando el ensayo MTT como se describe anteriormente [24 ]. Brevemente, las células fueron tratadas con o sin GSP durante 24 y 48 h. Al final del tiempo estipulado, las células se trataron con 50 l de 5 mg /ml MTT y los cristales de formazán resultantes se disolvieron en 150 l de DMSO. La absorbancia del color se registró a 540 nm usando un lector de microplacas Bio-Rad 3350. El efecto de los GSP sobre la viabilidad celular se calculó en términos de porcentaje de control, al que se asignó arbitrariamente un valor de 100% de viabilidad. la muerte celular inducida por GSP se determinó usando un ensayo de exclusión de colorante azul tripán como se ha descrito anteriormente [24]. Brevemente, las células fueron tratadas con o sin GSP durante 24 y 48 h. A partir de entonces, se recogieron las células, se trataron con tinte azul de tripano 0,25% y las células que habían tenido hasta el colorante se contaron bajo un microscopio utilizando un hemocitómetro. La muerte celular inducida por los GSP se expresa como la media ± SD porcentaje de células muertas en cada grupo de tratamiento a partir de tres experimentos repetidos.
análisis del ciclo celular
MiaPaCa-2 y células PANC-1 eran tratados con diferentes concentraciones de GSP (0, 20, 40 y 60 mg /ml) en medio completo durante 48 h. a continuación, se recogieron las células, y se procesaron para análisis del ciclo celular, como se detalla anteriormente [24]. Brevemente, el 1 × 10
5 células se resuspendieron en 50 l de PBS frío al que se añadió 450 l de metanol frío y las células se incubaron durante 1 hora a 4 ° C. Después de la centrifugación, el sedimento se incubó con RNasa A (20 mg /ml) durante 30 min. Las células se incubaron con yoduro de propidio (50 mg /ml) en hielo en la oscuridad. La distribución del ciclo celular de las células luego se determinó usando un instrumento FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado con el software de la célula de Quest 3.3 en el Core Facility, del Centro Oncológico Integral de la UAB.
La muerte celular apoptótica el análisis por citometría de flujo
GSP-inducida por la muerte celular apoptótica en células de cáncer de páncreas se determinó cuantitativamente mediante citometría de flujo utilizando la Anexina Alexa Fluor 488 kit de detección de apoptosis V conjugada siguiendo el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [24]. En pocas palabras, después del tratamiento de las células con GSP durante 48 h, se recogieron las células, se lavaron con PBS y se incubaron con anexina V Alexa fluor488 (Alexa488) y yoduro de propidio durante 10 minutos en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron a continuación por la célula activada por fluorescencia utilizando el instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) y el software Cell de Quest 3.3.
Western El análisis de transferencia
Después del tratamiento de células de cáncer pancreático con o sin GSP las células se recogieron, se lavaron con PBS frío, y se lisaron con tampón de lisis enfriado en hielo suplementado con inhibidores de la proteasa como se detalla anteriormente [24]. Para el análisis de transferencia Western, las proteínas se resolvieron en 10% geles de Tris-glicina y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, la membrana se incubó con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. A continuación, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiada y las bandas de proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando reactivos de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La membrana se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-β-actina para verificar la carga igual de proteínas en el gel.
