Extracto
Objetivo
Recientemente, Next Generation Sequencing (NGS) ha comenzado a suplantar a otras tecnologías para las pruebas de mutación genética que ahora se requiere para terapias dirigidas. Sin embargo, la transferencia de tecnología NGS a la práctica clínica diaria requiere validación.
Métodos
Hemos validado el panel de cáncer de pulmón Ion Torrent AmpliSeq colon e interrogando a 1850 puntos de acceso en 22 genes utilizando la máquina de Ion Torrent Personal Genome . En primer lugar, hemos utilizado las normas de referencia comercial que llevan mutaciones en las frecuencias alélicas definido (AF). A continuación, se analizaron retrospectivamente 51 adenocarcinomas colorrectales (CRC) y 39 carcinomas de pulmón no microcítico (CPNM) guía
Resultados
La sensibilidad y la precisión para la detección de variantes en una AF & gt;. 4% fue de 100 % de patrones de referencia comerciales. Entre los 90 casos, 89 (98,9%) se secuenciaron con éxito. Entre las 86 muestras para las que NGS y la prueba de referencia eran tanto informativa, 83 mostraron resultados concordantes entre NGS y la prueba de referencia; es decir,
KRAS
y
BRAF Opiniones de CRC y
EGFR Opiniones de NSCLC, con los 3 casos discordantes cada una caracterizada por un AF. & lt; 10%
conclusiones
en general, el panel de cáncer de colon /pulmón AmpliSeq era específico y sensible para el análisis de mutaciones de genes de los paneles y se puede incorporar en la práctica clínica diaria
Visto:. D'Haene N, Le Mercier M, De Neve N, Blanchard O, Delaunoy M, El Housni H, et al. (2015) Validación clínica de Targeted Next Generation Sequencing de colon y pulmón. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10.1371 /journal.pone.0138245
Editor: Aldo Scarpa, Universidad de Verona, Italia
Recibido: Marzo 4, 2015; Aceptado: 27 Agosto 2015; Publicado: 14 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 D'Haene et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del "Fonds Yvonne Boel" (Bruselas, Bélgica). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los recientes avances en la tecnología de secuenciación han permitido perfilado integral de las alteraciones genéticas en el cáncer [1]. El desarrollo de tratamientos inhibidores de la tirosina cinasa ha hecho que sea importante para poner a prueba los pacientes con cáncer de mutaciones de genes clínicamente significativos que influyen en el beneficio del tratamiento. La identificación de mutaciones asociadas con el cáncer se ha convertido en la atención estándar para el tratamiento del cáncer; ejemplos de tales incluyen
RAS
mutaciones en los carcinomas colorrectal metastásico o
EGFR
mutaciones en el cáncer de pulmón. Rutina
EGFR
pruebas de mutación somática se recomienda actualmente en Europa y Estados Unidos de los pequeños tumores no escamoso de pulmón no microcítico (CPNM) [2, 3]. Las nuevas directrices europeas por favorecer una amplia cobertura de los exones 18-21 [2]. Por otra parte, las nuevas directrices de la NCCN para NSCLC Apoya enérgicamente los perfiles moleculares más amplia, con el objetivo de identificar mutaciones del conductor raras que permiten medicamentos eficaces ya pueden estar disponibles, o para aconsejar a los pacientes adecuadamente con respecto a la disponibilidad de ensayos clínicos (guías de la NCCN http: //www.nccn .org /profesionales /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Hasta hace poco, las indicaciones para las pruebas moleculares estándar de atención en los carcinomas colorrectales incluyen pruebas para
KRAS
estado mutacional como predictor de la respuesta a los agentes anti-factor de crecimiento epidérmico (EGFR), como cetuximab [4]. Ahora, las directrices recomiendan que, al menos, el exón 2
KRAS
estado de la mutación debe ser determinado y siempre que sea posible, no exón 2
KRAS
y
NRAS
