Extracto
La creciente evidencia biológica genética y molecular sugiere que la alteración del equilibrio entre relacionada con Frizzled proteína secretada-1 ( SFRP1) y β-catenina desempeña un papel importante en la iniciación y desarrollo de múltiples tipos de cáncer. El objetivo de este estudio fue examinar si la expresión de SFRP1 y β-catenina se asocia con las características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer de próstata (CaP), y para evaluar sus posibles funciones como biomarcadores predictivos y pronósticos. En este estudio, se incluyeron un total de 61 pacientes con CaP y 10 pacientes con hiperplasia benigna de próstata, y nos mostró que la expresión de SFRP1 y β-catenina se correlacionó con la puntuación, la tasa de supervivencia de Gleason y la respuesta a la terapia endocrina del CaP. Las tasas de supervivencia de los pacientes con CaP con baja expresión SFRP1 (P = 0,016) o la expresión de alto β-catenina (p = 0,004) fueron significativamente más pobre. Una correlación negativa (r = -0,275, p = 0,032) entre SFRP1 y β-catenina se observó mediante la prueba de Chi-cuadrado. El análisis multivariado sugirió que SFRP1 (cociente de riesgos instantáneos, 0.429; 95% intervalos de confianza, 0.227-0.812; P = 0,009) puede servir como un factor predictivo y pronóstico independiente de CaP. También puso de manifiesto que los niveles de proteína y ARNm de SFRP1 en línea de células CaP andrógeno-dependientes LNCaP fueron significativamente superiores a los de las líneas celulares de CaP independiente de andrógenos DU145 y PC3. Sin embargo, el nivel de proteína de β-catenina en las células LNCaP fue significativamente menor que la de las células DU145 y PC3, y no se observó diferencia significativa del nivel de mRNA β-catenina en LNCaP, DU145 y células PC3. secuenciación de bisulfito de ensayo de PCR reveló significativamente menor nivel de metilación de
SFRP1
promotor en células LNCaP que la de las células DU145 y PC3. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que SFRP1, cuya expresión se correlaciona inversamente con la de β-catenina, es un biomarcador predictivo y pronóstico favorable
Visto:. Zheng L, Sun D, W Fan, Zhang Z, Q Li , Jiang T (2015) Valor diagnóstico de SFRP1 como un biomarcador predictivo favorable y pronóstico en pacientes con cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (2): e0118276. doi: 10.1371 /journal.pone.0118276
Editor Académico: Craig N. Robson, Instituto de Investigación del Cáncer del Norte, Reino Unido
Recibido: 2 Agosto, 2014; Aceptado: January 12, 2015; Publicado: 26 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas (21272032 a TJ) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/publish /portal1 /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es un tumor maligno común del sistema urinario, que es la sexta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los hombres [1-3], afecta seriamente la calidad de vida del paciente. antecedentes familiares de la enfermedad, la etnia y la edad avanzada son reconocidos como los principales factores que impulsan el CP, mientras que patogénesis detallada de esta enfermedad aún no es concluyente [4]. En la actualidad, la resección quirúrgica radical, la radioterapia y la terapia endocrina se utilizan como tratamientos de CaP [5-8]. Sin embargo, esta enfermedad suele ser mortal para la mayoría de los pacientes diagnosticados en estadios avanzados. Por lo tanto, es muy importante identificar valiosos biomarcadores predictivos y pronósticos para el diagnóstico precoz, y para aclarar la patogénesis de CaP
.
