Extracto
Vezatin (VEZT), una proteína transmembrana uniones adherentes, fue identificado como un supresor tumoral putativo en nuestro estudio anterior. Sin embargo, el papel de VEZT en la tumorigénesis sigue siendo difícil de alcanzar. El objetivo fue aclarar su regulación epigenética y funciones biológicas en el cáncer gástrico. En este estudio, mostramos que el nivel de expresión de VEZT está implicada en la metástasis linfática, la profundidad de la invasión del cáncer y el estadio TNM en 104 pacientes con cáncer gástrico. reacción en cadena de la polimerasa de secuenciación bisulfato (BSP) métodos mostraron que VEZT se hypermethylated en los tejidos y la sangre correspondiente de pacientes con cáncer gástrico en comparación con los controles sanos.
Helicobacter pylori gratis (
H. Pylori
) la infección induce la metilación y silenciamiento de VEZT en las células GES-1. La restauración de la expresión VEZT en células de cáncer gástrico MKN-45 y NCI-N87 inhibieron el crecimiento, la invasión y la tumorigénesis
in vitro e in vivo
. Se aplicó el análisis de microarrays mundial para analizar las bases moleculares de las funciones biológicas de VEZT después de la transfección VEZT combinado con PCR en tiempo real y análisis de inmunoprecipitación de la cromatina. G receptor acoplado a proteína 56 (GPR56), el crecimiento celular, el ciclo de división celular 42 (CDC42), la migración /invasión y factor de transcripción 19 (TCF19), la progresión del ciclo celular, fueron identificados como genes diana VEZT directa. TCF19, una nueva diana de VEZT, fue validado funcionalmente. La sobreexpresión de TCF19 en MKN-45 células aumentó el progreso del ciclo celular y su capacidad de crecimiento. Este estudio proporciona nuevos penetración en la regulación del gen VEZT, lo que podría representar un objetivo potencial para estrategias terapéuticas contra el cáncer
Visto:. Miao R, Guo X, Zhi Q, Y Shi, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, un supresor tumoral putativo novela, suprime el crecimiento y la tumorigenicidad de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10.1371 /journal.pone.0074409
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: Abril 1, 2013; Aceptado: August 1, 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Miao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional Juvenil de Ciencias de China, (81101858), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong de China (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Proyecto de Investigación llave de Shandong Comisión de Ciencia y Tecnología (2011GGB14158, 2007H2071), la Fundación Juvenil de Ciencias de la provincia de Shandong de China (BS2010YY060). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer varón y la tercera causa principal de muerte por cáncer femenino en todo el mundo [1]. Se trata de un importante problema de salud pública en todo el mundo [2]. En China, hay 400.000 nuevos casos de cáncer gástrico y 300.000 muertes al año. Muchos de los casos que sufrían de cáncer gástrico han perdido la oportunidad curativa con muy mal pronóstico [3]. Por lo tanto, el desarrollo de métodos terapéuticos novedosos y eficaces es esencial para reducir la mortalidad por cáncer gástrico. Se ha sabido que la patogénesis de los carcinomas gástricos es multifactorial, que incluye la predisposición genética y los factores ambientales. Hay un número de alternancias genéticos, incluyendo los genes supresores de tumores, oncogenes, moléculas de adhesión celular y factores de crecimiento [4].
Aunque los mecanismos moleculares de la carcinogénesis gástrica siguen sin estar claros, el silenciamiento epigenético de genes relacionados con el tumor por el promotor de la hipermetilación ha surgido recientemente como un importante mecanismo de la tumorigénesis. El perfil de la hipermetilación del promotor difiere en cada tipo de cáncer y dentro de cada gen, proporcionando de tipo tumor y los perfiles de hipermetilación de genes específicos que puede implicar en el mecanismo molecular correspondiente de la tumorigénesis. La identificación de un nuevo gen dirigido por el promotor de la hipermetilación puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos para la inactivación de las vías de tumor supresor y es importante para la identificación de marcadores tumorales en el cáncer gástrico [5,6].