statuts mutación deben también se determinó (NCCN directrices http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Esto pone de manifiesto que el número (o la medida) de biomarcadores que se necesitan para ser evaluados en la práctica clínica diaria en la patología molecular está aumentando rápidamente. Esto exige la aplicación de métodos de sondeo del estado mutacional de los genes múltiples. Por otra parte, este aumento en el número de genes para poner a prueba está asociado con una disminución en el tamaño de la muestra. El patólogo se enfrenta a un nuevo reto: la optimización del tejido tumoral disponible. Como ha aumentado el número de variantes genéticas clínicamente significativos, pruebas clínicas ha evolucionado, pasando de las mutaciones individuales para multiplexar las evaluaciones de punto de acceso en múltiples genes del cáncer. En los últimos años, Next Generation Sequencing (NGS) ha comenzado a suplantar otras tecnologías para las pruebas de mutación del gen [5-8]. Dirigida, basada en la amplificación NGS ofrece la secuenciación simultánea de miles de corta secuencia de ADN de una manera masiva en paralelo y puede ofrecer un enfoque rentable para la detección de múltiples alteraciones genéticas con una cantidad mínima de ADN [5, 9, 10]. Por otra parte, NGS se puede realizar utilizando el ADN de bloques, (FFPE) los tejidos incluidos en parafina fijado en formol [11-16]. La aplicación clínica de NGS en el cáncer es la detección de alteraciones genómicas /genéticos clínicamente viables que son críticos para el tratamiento del cáncer [6]. Estas alteraciones pueden ser de diagnóstico, pronóstico o importancia terapéutica. Sin embargo, la transferencia de tecnología NGS a la práctica clínica diaria requiere validación.
En el presente estudio se evaluó la aplicabilidad clínica de los dos puntos de iones Ampliseq y el panel de cáncer de pulmón en los Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM-Tecnologías de la Vida) para la detección de pulmón y colorrectal. El colon Ion Ampliseq y el panel de cáncer de pulmón es un método de preparación biblioteca basada en PCR multiplex por el cual 90 amplicones que abarcan 1825 hotspots mutacionales de 22 genes relacionados con el cáncer de colon y de pulmón se amplifican selectivamente [14, 15, 17, 18].
Materiales y Métodos
Este trabajo ha sido aprobado por el comité de ética del hospital Universitario Erasme (Bruselas, Bélgica-ref: P2013 /174)
Ética Declaración
. De acuerdo con la ley belga de diciembre de 2008, «Loi relativa à l'obtención et à l'utilización de matériel corporel humain destiné à des aplicaciones médicales humaines ou à des fins de recherche scientifique», se requiere el consentimiento informado por escrito ninguna. El comité de ética ha renunciado así la necesidad de consentimiento informado por escrito del participante.
Selección
Muestras
Las muestras tumorales de 90 pacientes fueron analizados retrospectivamente, incluyendo 51 adenocarcinomas colorrectales (CRC) y 39 no pequeña carcinomas de pulmón no microcítico (CPNM incluyendo 37 adenocarcinomas y carcinomas escamosos 2). El estado mutacional de
KRAS
y
Hoteles en BRAF CRC y de
EGFR en CPNM
habían sido previamente evaluado en el contexto de la práctica diaria. Los tipos de muestras primarias eran o resecciones quirúrgicas (n = 57, 44 y 13 de CRC CPNM), biopsias (n = 23, 7 y 16 de CRC CPNM) o bloques de celdas (n = 10, todos los CPNM). Además, se utilizaron 12 muestras no neoplásicas (6 pulmones y 6 colones) y 5 patrones de referencia comerciales FFPE (Horizon Diagnostics, Cambridge, Reino Unido) que llevan la mutación en
ANR
,
KRAS
,
AKT
y
EGFR
a 50% la frecuencia alélica (AF) y 1 FFPE patrón de referencia múltiplex (Horizon Diagnostics, Cambridge, Reino Unido) que lleva 11 mutaciones diferentes en varios AF definida (de 0,9 a la de 24,4% ).