proteínas Wnt son proteínas secretadas glicosilada y lípidos modificados ricos en cisteína, que desempeñan un papel clave en varios procesos celulares, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, la migración, la actividad sináptica y desarrollo embrionario [9-14]. Estas proteínas ejercen sus funciones fisiológicas a través de la vía de señalización Wnt. Las proteínas Wnt se unen a los receptores de siete dominios transmembrana (7-TM) de la familia rizado, y luego activan una compleja cascada de señalización, finalmente conducen a la activación de los genes diana, como
c-myc, c-Jun, fibronectina
y
ciclina D1
[15,16]. β-catenina es un componente importante de la vía de señalización Wnt, cuya localización alterada ha sido reconocido como un marcador de la activación de Wnt vía de señalización [16]. En ausencia de ligando Wnt, citoplásmica β-catenina es degradada por el complejo destrucción β-catenina compuesto de andamio de proteínas axina, la caseína quinasa 1 (CK1), poliposis coli adenomatosa (APC) y la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) a través de la ubiquitina -proteasome vía. Sin embargo, en presencia de ligando Wnt, Wnt ligando se une a su receptor, lo que resulta en la inhibición de la destrucción complejo β-catenina. Posteriormente, las moléculas de ß-catenina no fosforilados se acumulan en el citoplasma, una parte del cual entrar en el núcleo y ejercen su función como co-activador de factores LEF /TCF de transcripción, finalmente conducen a la activación de Wnt genes diana expresión [9]. En la actualidad, cada vez más evidencia sugiere que la desregulación de la vía de señalización Wnt está estrechamente asociada con la tumorigénesis CaP en adultos [17-20].
secretada relacionada con frizzled proteína-1 (SFRP1), también conocido como SARP-2, fue aislado de las células osteoblastos humanos, que pertenece a la familia de la glicoproteína secretada SFRP. Alberga dos dominios estructurales distintos, a saber dominio netrina y el dominio CRD. CRD dominio es homólogo a los receptores de frizzled [16,21]. Los estudios muestran que SFRP1 es un antagonista de la vía de señalización Wnt, y puede unirse a las proteínas Wnt a través de su dominio CRD de una manera competitiva con el receptor de transmembrana frizzled, lo que lleva a la inhibición de la vía de señalización Wnt [22-25]. Se requiere SFRP1 para el desarrollo de la próstata, y ejerce su papel como modulador-estromal-epitelial de paracrina del crecimiento epitelial, la morfogénesis de ramificación, y la expresión génica epitelial [26]. También se reconoce como un mediador candidato de estroma-a-epitelial de señalización en CaP [27]. La inactivación de SFRP1 ha informado debido a la alta metilación de
SFRP1
promotor del gen en una variedad de tumores malignos incluyendo CaP [28-35]. Por otra parte, SFRP1 inhibe la actividad transcripcional de los receptores de andrógenos (AR) y la proliferación de células LNCaP dependientes de andrógenos [36]. El propósito de este estudio fue examinar el papel de SFRP1 y expresión β-catenina en la patogénesis del CaP humano.
En este informe, se demostró que existía una correlación negativa entre SFRP1 y β-catenina en los tejidos humanos CaP mediante la evaluación de las características clínicas-patológico. El análisis multivariado reveló que SFRP1 puede servir como un factor predictivo y pronóstico independiente de CaP. Los niveles de proteína y ARNm de SFRP1 en la línea celular de CaP dependiente de andrógenos LNCaP fueron significativamente más altos que los de las líneas celulares de CaP independientes de andrógenos DU145 y PC3. Sin embargo, el nivel de proteína de β-catenina en las células LNCaP fue significativamente menor que la de las células DU145 y PC3, y no se observó diferencia significativa del nivel de mRNA β-catenina en LNCaP, DU145 y células PC3. También puso de manifiesto que el nivel de metilación de
SFRP1
promotor fue significativamente menor en las células LNCaP que la de las células DU145 y PC3. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que SFRP1 es probable que sea un biomarcador predictivo y pronóstico favorable.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio con seres humanos fue aprobado por el comité de ética de la Universidad médica de Dalian. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los participantes humanos. Toda la investigación se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Cultivo celular y experimentar Reactivos
líneas celulares de CaP humano LNCaP, DU145 y PC3 se obtuvieron del banco de células de la sucursal de Shanghai de la Academia china de Ciencias. células LNCaP se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, EE.UU.), 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células DU145 se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, EE.UU.), 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células PC3 se cultivaron en DMEM /F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, EE.UU.), 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Todas las células se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2.