Animales y modelo de xenoinjerto de tumor
Mujer ratones desnudos atímicos de 4-5 semanas de edad fueron comprados por el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) y se aloja en la Facilidad de recursos Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham, en conformidad con las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo. El protocolo animal utilizado en este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham, y el número de protocolo animal es: 101109267. Los ratones se les proporcionó una dieta AIN76A esterilizada y agua
ad libitum
. Para determinar el
in vivo
eficacia de la quimioterapia de los GSP dietéticos contra el crecimiento de xenoinjertos de tumores de páncreas humano, que crece exponencialmente MiaPaCa-2 células (5 × 10
6 en 100 l de PBS) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Un día después de la inoculación de células tumorales, los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos de ocho ratones por grupo. Un grupo de ratones recibió la dieta de control AIN76A, mientras que el segundo grupo de ratones recibió una dieta control AIN76A complementado-GSP 0,5% en forma de gránulos a lo largo del período del experimento. El experimento se terminó en el 11
ª semana después de la inoculación de las células tumorales. se registró el crecimiento del tumor y el peso corporal por ratón por semana. El tamaño del tumor se midió utilizando calibres Vernier y los volúmenes se calcularon utilizando la fórmula modelo hemiellipsoid: volumen del tumor = ½ (4π /3) (l /2) H, en donde L = longitud, W = ancho y H = altura (/2 w) . Sobre la base de las directrices del IACUC, el tamaño del tumor no debe aumentar más de 1,5 cm
2 o tamaño de una moneda de diez centavos. En esta etapa, se terminó el experimento, los ratones se sacrificaron, se extirpó el tumor de cada ratón y el peso húmedo de cada tumor en cada grupo se registró. Una porción del tumor se usó para preparar lisados tumorales para análisis de transferencia Western y la otra porción del tejido se embebió en parafina y se utiliza para el análisis inmunohistoquímico.
Detección inmunohistoquímica de Ki-67-positivas, p-Akt células de caspasa-3-positivo -positivas y activados
secciones del tumor
embebidos en parafina-(5 m de espesor) se deparaffinized y rehidratada, tal como se describe anteriormente [25]. Después de la rehidratación, recuperación de antígeno se llevó a cabo mediante la colocación de los portaobjetos en 10 mmol /L de tampón de citrato de sodio (pH 6,0) a 95 ° C durante 20 min seguido de un enfriamiento de 20 min. A continuación, las secciones se lavaron en PBS y no específicas sitios de unión se bloquearon con 1% de albúmina de suero bovino con 2% de suero de cabra en PBS antes de la incubación con anticuerpos anti-Ki-67, anti-p-Akt o anti-exfoliados caspasa-3 anticuerpo. Después del lavado, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado seguido de rábano picante estreptavidina conjugada con peroxidasa. Las secciones se incubaron adicionalmente con sustrato de 2,4-diaminobencidina y de contraste con hematoxilina. Las caspasas Ki-67-positivas y escindido células 3-positivas en una sección se contaron en al menos 4-5 campos diferentes y se fotografiaron usando un microscopio Olympus (modelo BX40F4, Tokio, Japón) equipado con una cámara de color Q-5 Olympus.
ensayo de TUNEL de células apoptóticas
el ensayo de TUNEL se realizó utilizando DeadEnd
TM kit colorimétrico TUNEL System (Promega Corporation, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. En pocas palabras, después de la recuperación de antígeno, las secciones tumorales (5 micras de espesor) se fijaron mediante incubación con 4% de paraformaldehído a 4 ° C. Las secciones permeabilizadas se incubaron con la mezcla de reacción y de nucleótidos catalizada por enzimas (IDTE) de terminal recombinante desoxinucleotidil transferasa durante 60 min a 37 ° C en la oscuridad. Después de la inmersión en tampón /lavado de parada durante 15 min a temperatura ambiente, las secciones se lavaron con PBS para eliminar no incorporada fluoresceína-12-dUTP y los núcleos de contraste con hematoxilina. células TUNEL positivas fueron examinados y contados bajo el microscopio. Las células TUNEL positivas se expresan como un porcentaje del total de células en el campo microscópico.