extracción de ADN
se extrajo el ADN a partir de muestras tumorales FFPE utilizando el kit QIAamp tejido FFPE (Qiagen, Amberes, Bélgica). En resumen, 10 micras sin teñir secciones de parafina se cortaron y se incubaron a 37 ° C en un horno de secado durante la noche. La parafina se retiró por incubación de los portaobjetos en 2 baños sucesivos de xileno y el tejido tumoral fue macrodissected manualmente, raspado de la corredera con un escalpelo y se transfirió a un tubo de 1,5 ml. a continuación, se extrajo el ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El H & amp; E diapositiva manchado del mismo bloque, previamente revisado por un patólogo que rodeaba el área del tumor y se evaluó el porcentaje tumor, se utilizó como una guía para la macrodissection. El porcentaje de células tumorales de las muestras varió de 5 a 90%. El ADN obtenido se cuantificó usando el fluorómetro Qubit® en combinación con el kit de ensayo de ADN de doble cadena Qubit® SA (Life Technologies, Gent, Bélgica).
Detección de
KRAS
,
BRAF
y
EGFR mutaciones
la detección de
KRAS
,
BRAF
y
EGFR
mutaciones se realizaron en el contexto de la clínica la práctica diaria en un laboratorio certificado por ISO15189-PCR cuantitativa. Estos métodos se describen en S1 Archivo. La sensibilidad de estos ensayos se varía entre 3 y 20% del ADN mutante para la prueba KRAS, 10% de ADN mutante para las pruebas de BRAF, 0,5% de ADN mutante para las pruebas de EGFR p.L858R, 1% de ADN mutante para el exón 19 de EGFR eliminación y el 5% de ADN mutante para las pruebas de EGFR p.T790M, España
gotita digital de PCR
Algunas mutaciones detectadas por NGS fueron validados por las gotitas de PCR digital (ddPCR), como se detalla en S1 archivo.
Next Generation Sequencing
Para la construcción de bibliotecas, 10 ng de ADN (medido utilizando el fluorómetro Qubit® en combinación con el kit de ensayo de ADN de doble cadena Qubit® SA) se amplificó usando el colon y el panel de cáncer de pulmón (Ampliseq ™, Life Technologies), un panel validado recientemente [15] y el Ampliseq ™ de alta fidelidad mezcla de iones Master (kit Biblioteca Ion Ampliseq ™ 2.0). Una biblioteca de amplicón se genera así para la secuenciación de 1825 mutaciones en 22 genes de punto de acceso, incluyendo
AKT1 (NM_05163)
,
ALK gratis (
NM_004304)
,
BRAF (NM_004333)
,
CTNNB1 (NM_001904)
,
DDR2 (
NM_001014796),
EGFR (
NM_005228),
erbB2 (
NM_004448),
ERBB4 (
NM_005235),
FBXW7 (
NM_033632),
FGFR1 (
NM_023110),
FGFR2 (
NM_022970),
FGFR3 (
NM_000142),
KRAS (
NM_033360),
MAP2K1 (
NM_002755),
MET (
NM_001127500),
NOTCH1 (
NM_017617),
ANR (
NM_002524),
PIK3CA (
NM_006218),
PTEN (
NM_000314),
SMAD4 (
NM_005359),
STK11 (
NM_000455 ),
TP53 (
NM_000546). Los amplicones fueron digeridos, un código de barras y se amplificaron usando el kit de Biblioteca Ion Ampliseq ™ 2.0 y Ion Xpress ™ adaptadores de código de barras kit (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La biblioteca se cuantificó usando el fluorómetro Qubit® y el kit de ensayo de ADN de doble cadena Qubit® SA (Life Technologies). 20:00 de cada biblioteca era multiplexados y amplificada por clonación de partículas de iones esfera ™ (ISP) por emulsión de PCR realizado en el Ion One Touch 2 instrumento con la plantilla Ion PGM ™ OT2 200 kit (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. El control de calidad se llevó a cabo utilizando el kit de Ion Esfera de Control de Calidad ™ (Life Technologies) para asegurarse de que el 10-30% de la plantilla de ISP positivo se generaron en la emulsión PCR. Por último, el ISP plantilla se enriquece, se cargó en un Ion 316 ™ o en un 318 ™ de chip Ion y secuenciado en un secuenciador PGM ™ con el Ion PGM ™ secuenciación 200 kit v2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Datos análisis
los datos brutos fueron analizados utilizando el paquete de software v3.6.2 torrente (Life Technologies). El análisis de la cobertura se realizó mediante el análisis de la cobertura de plug-in v3.6. Los casos en que el número de mapeado lee fue & lt; 100 000 y /o la cobertura de base promedio era & lt; 500x se consideraron como no informativo. Las mutaciones se detectaron utilizando el plug-in v3.6 variante llamada entrante con una configuración de baja rigurosidad (Life Technologies). En la lista variante obtenida, cada mutación se verificó en el genoma espectador Integrativa (IGV) del Instituto Broad (http://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. Sólo mutaciones reportadas en la CÓSMICA (Sanger Institute Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer) de base de datos (http://www.sanger.ac.uk/cosmic) fueron tomadas en cuenta y mutaciones silenciosas o intrónicas no se informaron.