monoclonal de conejo anti-SFRP1 (ab126613) y ratón monoclonal anti-β-catenina (ab22656) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, UK). Ratón monoclonal anti-β-actina (C4) (sc-47778), de cabra anti-IgG de ratón y de cabra anti-IgG de conejo se obtuvieron de Santa Cruz Biotech (CA, EE.UU.). mezcla de inhibidor de proteasa se adquirió de Roche Applied Science (Basilea, Suiza). 5Aza se obtuvo de Sigma (Santa Clara, EE.UU.). SmartPool siRNAs (Control y β-catenina) con cuatro siRNA individuales dirigidas a un único gen se obtuvieron de Thermo (EE.UU.).
muestras de tejido para CaP ensayo inmunohistoquímico
Se obtuvieron un total de 71 muestras del primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Dalian, Liaoning, china, del 2002 y 2008 incluyendo 61 muestras de pacientes que fueron verificados patológicamente o citológicamente adenocarcinoma de próstata y 10 muestras de la hiperplasia prostática benigna. Todas las muestras fueron CaP de pacientes con edades iba desde los 44 al 84 (edad media de 72 años). Los grados del tumor se registraron como puntuación de Gleason & gt; 7 (34 muestras), y Gleason score≤7 (27 muestras). De acuerdo con sistema de nodos metástasis tumoral (TNM) desarrollado por el Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC), todos los pacientes participaron en esta investigación fueron en T
3 /T
4 /N
x-1 M
0 etapa. Benignos muestras de hiperplasia prostática se obtuvieron de pacientes para el tratamiento de las enfermedades no tumorales, con edades de entre 48 al 81 (edad media de 71,8 años). Todos los pacientes fueron seguidos hasta diciembre de 2013. El tiempo de supervivencia varió de 3 a 60 meses, con una mediana de 38 meses. Durante este período, 38 pacientes murieron debido a la recurrencia del cáncer
Los criterios de evaluación de la respuesta a la terapia endocrina:. (1) La terapia efectiva endocrino. Después de tratamiento endocrino (medicamentos o la castración quirúrgica), declaraciones de nivel de PSA normal y & lt; 2 ng /ml dentro de tres años. No hay nuevas lesiones metastásicas aparecen en el hueso a través de CT, MRI o exploración TEC; (2) la terapia endocrina ineficaz. Después del tratamiento endocrino, el nivel de PSA no reduce, de forma transitoria o disminuye y luego aumenta. agrava la enfermedad, y los nuevos aparecen lesiones metastásicas en hueso en dos años.
inmunohistoquímica Ensayo
Todas las muestras se analizaron por inmunohistoquímica. Los especímenes extirpados por la operación fueron fijadas en 10% formalina tamponada durante 24 h, y a continuación, los tejidos fijados se embebieron en parafina. Cuatro micrómetros secciones de las sucesivas muestras incluidas en parafina se cortaron para el análisis inmunohistoquímico con la ayuda de un kit Histostain-Plus (Invitrogen, Camarilo, CA). Todas las secciones se deparaffinized con xileno y rehidratada con una solución de etanol clasificado. H
2O
2 (3%) se utilizó para apagar las peroxidasas endógenas de las muestras, y después las secciones se incubaron en suero de bloqueo durante 10 min a 37 ° C. Las secciones fueron teñidas con tampón de citrato (pH 6,0) que contiene o bien anti-SFRP1 o anti-β-catenina a una dilución de 1: 100 durante la noche a 4 ° C. Las secciones fueron incubadas con biotina de cabra anti-inmunoglobulina de conejo a una dilución de 1: 200 durante 10 min a temperatura ambiente, y luego incubadas con avidina-biotina peroxidasa durante 10 min a temperatura ambiente. Por último, las secciones se incubaron con DAB (diaminobenzidina) que se utiliza como cromógeno.