El análisis estadístico
La significación estadística de la diferencia entre los valores de los grupos de control y tratamiento se determinó por cualquiera estudiante
t
sencilla prueba o ANOVA de una vía seguido por
post hoc
la prueba de Tukey para comparaciones múltiples utilizando GraphPad Prism versión 4.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU., www. graphpad.com. En cada caso,
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
GSP inhiben la viabilidad e inducen la muerte de las células de cáncer de páncreas
El antiproliferativa. efectos de GSP en las líneas celulares de cáncer pancreático, MiaPaCa-2, PANC-1 y AsPC-1, se determinaron utilizando un ensayo MTT. Las células se trataron con diferentes concentraciones de GSP (0, 10, 20, 40 y 60 mg /ml) durante 24 y 48 h. Se observó una reducción dependiente de la dosis en la viabilidad de las células MIAPaCa-2 que varió de 2 a 35% (
P
& lt; 0,05) después de 24 h, y 20 a 60% (
P
& lt; 0,01) después de 48 h de tratamiento con GSP, como se muestra en la Figura 1A. En condiciones idénticas, no se observaron efectos similares de GSP en el tratamiento de células PANC-1 y AsPC-1 (Figura 1B y 1C, paneles de la izquierda), excepto que la reducción GSP-inducida de la viabilidad de las células ASPC-1 fue menor que el observado para las otras líneas celulares. También se determinó el efecto citotóxico de GSP en las líneas celulares de cáncer pancreático en términos de muerte celular usando el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. Como se muestra en la Figura 1A (paneles de la derecha), en comparación con los no GSP-trataron células de control, el tratamiento de MiaPaCa-2 células con GSP dado lugar a un aumento significativo y dependiente de la dosis en la muerte celular. El tratamiento durante 24 h dio como resultado un 5-28% (
P
& lt; 0,05) aumento de la muerte celular, mientras que el tratamiento durante 48 h dio lugar a 9-38% (
P
& lt; 0,05 -0.001) la muerte celular. Utilizando condiciones idénticas, no se observaron efectos citotóxicos similares sobre el tratamiento de las células PANC-1 y AsPC-1 con GSP (Figura 1B y 1C, paneles de la derecha).
MiaPaCa-2 células (A), (B) PANC -1 células, y las células AsPC-1 (C) se trataron con las concentraciones indicadas de GSP para los períodos de tiempo indicados. paneles de la izquierda: se determinó la viabilidad de las células usando el ensayo MTT como se describe en los Materiales y Métodos. Los datos se expresan en términos de porcentaje de células de control (no-GSP tratados) como la media ± SD de 8 repeticiones. paneles de la derecha: El efecto citotóxico de los GSP en las células de cáncer de páncreas se determinó usando el ensayo de exclusión del colorante azul tripán como se describe en Materiales y métodos. Los datos de muerte celular se presentan como el porcentaje medio de células muertas de tres experimentos ± SD
vs.
Grupo de control (no tratados GSP-). Diferencia significativa
vs
grupo de control,
*
P
. & lt; 0,001;
**
P
. & Lt; 0,05
GSP inducen G2-M detención del ciclo celular en fase de células de cáncer de páncreas
La interrupción de la por células normales la progresión del ciclo y la división son eventos importantes en el desarrollo del cáncer. Para determinar los posibles mecanismos de los efectos antiproliferativos de los GSP, se llevó a cabo el análisis del ciclo celular utilizando líneas MiaPaCa-2 y PANC-1 de células tratadas con 20, 40 o 60 mg /ml de GSP. Como se muestra en la figura 2A, después de un tratamiento de 2-MiaPaCa células con GSP para 48 h había significativamente mayor número de células en la fase G2-M a todas las concentraciones utilizadas: 20 mg /ml (15,5%,
P
& lt; 0,05), 40 mg /ml (23,9%,
P
& lt; 0,01) y 60 mg /ml (29,4%,
P
& lt; 0,001) en comparación con el los no tratados GSP-controles (5,9%). Al 24 h punto de tiempo, el efecto de GSP en G2 detención del ciclo celular /M fue significativamente menor que el observado después del tratamiento de 48 h. Efectos similares de GSP en detención en la fase G2 /M se encontraron usando la línea de células PANC-1 (Figura 2B). Se determinó el efecto de la siguiente GSP en las proteínas reguladoras del ciclo celular que participan en la fase G2 /M de la progresión del ciclo celular. Los resultados de transferencia Western revelaron que el tratamiento de células MIAPaCa-2 y Panc-1 con concentraciones variables de GSP durante 48 h dio lugar a una disminución dependiente de la dosis en la expresión de ciclina B1, así como una reducción en los niveles de expresión de CDC25B y Cdc25C proteínas que regulan la fase G2 /M del ciclo celular (Figura 2C).