Recientemente , hemos identificado, una proteína transmembrana de uniones adherentes, VEZT como un gen supresor de tumores candidato. El objetivo de aclarar la regulación epigenética y funciones biológicas de VEZT en el cáncer gástrico. VEZT, una proteína integral en todas partes, se asocia indirectamente con el complejo de E-cadherina-catenina y citoesqueleto de actina [7,8]. Sus funciones principalmente se han explorado en las células epiteliales. La pérdida de VEZT es progresivamente perjudicial para el desarrollo embrionario [9,10], y VEZT es fundamental para preservar la integridad de las uniones celulares durante el estrés mecánico a largo plazo que ocurren a nivel de las células ciliadas del oído interno en respuesta al sonido. Por otra parte, la invalidación VEZT condicional del oído interno específico conduce a la sordera progresiva [7]. VEZT es altamente expresado en el cerebro [8,11]. VEZT se enriquece en las espinas dendríticas en las neuronas del hipocampo del ratón. Usando VEZT knock-down y knockout condicional antes (D6cre) o después (CamKIIαcre) nacimiento, VEZT regula la morfología de la columna vertebral. Los cambios morfológicos no están asociados con los contactos sinápticos comprometidos, pero VEZT postsináptica juega un papel crítico en la maduración morfo-funcional de elementos excitatorios postsinápticos [12].
La inactivación del gen VEZT ha sido identificado en el cáncer gástrico, y la metilación de islas CpG dentro de la región promotora del gen VEZT contribuyen a su inactivación como se determina por un estudio previo realizado por nuestro laboratorio [13]. El mecanismo de la metilación y la función exacta de VEZT en el desarrollo de cáncer gástrico son actualmente desconocidos. aún no se han identificado los genes diana y relacionados con las vías de VEZT. En este estudio, se analizaron sistemáticamente el mecanismo de la metilación y la metilación del estado del promotor del gen VEZT. También se analizaron sus características funcionales después de la reconstitución de expresión VEZT
in vitro e in vivo
.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y muestras de tejidos
MKN -45, MKN-28, SGC-7901, la línea de células de la mucosa gástrica humana inmortalizada GES-1 (proporcionado por el instituto de la cirugía digestiva del Hospital Ruijin afiliado a la Universidad Shanghai Jiao Tong) [13,14,15,16,17] y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron preservados en nuestro instituto. líneas celulares de cáncer gástrico células SNU-1 y NCI-N87 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Brevemente, las células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10% y 2 mM L-glutamina. Las células se mantuvieron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2.
tumor gástrico primario y tejidos de la mucosa gástrica normal se obtuvieron de la cirugía, ya sea terapéutica de rutina o de endoscopia digestiva en nuestro departamento. El resto fue
H. Se determinó pylori
estado de infección en base a la prueba rápida de ureasa como se describe anteriormente [18].
Declaración de Ética
escrito el consentimiento informado en el estudio se obtuvo de todos los participantes. 4 semanas de edad, macho BALB /c ratones desnudos fueron adquiridos desde el Centro de Experimentación Animal de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) y se mantuvieron en el Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Provincial afiliado a la Universidad de Shandong (Jinan, China) en una 12/12 h ciclo luz /oscuridad (luces apagadas a las 19: 00) con comida y agua ad libitum disponible. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Provincial Hospital Afiliado a la Universidad de Shandong (Número de Permiso: SHANS87492). El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Provincial afiliado a la Universidad de Shandong.
Tratamiento de microdisección por láser para tejidos y células
Los tejidos fueron retirados tan pronto como sea posible después de la resección y se fijaron en formalina, embebido en parafina, y cortados en secciones de 8 micras de espesor para hematoxilina y eosina (H & amp; e) tinción. Todos los tejidos se examinaron histológicamente, y patólogos experimentados confirmaron los diagnósticos. Una parte de cada muestra se incrusta en Tissue-Tek
® óptimo de corte Temperatura ™ (OCT) Medio de compuesto (VWR Scientific Products, San Diego, CA, EE.UU.) en un criostato y encaje congelada para microdisección.
Las células y las diapositivas se tiñeron secciones congeladas justo antes de microdisección de captura por láser (LCM) en hielo. Brevemente, las secciones fueron láser microdissected usando un sistema de LM200 (Olympus, Japón /Arcturus Engineering Inc, EE.UU.). Las áreas de interés fueron seleccionados bajo la guía microscópica, y se cubren con termoplástico de etileno vinil película (EVA) montado en la tapa ópticamente transparente. El láser infrarrojo se activó mediante la pulsación de un botón, que se funde la película directamente sobre las células diana. Esta fusión causó una unión para formar entre las células y la película de transferencia que era más fuerte que la unión entre las células y las diapositivas. Los parámetros utilizados para LCM incluyen un diámetro de láser de 7,5 m, la potencia del láser de 50 a 60 mW. Cinco mil descargas de impulsos de láser por espécimen se utilizaron para "capturar" aproximadamente 10 000 morfológicamente células de cada caso. Cada población se estimó en & gt; 95% "homogéneo" como se determina por visualización microscópica de las células capturadas. Las tapas con células capturadas se ajustan entonces en tubos de 0,5 mL microcentrifage. Después de microdisección, el ADN, ARN, o proteínas se pueden extraer a partir de alícuotas de muestras microdissected.