casos de tinción SFRP1-positivos mostraron claras gránulos de color amarillo marrón en el citoplasma. β-catenina-positivo casos de tinción mostraron claras gránulos de color amarillo pardo en citomembrana y el núcleo. La puntuación de la tinción se hizo de acuerdo a los siguientes criterios: (1) de puntuación basado en intensidad de la tinción. 0, sin tinción de células; 1, las células con color amarillo pálido; 2, las células con marrón pálido; 3, las células con color marrón. (2) de puntuación basado en el porcentaje de células positivas. Las muestras fueron observadas bajo un aumento de potencia alta (400 ×). se seleccionaron 10 campos al azar, y se contaron 100 células por campo. la tinción de células 25%; 0, & lt; 1, 25% de tinción de células ~ 50%; 2, 51% de tinción de células ~ 75%; la tinción de células 75%; 3, & gt. Tomados en conjunto, (1) + (2) & gt;. 3 fue reconocido como muestras positivas, mientras que (1) + (2) ≤3 fue reconocido como muestras negativas
Western Blot ensayo
LNCaP, DU145 y células PC3 tratadas con o sin 5Aza (DNA inhibidor de la metilación) se cosecharon y se lisaron en un tampón frío (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sodio, y mezcla de inhibidor de la proteasa). Después de centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, las muestras de sobrenadante se sometieron a SDS-PAGE. A continuación, las bandas de proteínas en gel fueron transferidas a poli fluoruro de vinilideno (PVDF) membrana (Millipore), y se sondaron con el anticuerpo primario indicado durante la noche a 4 ° C. A continuación, la membrana de PVDF se incubó con el anticuerpo secundario apropiado para 4 h a temperatura ambiente. Los resultados se analizaron mediante la detección de quimioluminiscencia. Los datos se cuantificaron mediante el escaneo de las bandas apropiadas de interés y se representan en la densidad relativa de la escala de grises. El experimento se repitió tres veces.
RT-PCR cuantitativa Ensayo
El ARN total de cada línea celular (LNCaP, DU145 y PC3) fue extraído por medio de reactivo RNAiso Plus (Takara, Dalian, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó con la ayuda de un kit de transcripción inversa (Takara, Dalian, China). PCR en tiempo real se realizó con el Sistema LightCycler PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). Se utilizaron los siguientes cebadores diseñados por Primer Premier 5.0: 5'-CCCGAGATGCTTAAGTGTGACAA-3 '(sentido) y 5'-ACTCGCTGGCACAGAGATGTTC-3' (antisentido) para
SFRP1
; 5'-AGAAAAGCGGCTGTTAG-3 '(sentido) y 5'-ATACAGGACTTGGGAGGT-3' (antisentido) para
β-catenina
; 5'-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3 '(sentido) y 5'-CAAAGAAAGGGTGTAAAACGC-3' (antisentido) para
β-actina
. Las muestras que contienen cDNA, el par adecuado de cebadores y los máximos de SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo) fueron sometidos a la siguiente reacción: etapa de desnaturalización inicial de 95 ° C durante 10 min; y 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 15 s, y 72 ° C durante 20 s. El 2
- △△ se utilizó CT método para el análisis de datos. Los niveles de mRNA de
SFRP1
y
β-catenina
se normalizaron a
β-actina
, que se sirve como control endógeno.