MiaPaCa-2 y PANC-1 en las células se trataron con vehículo (0,1% DMSO) o GSP (20, 40 y 60 g /ml) en medio completo. Después de 48 h de tratamiento, se recogieron las células y se digirieron con ARNasa. El ADN celular se tiñó con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo se realizó para analizar la distribución del ciclo celular, como se detalla en los Materiales y Métodos. Se muestran los histogramas del ciclo celular representativos de dos experimentos independientes en MiaPaCa-2 (A) y PANC-1 (B) las células después del tratamiento con diferentes dosis de GSP. (C) Efecto de los GSP en G2 /ciclo celular fase de proteínas reguladoras M en células PANC-1 MiaPaCa-2 y. Las células se trataron con vehículo o GSP (20, 40, 60 mg /ml en DMSO) durante 48 h y a partir de entonces cosechada, lisados de células preparados y después se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de Western blot para diversas proteínas. β-actina se utilizó para verificar la igualdad de carga de las muestras. Se muestran manchas representativos de tres experimentos individuales.
GSP inducen la apoptosis de las células del cáncer pancreático
Para examinar si la reducción de la viabilidad celular y la inducción de G2 /M fase de la detención en pancreática humana las células cancerosas mediante tratamiento GSP estaba relacionado con la inducción de la apoptosis, las células MIAPaCa-2 y PANC-1 se trataron con concentraciones variables de GSP y el porcentaje de células apoptóticas fueron evaluados usando el kit de detección apoptótica Alexa488. la muerte celular por apoptosis se determinó en términos de células apoptóticas temprana o la última etapa, que se muestran, respectivamente, en la parte inferior derecha (LR) y los cuadrantes superior derecho (UR) de la histogramas FACS (Figura 3A). El tratamiento de los MiaPaCa-2 y PANC-1 células con GSP durante 48 h dio lugar a una inducción significativa de la apoptosis en ambas líneas celulares. Los porcentajes de células apoptóticas totales (en cuadrantes UR + LR) en MiaPaCa-2 células después de los tratamientos GSP fueron como sigue: 5,2% (control tratado con vehículo), 16,6% (20 mg /ml,
P & lt
; 0,05), 25,9% (40 mg /ml,
P Hotel & lt; 0,01), y el 35,8% (60 mg /ml,
P Hotel & lt; 0,001), tal como se resume en el Panel B se observó. similares GSP-inducción de la apoptosis cuando las células PANC-1 se trataron con GSP durante 48 h, como se muestra en la Figura 3A y 3B
.
células (a) MiaPaCa-2 y Panc-1 se trataron con diferentes concentraciones de GSP (0, 20, 40 y 60 mg /ml) en medio completo durante 48 h, después se recogieron para el análisis de células apoptóticas mediante análisis FACS utilizando el Annexin V-Alexa Fluor488 apoptosis Vybrant Assay Kit (Alexa488) después de la protocolo del fabricante. La parte inferior derecha (LR) cuadrante de los histogramas de FACS indica el porcentaje de células apoptóticas tempranas (células teñidas con Alexa488) y el cuadrante superior derecho (UR) indica el porcentaje de células apoptóticas tardías (células de yoduro de propidio manchados + Alexa488). (B) Los porcentajes totales de células apoptóticas en cada grupo de tratamiento después de 48 h se resumen con los datos presentados como la media ± DE de dos experimentos. Diferencia significativa
vs
grupo de control (no tratados GSP-), *
P
. & lt; 0,001; **
P Hotel & lt; 0,05. (C) Tratamiento de MiaPaCa-2 y células con concentraciones variables de GSP durante 48 h resulta en una reducción dependiente de la dosis en los niveles de expresión de las proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 y Bcl-XL), mientras que el aumento de la 1 PANC- la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax. GSP también aumentan el nivel de activación de la caspasa-3 en las células.