El análisis de metilación
ADN genómico obtenido de las líneas de células microdissected, tejidos de cáncer gástrico y el plasma (0,2 ml ) se purificó usando DNAzol (Invitrogen). El ADN purificado se trató con bisulfito de sodio (Sigma, Phoenix, EE.UU.) y después se analizó por BSP o reacción en cadena de la polimerasa específica (MSP) como se describe anteriormente [13,15]. Los productos de PCR amplificados de bisulfito se subclonaron en un sistema de vector TA (Promega) según las instrucciones del fabricante. La secuenciación del ADN se realizó en tres clones individuales (Sangong). Los productos de PCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron usando tinción con bromuro de etidio. Los cebadores utilizados se resumen en la Tabla S1.
Electron observación microscópica
H. pylori cepas
NCTC11637 (ambos de cagA y VacApositive) fueron proporcionados por el profesor Guo del Departamento de Microbiología Médica y Parasitología, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Shanghai Jiao Tong, Escuela de Medicina.
H. pylori
cepas se cultivaron de manera rutinaria durante 72 h en base de agar Columbia (bioMérieux, Francia) con sangre de carnero al 5% en aire mezclado con 10% de CO
2, 5% de O2 y 85% de N
2 en 37 ° C. A continuación, convertimos
H. pylori
a medio líquido que contiene la infusión de cerebro y corazón (BD, EE.UU.), de sangre de oveja al 10%, y los mismos antibióticos como los utilizados en base de agar Columbia. El medio líquido se agitó en un agitador (Forma Scientific, EE.UU.) con una velocidad de rotación constante de 120 rpm.
H. pylori
se contaron usando un espectrofotómetro (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japón) y se lavó con PBS estéril (pH 7,4, 5.000 rpm, 10 min) antes de su uso. GES-1 células (4 × 10
5) se cultivaron hasta la confluencia en cubreobjetos de vidrio en placas de seis pocillos, y luego las células GES-1 fueron infectados con
H. pylori
a una multiplicidad de infección (MOI) de 100: 1. Después de la incubación durante 24 h, los cambios morfológicos de las células GES-1 se observaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión H-800.
tiempo real QRT-PCR análisis
se obtuvo ARN total purificado de las células microdissected, el ARN total fue extraído por medio de Trizol solución. La transcripción inversa (RT) se realizó en una reacción de 20-l de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Qiagen). Análisis en tiempo real QRT-PCR se realizaron usando primers que figuran en la Tabla S1. los niveles de transcripción de expresión se determinaron mediante la cuantificación de la intensidad del producto de PCR normalizada a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa expresión (GAPDH). La medición cuantitativa de los niveles de mRNA se realizó a través de ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Estos datos se analizaron utilizando el método comparativo Ct.
Western blotting
La proteína total se extrajo de las células microdissected. se utilizó la señal de extracción de proteínas tampón 1 sistema (430-7.608-MSDS) de Bio-Rad Corporación para la extracción de proteínas en nuestros experimentos y la concentración se midió por el método de la proteína-ensayo DC de Bradford (Bio-Rad). Un total de 100 g de proteína de cada muestra fueron separados por 10% de gel de SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno equilibrada (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , EE.UU.) después de la incubación con el anticuerpo primario específico VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), y Irx5 (1: 2000) a 4 ° C durante la noche y luego el anticuerpo secundario. Los niveles de proteína se normalizaron a GAPDH total usando un anticuerpo monoclonal anti-GAPDH (Sigma) como se describe anteriormente [15].