secuenciación de bisulfito ensayo de PCR (BSP)
el ADN de cada línea celular (LNCaP, DU145 y PC3) se extrajo utilizando un kit de purificación de ADN (Tiangen, Pekín, china) según las recomendaciones del fabricante. El ADN aislado se trató con bisulfito de sodio usando el kit de ADN CpGenome Fast Modificación (Millipore) según las recomendaciones del fabricante. El ADN tratado con bisulfito de sodio se amplificó por un 9600 GeneAmp PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Se utilizaron los siguientes cebadores diseñados por Primer Premier 5.0: 5'-GGTTAAGGTAGGAGTATTATTTGAGGT-3 '(sentido) y 5'-AACCTAAATCATACTTACAAACCCAT-3' (antisentido) para isla CpG 1 de
SFRP1
promotor; 5'-TTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT-3 '(sentido) y 5'-TACCACAAACTTCCAAAAACCTC-3' (antisentido) para la isla CpG 2 de
SFRP1
promotor. Se realizaron las siguientes condiciones de reacción: 10 ciclos de 95 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 30 s, 60 ° C-50 ° C durante 45 s (comenzando a 60 ° C para el primer ciclo pero con la disminución de la temperatura por 1 ° C por cada ciclo posterior), y 72 ° C durante 45 s; 33 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 50ºC durante 45 s, y 72 ° C durante 45 s; y 60 ° C durante 30 min. Los productos de PCR se purificaron usando un kit de purificación de ADN (Tiangen, Pekín, China), y se clonaron en el vector PMD-19T (Takara, 6013). Después de la transformación, 10 clones positivos de cada muestra BSP fueron elegidos para la secuenciación de ADN usando un analizador de 3730xl (Applied Biosystems).
Análisis estadístico
A Chi-cuadrado (
χ
2) se utilizó la prueba para aclarar la correlación entre SFRP1 y expresión β-catenina y características clínico patológicas en tejidos de PCA de 71 pacientes. las tasas de supervivencia de los pacientes se analizaron por el método de Kaplan-Meier. correlación de Spearman se llevó a cabo para evaluar la relación entre SFRP1 y expresión β-catenina. Los datos se expresan como medias ± desviaciones estándar. Las diferencias entre los valores medios fueron analizados por ANOVA seguido de pruebas de comparación múltiple de Student-Neuman-Keuls y analiza las relaciones bi-variante. La significación estadística se consideró a
P
. & lt; 0,05
Resultados
La expresión de SFRP1 y β-catenina se asocia con las características clínico-patológicas de la PCa humana
la expresión aberrante de SFRP1 y β-catenina desempeña un papel importante en el desarrollo de una variedad de cánceres, como el cáncer del tracto biliar, carcinoma mucoepidermoide, tumores suprarrenales y el cáncer cervical [16,37-39]. Sin embargo, el papel de SFRP1 y β-catenina en CaP no ha sido dilucidado. Con el fin de investigar su papel en el CP, hemos examinado si la expresión de SFRP1 y β-catenina en correlación con las características clínico-patológicas entre las 61 muestras de CaP por
χ
2 test. Se observaron diferencias estadísticamente significativas en la puntuación de Gleason, y la tasa de respuesta para el tratamiento endocrino de las dos proteínas de supervivencia, mientras que se observó una diferencia estadísticamente significativa en la edad, la metástasis antes de la cirugía y el nivel de PSA (Tabla 1). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la SFRP1 expresión y β-catenina en correlación con la puntuación, la tasa de supervivencia de Gleason y la respuesta a la terapia endocrina de los pacientes con CaP, mientras que no se correlacionaron con la edad, la metástasis antes de la cirugía y el nivel de PSA.
el efecto de la expresión SFRP1 sobre la tasa de supervivencia en pacientes con CaP
a fin de determinar la relación entre la expresión SFRP1 /β-catenina y la supervivencia global en el CaP, las curvas de supervivencia fueron dibujadas por el método de Kaplan-Meier Método. Los resultados revelaron que los pacientes SFRP1-negativos mostraron una tasa de supervivencia global significativamente peor que los pacientes SFRP1-positivo (P = 0,016, Fig. 1A). Por el contrario, los pacientes con β-catenina-positivos mostraron una tasa de supervivencia global significativamente peor que los pacientes ß-catenina-negativos (P = 0,004, Fig. 1B). Estos resultados sugieren que la expresión SFRP1 negativa y la expresión β-catenina positivo afectaron gravemente la tasa de supervivencia global de los pacientes con CaP.
A, la relación de la expresión SFRP1 con la supervivencia global en pacientes con CAP (P = 0,016). B, La relación de la expresión de β-catenina con la supervivencia global en pacientes con CAP (P = 0,004).