Efecto de GSP en las proteínas de la familia Bcl-2 en células de cáncer de páncreas
Los miembros de la familia Bcl-2 de las proteínas juegan un papel crucial en la regulación de la apoptosis por funcionar como promotores o inhibidores de la muerte celular [26] - [28]. El análisis de transferencia Western reveló que el tratamiento de células MIAPaCa-2 con GSP (20, 40, 60 mg /ml) durante 48 h dio como resultado una reducción dependiente de la dosis en Bcl-2 y Bcl-xl expresión de la proteína (Figura 3C) mientras que la expresión de Bax fue notablemente hasta reguladas con concentraciones crecientes de GSP (Figura 3C). También se encontró efecto similar de GSP en las proteínas de la familia Bcl-2 cuando las células PANC-1 se trataron con GSP para 48 h. Como caspasa escindido 3 se considera que es una característica de la apoptosis, también se determinó el efecto de GSP en la caspasa-3 escinde en estas muestras y confirmó que el GSP aumentaron la activación o la escisión de la caspasa-3 en tanto MiaPaCa-2 y PANC -1 células (Figura 3C).
GSP inhiben PI3K /Akt expresión en células de cáncer
a medida que la PI3K /Akt vía de señalización juega un papel crítico en la supervivencia de células de cáncer y el desarrollo de cánceres, que examinado los efectos de GSP en esta vía de supervivencia celular. células MIAPaCa-2 y PANC-1 se trataron con GSP durante 48 h, los lisados celulares preparados y los niveles de PI3K y la fosforilación de Akt en Ser
473 determinados por análisis de transferencia Western. Los resultados revelaron que el tratamiento de estas líneas celulares con GSP durante 48 h disminuyó los niveles de tanto el regulador (p85) y (P110) subunidades catalíticas de PI3K y también redujo la fosforilación de Akt en Ser
473 en un dependiente de la concentración manera (Figura 4A). Como es bien sabido que la actividad de Akt está generalmente regulado por PI3K activada, se verificó además que Akt está regulada por PI3K en células de cáncer pancreático. Para este propósito, hemos derribado PI3K en células PANC-1 MiaPaCa-2 y utilizando el kit de PI3K siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) siguiendo el protocolo del fabricante. Como se muestra en la Figura 4B, el análisis de transferencia Western reveló que siRNA desmontables de PI3K resultó en reducción marcada en los niveles de p-Akt en células tanto MiaPaCa-2 y PANC-1. Sin embargo, el efecto sobre la expresión de Akt total que no se observó en estas líneas celulares en siRNA desmontables de PI3K. Desmontables de proteínas PI3K también se verificó utilizando el Western Blot.
(A) Tratamiento de MiaPaCa-2 y PANC-1 células con GSP disminuye el nivel de expresión de PI3Kp85 (reguladora) y PI3Kp110 (catalítico), y la fosforilación de Akt en una forma dependiente de la dosis. Después del tratamiento durante 48 h, se recogieron las células, y los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western para determinar la expresión de diferentes proteínas. β-actina se utilizó para verificar la igualdad de carga de las muestras de proteína. (B) siRNA desmontables de PI3K en células del cáncer pancreático como resultado una reducción de los niveles de P-Akt en comparación con el grupo control de siRNA.
GSP dietéticos inhiben el crecimiento de xenoinjertos de tumores pancreáticos en ratones desnudos atímicos
a medida que estos
in vitro
estudios indicaron que el tratamiento de células de cáncer de páncreas con GSP reduce la viabilidad e induce la apoptosis de estas células, hemos tratado de determinar si la administración de la dieta inhibe GSP
in vivo
crecimiento del tumor usando un modelo de xenoinjerto de ratón. A medida que el efecto terapéutico de los GSP sobre líneas de células PANC-1 MiaPaCa-2 y eran idénticos, se seleccionó la línea celular MiaPaCa-2 para estos
in vivo
estudios. En estudios previos se ha encontrado también que los GSP la dieta a la dosis de 0,5% de crecimiento importantes efectos inhibitorios sobre los tumores inducidos [9], [29], se seleccionaron esta dosis de GSP para más
in vivo
estudio. Los ratones recibieron la dieta de control AIN76A solo o la misma dieta suplementada con GSP (0,5%, w /w). El peso medio del cuerpo de los ratones tratados con GSP y no tratados con GSP fueron comparables durante todo el período experimental (datos no mostrados). De manera similar, los ratones que recibieron GSP en su dieta no mostraron ningún signo físico de toxicidad o comportamiento anormal (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la administración de GSP en la dieta a la concentración utilizada en estos estudios no se asocia con toxicidad bruto aparente.