Los análisis estadísticos
Las pruebas no paramétricas de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis se utilizaron para comparar dos o varios grupos independientes de datos numéricos, respectivamente. Si la prueba de Kruskal-Wallis fue significativa, pruebas post-hoc se aplicaron usando el procedimiento estándar Dunn para comparar todos los pares de grupo o su adaptación para comparar cada condición experimental con el control, evitando múltiples efectos de comparación (como se detalla en Zar [20] )
Todos los análisis estadísticos se realizaron con Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, EE.UU.) y los valores de p & lt.; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
NGS validación panel de
El rendimiento del colon AmpliSeq y el panel de cáncer de pulmón se evaluó usando primero 12 no tejidos neoplásicos (6 pulmones y 6 dos puntos) y 6 patrones de referencia comerciales FFPE (5 estándares de referencia con una mutación en el 50% de frecuencias alélicas y un estándar de referencia múltiplex con 11 mutaciones diferentes en varias frecuencias alélicas definidas, que varía de 0,9 a la del 24,4%).
No se mutación se detectó en los 12 tejidos no neoplásicos. Las 5 mutaciones presentes en los estándares de referencia 5 en 50% la frecuencia alélica se detectaron todos correctamente por NGS con el colon AmpliSeq y el panel de cáncer de pulmón (Tabla 1). Entre las 11 mutaciones presentes en el patrón de referencia multiplex, todas las mutaciones con AF & gt; 3% se detectaron correctamente por NGS con la excepción de la
KIT
mutación porque este gen no está incluido en los 22 genes del panel . Para las 3 mutaciones con AF & lt; 3%, sólo uno (
EGFR
deleción en el exón 19, AF = 2,0%) se detectó por la variante de llamadas mientras que los otros dos (
EGFR
p .L858R y p.T790M con FA = 2,7% y 0,9%, respectivamente) no lo eran. Por inspección IGV, se encontró que estas variantes estaban presentes, pero con baja AF (25/1633 lee (1,5%) y 7/1613 lee (0,4%), respectivamente). mutaciones adicionales en
CTNNB1
,
BRAF
,
PIK3CA
y
EGFR
fueron detectados por la variante de llamadas en las normas de referencia (Tabla 1). El
KRAS
y
ANR
normas se generan a partir de la línea celular SW48 que se informa para llevar a
CTNNB1
p.S33Y y
EGFR
p.G719S mutaciones en la base de datos cósmicos (http://www.sanger.ac.uk/cosmic);
EGFR
normas se generan a partir de la línea celular RKO que se informa para llevar a
BRAF
p.V600E y
PIK3CA mutaciones
p.H1047R. Por último, la norma de referencia múltiplex se genera a partir de las líneas de células RKO, SW48 y HCT16, lo que explica la detección de la
CTNNB1
mutación p.S33Y en este control.