Para evaluar la contribución de las características clínico patológico como potenciales biomarcadores predictivos y pronósticos, se analizaron 6 las variables clínico-patológicos en los 61 pacientes con CaP mediante análisis multivariante. Como se muestra en la Tabla 2, Sólo expresión SFRP1 fue estadísticamente factor significativo (P = 0,009), y se pudo identificar como un indicador predictivo y pronóstico independiente, lo que indica que la expresión SFRP1 puede servir como el mejor biomarcador predictivo y pronóstico de la tasa de supervivencia en el CaP entre estas variables.
la expresión de SFRP1 y β-catenina se correlaciona negativamente en el CaP
Para determinar la correlación entre la expresión /β-catenina SFRP1 y la aparición de CaP, la expresión de la proteína de SFRP1 y β-catenina en muestras de tumores de próstata, hiperplasia prostática benigna y se compararon mediante inmunohistoquímica (Fig. 2). Se analizaron un total de 71 muestras de tejido (10 hyperpslasia prostática benigna y 61 tumores de próstata). De acuerdo con los criterios de calificación, 8 (80%) de las 10 muestras de la hiperplasia prostática benigna se clasificaron como positivos para la expresión SFRP1 y 2 (20%) fueron clasificados como negativos, mientras que en las muestras tumorales, expresión SFRP1 disminuyó significativamente con 36 (59% ) positivo y 25 (41%) negativo. En contraste, en las muestras de la hiperplasia prostática benigna, 9 (90%) se clasificaron como negativas para la expresión β-catenina y 1 (10%) se clasificó como expresión positiva, mientras que la expresión β-catenina aumentado significativamente con 29 (47,5%) positivo y 32 (52,5%) negativo en muestras de tumores (Tabla 3). Para demostrar la especificidad del anticuerpo β-catenina, siRNA desmontables experimento se llevó a cabo utilizando células PC3. La expresión de β-catenina endógena se redujo en un 86% en las células PC3 transfectadas con piscina siβ-catenina en comparación con las células PC3 transfectadas con siCONTROL (S1 figura). Estos resultados indicaron que la expresión SFRP1 se disminuyó, mientras que la expresión β-catenina se incrementó en CaP.
A, los resultados representativos que muestran la tinción inmunohistoquímica de SFRP1 y β-catenina en una sección de los tejidos hiperplasia benigna de próstata humanos. En el panel de la izquierda, las flechas muestran que la localización de SFRP1 distribuye uniformemente en el citoplasma. En el panel derecho, flechas muestran que la localización de β-catenina fue membrana celular predominantemente. B, La tinción inmunohistoquímica de SFRP1 y β-catenina en una sección de tejidos de cáncer de próstata humano (SFRP1 negativo y β-catenina positivo). En el panel de la derecha, las flechas muestran que β-catenina localiza principalmente tanto en citoplasma y núcleo. C, La tinción inmunohistoquímica de SFRP1 y β-catenina en una sección de tejidos de cáncer de próstata humano (SFRP1 positivo y β-catenina negativo). En el panel izquierdo, flechas muestran que la localización de SFRP1 era predominantemente en el citoplasma.
Para examinar la relación entre SFRP1 y β-catenina en los tejidos de CaP, los niveles de proteína de SFRP1 y β-catenina en muestras de tumores de próstata se analizaron mediante pruebas de chi-cuadrado. De acuerdo con nuestros criterios de calificación, 36 muestras fueron identificadas como expresión SFRP1-positivos, y 25 fueron identificados como expresión SFRP1-negativa en las 61 muestras de CaP. 23 (63,9%) de las muestras positivas SFRP1 mostró expresión β-catenina negativos, mientras que sólo 9 muestras (36%) mostraron expresión de β-catenina en las muestras negativas SFRP1-negativos (Tabla 4). Estos resultados mostraron que hubo una correlación negativa entre SFRP1 y β-catenina en el CaP (r = -0,275, p = 0,032).