Construcción de vector de expresión para VEZT y TCF19
VEZT y TCF19 sobreexpresión vector pEGFP N1-VEZT y pEGFP-N1-TCF19 se construyeron utilizando la PCR o PCR método de superposición, respectivamente, y los cebadores usados para dos vectores se resumen en la Tabla S1. Los productos de PCR se confirmaron por secuenciación directa de ADN y se clonaron en el vector de mamífero expresión pEGFP-N1 como se describe anteriormente [15]. líneas celulares de cáncer gástrico MKN-45 y NCI-N87 fueron utilizados para los estudios de sobreexpresión. Se obtuvieron clones transfectadas de forma estable por selección con G418 (Promega). Un transfectante estable del vector vacío pEGFP-N1 se utilizó como control. Para la transfección, complejos de Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, EE.UU.) y uno de los plásmidos mencionados anteriormente se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y estos complejos se mezclaron directamente con las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 4 x 10
4 células por pocillo. El nivel de VEZT o expresión TCF19 después de la transfección se analizó mediante PCR en tiempo real.
La invasión, la migración y ensayos de formación de tubo endotelial
invasión celular, la migración y ensayos de formación de tubo endotelial se realizaron con MKN -45 células y NCI-N87. Cultivo de células se realizó en cámaras Transwell (Corning, NY, EE.UU.). Para el ensayo de invasión, las membranas de inserción fueron recubiertas con Matrigel diluido (San Jose, CA, EE.UU.). Las células (1 × 10
5) se añadieron a la cámara superior y se cultivaron durante 48 h. Para el ensayo de migración, las membranas de inserción no se revistieron con Matrigel, pero se cultivaron en las mismas condiciones. Por último, se cortaron las membranas de inserción y se tiñeron con cristal violeta (0,04% en agua; 100 ml), y se contaron las células migradas en un microscopio invertido y se fotografiaron
angiogénesis in vitro se evaluó mediante el uso de una. kit de ensayo de formación de tubo endotelial (San Diego, CA, EE.UU.). Brevemente, cada pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos preenfriados se revistió con una capa fina de gel de ECM. HUVECs se resuspendieron en sobrenadantes recogidos de células transfectadas. HUVECs (2 × 10
4 células /pocillo) se añadieron al gel ECM polimerizado con 300 ml de los sobrenadantes. Después de 18 h de incubación, la capacidad de formación del tubo se evaluó determinando el número tubular, la longitud tubular y el número de nodos de intersección tubulares en cinco campos aleatorios utilizando Image Pro Plus software (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, EE.UU.) de acuerdo el método de Mirshahi [19].
crecimiento celular y la formación de colonias en agar blando ensayo
células de cáncer gástrico (2 × 10
3) las células se incubaron con 100 l de medio de cultivo en el 96 -multiwell placas durante un día a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células fueron transfectadas con el plásmido de 24, 48, 72, 96, y 120 horas. El número de células se evaluó mediante el recuento de células kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japón). Brevemente, se añadió CCK-8 (10 l) a cada pocillo. Después de 1 h de incubación a 37 °, la absorbancia a 450 nm se midió usando el lector de placas ARVO MX (PerkinElmer, Massachusetts, EE.UU.). El número de células se determinó por la absorbancia relativa a 450 nm.
células de cáncer gástrico se tripsinizaron a una sola célula suspensiones de 3 x 10
3 células y luego se sembraron en placas de seis pocillos en completa medio de cultivo que contiene 0,3% de agar en capas en la parte superior de 0,6% de agar. Las placas se incubaron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 durante 16 días. se puntuaron las colonias que contienen al menos 50 células. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de cinco campos marcados al azar.
El crecimiento del tumor en ratones desnudos
Las células (1 × 10
6 células en 100 ml) de células cancerosas líneas transfectadas con el vector vacío o un vector de expresión VEZT se recogieron y se inocularon por vía subcutánea en las regiones flanco derecho de 4 semanas de edad, macho BALB /c ratones desnudos (Academia de Ciencias de china, Shanghai, china). nódulos tumorales se midieron cada 4 días con calibradores. Los ratones se sacrificaron después de 1 mes. Se calcularon las curvas de crecimiento del tumor y las tasas de inhibición del crecimiento. Dos ratones fueron utilizados para los grupos experimentales y de control, y se llevaron a cabo tres experimentos independientes como se describe anteriormente [15,16].