medición semanal del volumen del tumor indicó que el crecimiento medio del tumor en términos de volumen total del tumor /ratón fue mayor en los ratones tratados con los no-GSP GSP que los grupos tratados. Como se muestra en la Figura 5A, en los ratones que recibieron GSP a la dosis de 0,5% en su dieta, el volumen del tumor a la terminación del experimento fue de 64% (
P
& lt; 0,005) menos. El experimento se terminó en la 11
ª semana después de la implantación de las células tumorales. En este momento se sacrificaron los ratones, los tumores se recogieron y el peso húmedo del tumor /ratón en cada grupo de tratamiento se registró. Como se muestra en la Figura 5A (panel derecho), el peso en húmedo de los tumores fue 68% más baja (
P
& lt; 0,005) en ratones administrados 0,5% GSP en la dieta en comparación con los tumores de no-GSP los ratones tratados con
.
(A) la administración dietética de GSP (0,5%, w /w) inhibe el crecimiento de MiaPaCa-2 células cultivadas como xenoinjertos en ratones desnudos atímicos. El volumen medio del tumor ± SD /ratón (mm3) en cada grupo de tratamiento se midió en base semanal. tejidos xenoinjerto de tumor se recogieron a la terminación del experimento a las 11 semanas y el peso húmedo del tumor /ratón en cada grupo se informa en gramos como la media ± SD. La significación estadística de la diferencia entre el control y los grupos tratados con GSP fue analizada por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni
t
prueba, n = 8. La significación estadística
vs
de tumores no GSPs- los ratones de control tratados, *
P Hotel & lt; 0,005. (B) La detección inmunohistoquímica de células TUNEL positivas en los tejidos de xenoinjerto de tumor de ratones GSP en la dieta y los ratones no se muestran GSP receptoras, y los datos resultantes se administra en las células TUNEL positivas se resumen. (C) Detección inmunohistoquímica de las células de la caspasa-3-positivos activados en los tejidos de xenoinjerto de tumor de los ratones tratados con GSP y no tratados con GSP. Los resultados de inmunohistoquímica en términos de porcentaje de células positivas se presentan como la media ± SD de 5-6 muestras de tumor de cada grupo. células TUNEL positivas o caspasa-3-positivas se contaron en cuatro a cinco campos diferentes, y los datos se resumen en términos de porcentaje de células positivas a partir de muestras de xenoinjerto de tumor 5-6. se muestran micrografías representativas. (D) GSP dietéticos inhiben la expresión de proteínas anti-apoptóticas, mientras que el aumento de la expresión de la proteína pro-apoptótica, Bax, y los niveles de caspasas-3 activados en los tejidos de xenoinjerto de tumor. lisados tumorales se preparan a partir de los xenoinjertos de tumores recogidos en la terminación del experimento descrito en la Figura 5A y se sometieron a análisis de transferencia Western, como se describe en Materiales y métodos. borrones representativos se muestran a partir de experimentos independientes de al menos cinco tumores de cinco ratones por grupo diferente con las observaciones idénticas.
GSP dietéticas aumentan la muerte celular por apoptosis de las células tumorales pancreáticas en xenoinjertos
Para determinar si la inhibición del crecimiento del tumor por GSP dietética es causado por la muerte de células tumorales en los tejidos de xenoinjerto, se evaluó el efecto de GSP en el índice apoptótico de células tumorales en muestras de xenoinjerto utilizando un ensayo de TUNEL.