La precisión (reproducibilidad y repetibilidad) también se evaluó utilizando 2 muestras tumorales FFPE y la norma de referencia múltiplex. Las muestras se analizaron 5 veces (5 producciones de la biblioteca a partir de la misma extracto de ADN) en tres experimentos diferentes (Tabla 2). Todas las mutaciones con una AF & gt; se detectaron sistemáticamente 4%. Sin embargo, las mutaciones con una AF & lt; 3% se detectaron por la variante de llamadas en una o más, pero no todos, de los cinco repeticiones. Por inspección IGV, las mutaciones TP53 incompatible detectado por la variante de llamadas estaban presentes sólo en la replicación para el que se detectó la mutación por la variante de llamadas, pero no por las otras repeticiones (S1 tabla). Para el estándar de referencia, las 3 variantes de EGFR se detectaron mediante inspección IGV (pero con una cobertura variante & lt; 30x para la mayoría de las repeticiones). Aunque estos se detectaron de manera incompatible por la variante de llamada (S1 Tabla)
Además, algunas mutaciones fueron verificadas por ddPCR (Tabla 2). La mutación p.H1047Q PIK3CA, detectado consistentemente por NGS con un AF media de 10,8%, también se detectó mediante ddPCR con un AF de 9,1%. En contraste, el p.R181C y los p.H168Y mutaciones TP53 incompatible detectado por NGS no fueron detectados por ddPCR. Teniendo en cuenta los hechos que las mutaciones detectadas con un AF & lt; 3% no fueron validados por ddPCR (por TP53 mutaciones) o incompatible detectado (mutaciones de EGFR en el estándar de referencia), y que la mutación KRAS con un AF esperada de 5% se detectó consistentemente con un AF que varía desde 4,6 hasta 5,9%, se un umbral seleccionado AF 4% para la presentación de informes mutación. Este umbral es consistente con los datos reportados en la literatura para esta plataforma NGS [9, 16, 21].
actuaciones de secuenciación
Un conjunto de 90 muestras FFPE, incluyendo CRC 51 y 39 CPNM , fue secuenciado por NGS. rendimiento de secuenciación se evaluó a partir del número y distribución de lee a través de las regiones seleccionadas. Entre los 90 casos secuenciados, 89 (98,9%) tuvieron éxito (número de mapeado lee & gt; 100000 o la cobertura de la base media & gt; 500 veces). El caso unsuccesfull se consideró no informativo debido a una serie de lecturas & lt; 100 000 (40.072 lecturas) y la cobertura de base promedio & lt; 500 veces (1,2X). Entre los 89 casos secuenciados con éxito, un caso se consideró subóptima (número de lecturas: 69.564 y la cobertura de base promedio: 676x), sin embargo la calidad de la secuenciación se consideró lo suficientemente bueno para su posterior análisis. Todos los demás casos (n = 88, 97,8%) tenían un número de lecturas & gt; 100.000 y un rendimiento medio de base & gt; 1000X. El número medio de lecturas por las muestras fue de 232.832 y la profundidad de cobertura de base promedio fue de 2,296. En promedio 91,6% de los amplicones tenía una profundidad de cobertura de más de 500 veces (Tabla 3). No hubo diferencia significativa entre CRC y NSCLC en términos de número de lecturas (p = 0,45), la profundidad de la cobertura de base (p = 0,42) y el porcentaje de amplicones con una profundidad de cobertura mayor que 500 veces (p = 0.32) (prueba de Mann-Whitney ). Para 12 de los casos, la cantidad de ADN obtenido después de la extracción era demasiado bajo para alcanzar el 10 ng requerida para la secuenciación dirigida (concentración de ADN que van desde 0,1 a 1,5 ng /l). La secuenciación fue un éxito para los 12 casos y no se observó ninguna diferencia estadística en términos de número de lecturas (p = 0,45), la profundidad de la cobertura de base (p = 0,42) y en términos de porcentaje de los amplificados con una profundidad de cobertura de más de 500x ( p = 0,32) entre las muestras con menos de 10 ng de la requerida de ADN y muestras con suficiente ADN (prueba de Mann-Whitney, Tabla 3). Esto sugiere que la secuenciación de éxito puede obtenerse a partir de tan poco como 1 ng de ADN.
A continuación, considera la influencia de diferentes tipos de muestras primario en el rendimiento de secuenciación. No se observó ninguna diferencia estadística en términos de número de lecturas y la profundidad de cobertura de base entre las resecciones quirúrgicas, biopsias y bloques de celdas (prueba de Kruskal-Wallis, Tabla 3). Sin embargo, el porcentaje de los amplificados con una profundidad de cobertura de más de 500X fue significativamente mayor para los bloques de celdas que para biopsias (prueba de Kruskal-Wallis p = 0,02 y post-hoc test, p = 0,02).