Global cDNA microarray análisis y verificación gen diana
ARN total fue purificado obtenido a partir de las células microdissected. Se utilizó todo el genoma de microarrays oligo humana (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.). Después de la hibridación y el lavado, los microarrays diapositivas fueron escaneados con un escáner de microarrays de ADN Agilent. Los archivos de texto que resultan extraídos de Agilent extracción de características de software (versión 9.5.3) se importaron en el software Agilent GeneSpring GX (versión 7.3) para su posterior análisis. Genes expresados diferencialmente fueron identificados mediante el cribado factor de cambio. Para la verificación del gen diana se utilizó PCR en tiempo real y análisis de inmunoprecipitación de la cromatina. Los cebadores para los genes diana se enumeran en la Tabla S1.
análisis de citometría de flujo de ciclo celular
Un día antes de la transfección, 1 × 10
se sembraron 6 células de MKN 45 células en placas de cultivo de 6 pocillos sin antibióticos. Las células fueron transfectadas con el vector vacío o un vector de expresión TCF19. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células y se fijaron en 70% de etanol a -20 ° C durante la noche, y luego se tiñeron con 250 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich), 5 mg /ml de RNasa A (Sigma-Aldrich) y 5 mmol /L EDTA en PBS (pH 7,4) durante 30 min. El análisis del ciclo celular se realizó por FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EE.UU.).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS15.0 (SPSS Inc, EE.UU.). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos separados. La correlación entre la expresión VEZT en los tumores y las variables clínico-patológicas se calculó con la prueba de rangos de Kruskal-Wallis y la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante la prueba t y prueba de Chi-cuadrado del Estudiante. Un valor de
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Relación de los niveles de expresión VEZT y los factores clínico-patológicos en pacientes con cáncer gástrico
Hemos investigado la relación entre los niveles de expresión en VEZT 104 gástrica emparejado cáncer de los tejidos y los factores clinicopatológicos en pacientes con cáncer gástrico. Se encontró que el nivel de expresión de VEZT se asoció significativamente con la metástasis linfática, la profundidad de la invasión del cáncer y el estadio TNM (Tabla 1,
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, los niveles de expresión VEZT no se asociaron con el género, la edad, el tamaño del tumor, la diferenciación celular, aspecto macroscópico, el sitio del tumor y la metástasis a distancia.
Factores
No. de los pacientes
La media de expresión de VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor tamaño & lt; 5cm5117.16 ± ± 3.052.682≥5cm5311.26 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site de tumorCardia2119 0,34 ± ± 2.530.692Body3611.24 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth de invasionT22518.35 cáncer ± 7.820.041 * T36322.12 ± 5,41 ± 4.21T41624.78 distal metastasisPositive249.34 ± ± 6.091.032Negative8012.35 8.62TNM#StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Relación entre los niveles de expresión en tejidos de cáncer VEZT y clinicopatológica factores en pacientes con cáncer gástrico.
Se analizó la relación entre los niveles de expresión VEZT en tejidos de cáncer y los factores clínico-patológicos en las muestras de cáncer gástrico en comparación con el tejido normal adyacente (n = 104). Se encontró que el nivel de expresión de VEZT se asoció significativamente con la metástasis linfática, la profundidad de la invasión del cáncer y el estadio TNM (Tabla 1,
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, los niveles de expresión VEZT no se asociaron con el género, la edad, el tamaño del tumor, la diferenciación celular, aspecto macroscópico, el sitio del tumor y la metástasis a distancia #:. TNM, tumor-nódulo-metástasis; *
p Hotel & lt; 0.05. Descargar CSV CSV
El análisis de metilación de los tejidos normales gástricas, cáncer gástrico tejidos primarios y sangre periférica de pacientes con carcinoma gástrico y controles sanos
A partir de un estudio previo de nuestro laboratorio, que postula que la metilación del promotor VEZT fue diferente en pacientes con carcinoma gástrico y controles sanos; se utilizó software de bioinformática en línea para analizar el estado de la región promotora y la metilación del gen VEZT (Figura 1A). Se examinó el nivel de metilación del promotor VEZT en 30 muestras de tejido de ADN de pacientes con cáncer de los tejidos gástricos primarios, el ADN de plasma y el control usando métodos BSP, que cubría las regiones de -171bp a -428bp (Figura 1A) correspondiente. Los niveles medios de metilado VEZT en 30 tejidos de cáncer gástrico primario y 30 tejidos gástricos normales fueron 67,78 ± 25,90% y 42,42 ± 30,30%, respectivamente (Figura 1B). cáncer de los tejidos gástricos primarios mostraron mayores niveles de metilación en la región promotora VEZT en comparación con los tejidos normales gástricas (Figura S1A, la Figura 1B, P & lt; 0,05). El nivel metilado media de ADN en plasma en pacientes con cáncer gástrico primario y casos de control sanos fueron 69,00 ± 23,90% y 46,71 ± 26,31%, respectivamente (Figura 1C). El nivel de ADN metilado en plasma en pacientes con cáncer gástrico primario mostró niveles de metilación más altos en la región promotora VEZT si se compara con el caso de controles sanos (Figura S1 B, Figura 1C, P & lt; 0,05). Por lo tanto, se observó metilación significativa en el grupo de cáncer gástrico en comparación con controles sanos. El nivel de VEZT metilado en los tejidos y el plasma podría servir como un marcador molecular para el cáncer gástrico.