Los amplicones que mostró una cobertura inferior 250X se consideraron como no informativo. Este umbral ya se utilizó en la literatura [22]. Algunos de los amplicones del panel fracasado repetidamente para llegar a 250X (en más de 10% de las muestras). Estos amplicones se enumeran en la Tabla 4. Los amplicones de que en repetidas ocasiones fallaron fueron los mismos para los diferentes tipos de muestras (biopsias primaria, bloques de células y la resección quirúrgica). Para estos amplicones, el contenido de GC fue significativamente mayor (contenido medio de GC en los 7 amplicones que repetidamente fracasaron era 69,6% contra 48% para los otros amplicones, p = 0,00005), mientras que la longitud no fue significativamente diferente (la longitud media de la 7 amplicones que fallaron en varias ocasiones fue de 108 pb frente a 112 para los otros amplicones).
Comparación con otros métodos
Un conjunto de 90 muestras FFPE, incluyendo CRC 51 y 39 CPNM, era secuenciado por NGS. El estado mutacional de
KRAS gratis (exón 2) y
BRAF gratis (p.V600E) en el CCR y
EGFR gratis (p.L858R y deleciones en el exón 19) en NSCLC habían sido previamente evaluados por PCR en el contexto de la práctica diaria.
NSCLC.
la secuenciación fue un éxito para 38 de las 39 muestras analizadas (97%) mientras que el
EGFR
análisis con el método de PCR tuvo éxito por sólo 35 de las 39 muestras (90%). 34 muestras tienen éxito las pruebas tanto por NGS y PCR, lo que permite el estudio de concordancia.
Uso de NGS, las mutaciones en
EGFR
se detectó en 4/38 casos (10,5%). Tres de cada cuatro
EGFR
mutaciones fueron también detectados por PCR. Para una muestra que fue considerada como no informativa por PCR, un p.L861Q
EGFR
mutación se detectó utilizando NGS (S2 Tabla). Por otra parte, un p.L858R
EGFR
mutación se detectó por PCR y por NGS. Sin embargo, para esta muestra la variante de llamadas detecta la mutación en un AF de 1,9%; dado a nuestros criterios para considerar una variante como auténtico (ver materiales y métodos) no pudimos validar esta variante.
En general, la concordancia entre los dos métodos de
EGFR
detección de mutaciones fue de 33/34 (97%)
Además, las mutaciones en otros genes fueron detectados por NGS:. mutaciones en
KRAS Opiniones de 15/38 muestras (39,5%), las mutaciones en
TP53
de 15/38 pacientes (39,5%), las mutaciones en
STK11 Opiniones de 3/38 pacientes (7,9%), mutación en
BRAF Opiniones de una muestra (2,6%), mutación en
PIK3CA
para un paciente (2,6%), la mutación en
CTNNB1
para una muestra (2,6%). perfiles mutacionales de NSCLC se resumen en la figura 1 y en la Tabla S2. En general, 29/38 muestras se caracterizan por al menos una mutación (76,3%).
Las mutaciones en diferentes genes (filas) se indican para cada muestra NSCLC (columnas). Un cuadrado gris indica que una mutación (que figuran en la base de datos cósmicos (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), con exclusión de polimorfismo) se encontró con los dos puntos Ampliseq y el panel de pulmón en el gen, mientras que un cuadrado vacío indica que no se encontró ninguna mutación relevante para el gen
las 2 mutaciones KRAS identificados con un AF. & lt; 6% (uno p.G12S con un AF de 4%, una p.G12D con un AF de 5%) fueron verificadas por ddPCR. Las 2 mutaciones se detectaron por ddPCR con un AF de 1,1 y 5,7%, respectivamente (Tabla S2).
CRC.
Secuenciación y PCR tuvieron éxito para todas las muestras.
Uso de NGS, las mutaciones en
KRAS
se detectaron en 30/51 casos (58,8%), mientras que
KRAS
análisis con el método de PCR detectaron sólo 23 casos de mutaciones en el em> KRAS
gen (45,1%). Cinco de los 7 casos discordantes se caracterizaron por mutaciones en los codones 59, 61 y 146 (exones 3 y 4) que no fueron cubiertos por la prueba de PCR. Las mutaciones en los codones 61 y 146 fueron probados y validados por ddPCR (S3 Tabla) A los 2 casos restantes no detectados por PCR,
se detectó la mutación KRAS
p.G12V por NGS con un AF de 8 y 9%, respectivamente. Estas mutaciones también se detectaron por ddPCR con un AF de 12,5 y 9%, respectivamente. En los 23 casos concordantes, AF de
KRAS
mutaciones fueron superiores al 20% durante 21 casos; Sólo en dos casos se caracterizaron por un AF de 9 y 10%, respectivamente.
El estado mutacional de
BRAF fotos: por PCR se evaluó durante 49 casos (para 2 casos no había suficiente ADN) .
se detectó la mutación BRAF
p.V600E para 5 pacientes (10,2%) utilizando NGS o PCR. . Por otra parte, un
BRAF mutación
p.E586K se detectó usando NGS
Además, las mutaciones en otros genes fueron detectados por NGS: mutaciones en
ANR Opiniones de 2/51 pacientes (3,9%), las mutaciones en
TP53 Opiniones de 32/51 pacientes (62,7%), las mutaciones en
PIK3CA Opiniones de 10/51 pacientes (19,6%) y las mutaciones en
FBXW7
5/51 para muestras (9,8%). Las 2 mutaciones ANR y la p.E545K, mutaciones PIK3CA p.H1047 fueron validados por ddPCR (S3 Tabla).
perfiles mutacionales de CRC se resumen en la figura 2 y en la Tabla S3. En general, 45/51 muestras se caracterizan por al menos una mutación (88,2%).
Las mutaciones en diferentes genes (filas) se indican para cada muestra CRC (columnas). Un cuadrado gris indica que una mutación (que figuran en la base de datos cósmicos (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), con exclusión de polimorfismo) se encontró con los dos puntos Ampliseq y el panel de pulmón en el gen, mientras que un cuadrado vacío indica que no se encontró ninguna mutación relevante para el gen.
Discusión
Una ventaja importante de NGS sobre los métodos de detección de mutaciones tradicionales es su capacidad para detectar múltiples mutaciones en múltiples genes al mismo tiempo sin la necesidad para llevar a cabo varias pruebas secuenciales. Varios estudios ya han validado el uso de NGS y su superioridad en términos de sensibilidad, velocidad y coste en comparación con los métodos tradicionales. [18, 23, 24] En nuestra propia experiencia, para las pruebas, incluyendo más de dos a tres puntos de acceso diferentes, NGS es más barato, más rápido y requiere menos ADN que sería necesario para los métodos tradicionales. Esto es de particular importancia para las muestras de citología y biopsias de tejidos pequeña para la que hay que examinar en varias alteraciones moleculares, como por ejemplo muestras de NSCLC [9, 18]. De hecho, NGS requiere sólo 10 ng para el panel de cáncer de pulmón y de colon completo, mientras que los métodos tradicionales pueden requerir hasta 10 ng de ADN para cada mutación probado
.