(A) bioinformática línea software se utilizó para analizar la región promotora y el estado de metilación del gen VEZT. estado (B) La metilación de 34 sitios CpG del promotor VEZT de 30 tejidos normales gástricas y 30 tejidos de cáncer gástrico primario. tejidos tumorales primarias mostraron altos niveles de metilación de la región promotora VEZT en comparación con los tejidos normales gástricas. estado (C) La metilación de 34 sitios CpG del promotor VEZT a partir de ADN de plasma de sangre periférica de 30 pacientes de carcinoma gástrico y 30 controles sanos. La sangre periférica de pacientes de carcinoma gástrico mostró niveles de metilación más altos en VEZT región del promotor, en comparación con los controles sanos. Cada fila de círculos representa una relación de metilación integrada a partir de tres clones, y cada círculo representa un único sitio CpG. círculo abierto representa citosina no metilada, mientras que los círculos llenos o parcialmente llenos círculos representan la proporción de sitios CpG metilados.
H. pylori
infección induce la metilación y silenciamiento de VEZT
demostrando
Un número considerable de estudios han sido publicados que
H. pylori
infección es un factor de riesgo independiente para la metilación [20,21,22]. Por lo tanto, suponemos que
H. pylori provoca
VEZT metilación y, posteriormente, la carcinogénesis. En un primer momento, se analizó el nivel de metilación del promotor VEZT en el ADN de 23 muestras de tejido de pacientes con
H. pylori
gastritis crónica -positivo y los controles usando métodos BSP y MSP, que cubre las regiones de -171bp a -428bp y -342 pb a -513 pb, respectivamente (Figura 1A). Los niveles medios de metilación del promotor VEZT en
H. pylori
-positivo y el control fueron 75,74 ± 28,16% y 31,20 ± 25,67%, respectivamente. Por lo tanto, se observó una diferencia significativa en la metilación en el
H. pylori
grupo gastritis crónica -positivo en comparación con el grupo control (
P
& lt; 0,01, Figura 2A). La región promotora de VEZT fue metilado en general, en pacientes con gastritis crónica según el análisis de MSP (Tabla S2); Sin embargo, se encontraron cuatro casos de
H. pylori
gastritis crónica -positivo que eran relativamente no metilado. Hemos observado 19 casos de
H. pylori
la gastritis crónica que aparece -positivo hipermetilación (Tabla S2). Para determinar si
H. pylori
infección induce la metilación del promotor del gen VEZT
in vitro
, Hemos detectado que
H. pylori
la infección se asocia con la expresión de IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 y Irx5 proteína después de
H. pylori
infección y se incubaron durante 24 h en células GES-1 usando transferencia Western. Nuestros resultados mostraron
H. pylori
infección promovió la expresión de IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, proteína ATF3 y Irx5 y
H. pylori
la infección tuvo éxito en GES-1 células (Figura 2B, 2C). Para confirmar aún más que los que
H. pylori
la infección es de hecho responsable de la metilación o el silenciamiento de VEZT, se analizó el estado de metilación de VEZT en las células GES-1 por MSP y BSP. Como se muestra en la Figura 2D y 2E, el promotor de hipermetilación VEZT era en
H. Se observó pylori
GES-1 infectadas con células, pero no metilación en las células no infectadas con el