La precisión (repetibilidad y reproducibilidad) análisis utilizando patrones de referencia con una FA conocido permitido mostrar que todas las mutaciones con un AF & gt; se detectaron sistemáticamente un 5%. Sin embargo, las mutaciones con una AF & lt; se detectaron de manera incompatible 3%. Además, cuando se analizaron muestras clínicas 5 veces en 3 experimentos diferentes, la variante de llamadas detecta de manera incompatible mutaciones con un AF & lt; 3% que no son detectadas por ddPCR, lo que sugiere que estas mutaciones corresponden a artefactos de secuenciación, como se observa a menudo con DNA extraído de muestras de FFPE [25-27]. El umbral de 4% fue así seleccionados para los informes mutación como un equilibrio entre la maximización de la sensibilidad y minimizar los resultados falsos positivos debido a artefacto técnico. Este umbral es consistente con otros datos de sensibilidad y especificidad en la literatura para esta plataforma NGS [16, 21]. El uso de este umbral, se perdió un caso de NSCLC con una mutación de EGFR p.L858R. Para esta muestra la variante de llamadas detecta la mutación en AF de 1,9%. Sin embargo, teniendo en cuenta los criterios para considerar una variante como auténtico (AF & gt; 4% y la cobertura variante & gt; 30x), que no pudieron validar esta variante. Se propuso recientemente que conoce las variantes de genes clínicamente relevantes, como
EGFR
mutaciones para CPNM, se debe informar con independencia de la AF [28]. En nuestra práctica clínica actual, cuando observamos una conocida variante genética clínicamente relevante, pero con un objetivo AF por debajo del umbral, nos informan de que la variante del gen se sospecha pero no confirmada y que sería interesante probar otra muestra del paciente si está disponible .
No se observaron discrepancias entre NGS y los métodos tradicionales para 2 casos de CCR con mutaciones KRAS G12V, ambos con una frecuencia alélica & lt; 10%. Este bajo AF puede explicar las discrepancias porque el umbral de método tradicional está variando de 3 a 20% del ADN mutante para la prueba KRAS. Para estos 2 casos, el
KRAS mutaciones
p.G12V fueron validados por ddPCR.
Uno de los retos utiliza NGS es interpretar las mutaciones detectadas en el contexto biológico. Como ya se ha descrito [28], las variantes se pueden agrupar en tres categorías: i) aquellos que pueden tener un impacto directo en la atención al paciente y se consideran acciones concretas; (Ii) los que pueden tener relevancia biológica pero que no son claramente accionable; y (iii) los que son de significado desconocido. En el presente estudio, el análisis de NGS detectado mutaciones (que no sean
EGFR
mutaciones para NSCLC y que
KRAS
y
ANR Opiniones de CRC) con potencial impacto clínico de los pacientes con 4 NSCLC (un
PIK3CA mutación y
3
STK11
mutaciones) y de 14 pacientes con CCR (10
PIK3CA mutaciones
, 5
BRAF mutaciones
-uno la acogida del paciente
PIK3CA Opiniones y
BRAF
mutaciones). De hecho, los datos preclínicos apoyan el argumento de que las líneas celulares de cáncer con
PIK3CA
o
STK11
y
KRAS
espectáculo mutación aumento de la sensibilidad a los inhibidores Pik3 o MAPK y la inhibición de mTOR señalización, respectivamente [29] - [30]. Por otra parte, una fase I de escalada de dosis ensayo clínico de un inhibidor de PI3K de clase sartén I en pacientes con tumores sólidos avanzados, principalmente colorrectal, de mama y de pulmón actividad antitumoral preliminar mostró-[31]. De la misma manera, se observó actividad antitumoral evidentes para los pacientes con
BRAF mutado
CRC tratados con un inhibidor de BRAF mutante selectiva [32].
En conclusión, el presente estudio validó la clínica aplicabilidad del colon Ion Ampliseq y el panel de cáncer de pulmón en el Ion torrent Personal Genome Machine para el cribado de pulmón y colorrectal. En general, el panel de cáncer de colon /pulmón AmpliSeq era lo suficientemente específico y sensible para el análisis de mutaciones de genes de los paneles y se puede incorporar en la práctica clínica diaria.
Apoyo a la Información
S1 Archivo. métodos complementarios:. detección de KRAS, BRAF y mutaciones de EGFR y gotita de PCR Digital doi: 10.1371 /journal.pone.0138245.s001 gratis (DOCX)
S1 tabla. Análisis de cobertura para las variantes no detectado consistentemente en el análisis de precisión
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138245.s002 gratis (DOC) sobre Table S2. resultados de la secuenciación de NSCLC
doi: 10.1371. /journal.pone.0138245.s003 gratis (DOCX)
S3 Tabla. resultados de la secuenciación de CRC
doi: 10.1371. /journal.pone.0138245.s004 gratis (DOCX)