H. pylori gratis (Figura 2D y E). El nivel de expresión de la proteína de VEZT también fue menor en
H. pylori
células infectadas que en las células no infectadas con el
H. pylori gratis (Figura 2C).
(A)
H. pylori
pacientes con gastritis -positivos mostraron altos niveles de metilación de la región promotora VEZT en comparación con
H. pylori
pacientes negativos al gastritis. Cada fila de círculos representa una relación de metilación integrada a partir de tres clones, y cada círculo representa un único sitio CpG. círculo abierto representa citosina no metilada, mientras que círculos rellenos o círculos parcialmente llenos representan la proporción de sitios CpG metilados. (B) Después de la infección de 24 h con
H. pylori
, la unión de
H. pylori
se observó por microscopía electrónica de transmisión en la superficie de GES-1 en las células en las células experimentales relativos a las células de control. (C) VEZT nivel de expresión en células GES-1 se redujo después de 24 h
H. pylori
infección respecto a las células de control negativo; Sin embargo,
H. pylori
infección induce la IL-6, AKT, TNF-α, IL-8, ATF3 y expresión Irx5 por análisis de transferencia Western. (D) La metilación del promotor VEZT fue detectado por MSP después de un 24-h
H. pylori
infección en células GES-1 (marcado como M), mientras que la metilación del promotor en las células VEZT GES-1 que no fueron infectadas con
H. pylori
no se observó (marcado como T). (E) resumen esquemático de 34 sitios CpG en la región promotora del gen VEZT de -171 a -428 por análisis BSP. GES-1 en las células mostraron un mayor nivel de metilación después de
H. pylori
infección con respecto a las muestras de control. La barra representa 5000 nm.
Análisis funcional después de restaurar la expresión in vitro VEZT
El silenciamiento frecuente o regulación a la baja de VEZT en líneas celulares de cáncer gástrico sugiere que es probable que un supresor de tumores gen en nuestro estudio anterior. Para probar este punto, que exhibió expresión VEZT en varias líneas celulares de cáncer gástrico por PCR en tiempo real y Western blot. Diferentes niveles de expresión VEZT se encontraron en las seis líneas celulares analizadas (Figura 3A). Se construyó un vector de expresión pEGFP-N1-VEZT y transfectadas pEGFP-N1 vector en la línea celular de cáncer gástrico MKN-45 y NCI-N87, que no mostró o bajo nivel de expresión VEZT. Después de la transfección, se analizó la expresión de VEZT en estas líneas celulares mediante PCR en tiempo real, lo que demuestra que el nivel de expresión del transcrito de VEZT fue reglamentado hasta 41.99 veces (Figura 3B, P & lt; 0,01) en estas líneas celulares en comparación con con las células de control transfectadas. También se examinó la capacidad de las células de cáncer gástrico que sobreexpresan VEZT para invadir y migrar por la invasión transwell y ensayos de migración (Figura 3C). La capacidad invasiva de MKN-45 células en el grupo VEZT /N1 se redujo significativamente en comparación con las células de control transfectadas (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45,
P
& lt; 0,001). El número de MKN 45-células en la muestra transfectada-VEZT que migró a través del inserto transwell también se redujo significativamente en comparación con las células de control transfectadas (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42,
P
& lt; 0,001).
(A) Los diferentes niveles de expresión de VEZT en cinco líneas celulares de cáncer gástrico y una línea celular inmortalizada de la mucosa gástrica. (B) Expresión de VEZT se reguló en las células MKN-45 y NCI-N87 sobre VEZT vector de transfección en relación con N1-controles. (C) las capacidades de formación invasoras, migratorias y tubulares de las células MKN-45 y NCI-N87-transfectadas VEZT fueron suprimidos como se determina por el transwell y ensayos de formación de tubulares. (D) La sobreexpresión de VEZT conduce a la detención del crecimiento celular como se determina por el ensayo de CCK-8. las tasas de formación (E) de la colonia fueron significativamente diferentes entre las células transfectadas con VEZT y N1-controles en las células MKN-45 y NCI-N87. (F) La sobreexpresión de VEZT en las células MKN-45 y NCI-N87 inhibieron la tumorigénesis en ratones desnudos. nódulos tumorales resecados del grupo transfectadas-VEZT eran más pequeñas que las de N1-controles. curvas (G) de crecimiento del tumor para el grupo VEZT /N1 y N1-controles muestran un crecimiento rápido del tumor en los grupos MKN-45 o NCI-N87 /N1control. *
P Hotel & lt; 0.05. Cada barra representa el valor medio ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
HUVEC fueron suspendidas en sobrenadantes recogidos en el control y VEZT /N1. Después de 18 h de incubación, se recoge el sobrenadante de las células VEZT /N1 mostró un fuerte efecto inhibidor sobre la formación de estructuras tubulares por HUVECs con respecto al número, la longitud y la intersección de los nodos cuando se compara con el grupo control (Figura 3C). *
P Hotel & lt;