A fin de determinar el cambio de SFRP1 y expresión β-catenina en diferentes líneas de células de CaP, la proteína y los niveles de mRNA de SFRP1 y β-catenina en LNCaP, DU145 y células PC3 tratadas con o sin 5Aza se examinaron. Entre ellos, LNCaP es una línea celular de cáncer de próstata humano dependiente de andrógenos, mientras que DU145 y PC3 se líneas celulares humanas de cáncer de próstata, que son más altamente maligno de células LNCaP-independientes de andrógenos. Con el grado maligno aumenta gradualmente, las proteínas y los niveles de mRNA de SFRP1 en las células de CaP tratados sin 5Aza disminuyeron significativamente, mientras que tanto la proteína y los niveles de ARNm de SFRP1 fueron reguladas en las células de CaP tratados con 5Aza (Figura 3A & amp;. 3B) . Sin embargo, el nivel de proteína de β-catenina se incrementó significativamente en las células de CaP tratados sin 5Aza, y se había reducido regulado en las células de CaP tratados con 5Aza (Fig. 3C). No se observó ninguna diferencia significativa del nivel de mRNA β-catenina en LNCaP, DU145 y células PC3 (Fig. 3D). En conjunto, estos resultados confirmaron que hubo una correlación inversa entre SFRP1 y expresión β-catenina en líneas celulares de CaP, que es coherente con los datos obtenidos a partir de muestras de tejido tumoral.
, LNCaP, DU145 y células PC3 A tratados con o sin 5Aza se recogieron y después se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-SFRP1. Se recogieron B, LNCaP, DU145 y PC3 células tratadas con o sin 5Aza y después se sometieron a ensayo de RT-PCR cuantitativa. La
SFRP1
nivel de ARNm de células LNCaP se establece en 1. C, LNCaP, DU145 y se recogieron las células PC3 tratadas con o sin 5Aza y después se sometió a análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-β-catenina. Se recogieron las células D, LNCaP, DU145 y PC3 tratadas con o sin 5Aza y después se sometieron a ensayo de RT-PCR cuantitativa. La
β-catenina nivel
mRNA de células LNCaP se estableció en 1. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los datos que se muestran en los gráficos son la media ± DE de tres experimentos. *,
P Hotel & lt; 0,05. ns: no significativo. La larga duración de transferencia de la figura. 3A se presenta en la figura S2.
Los cambios de
SFRP-1 | metilación de genes en líneas celulares de CaP
La metilación de
SFRP1
promotor del gen se ha informado que conduce a la regulación por disminución de la proteína SFRP1 y los niveles de mRNA, y que juegan un papel importante en la iniciación y el desarrollo de tumores. Dado que los niveles de proteína y ARNm de SFRP1 disminuyeron significativamente con el aumento del grado de malignidad, y 5Aza, un inhibidor de la metilación del ADN, hasta reguladas proteínas y los niveles de ARNm de SFRP1 en líneas celulares de CaP, se especuló que el silenciamiento SFRP1 era probable que sea inducida por
SFRP1
metilación del gen. Para investigar esta posibilidad, la metilación de
SFRP1
promotor del gen en LNCaP, DU145 y células PC3 tratadas con o sin 5Aza se examinó mediante ensayo de BSP. La metilación ocurre generalmente en CpG ricas regiones promotoras, isla CpG llamado con el tamaño de la isla & gt; 100, GC% & gt; 50, Obs /Exp & gt; 0,6. Bioinformática análisis mostró que 2 islas CpG metilados podrían estar en
SFRP1
promotor del gen (Fig. 4A, las regiones de color azul). BSP ensayo mostró que ambas islas CpG en el
SFRP-1 | promotor se metilado en LNCaP, DU145 y PC3 células. Las tasas de metilación de islas CpG 1 y 2 en las células LNCaP tratadas sin 5Aza fueron 32,5% y 2,7% respectivamente, mientras que ambas de las tasas de metilación se redujo a 9,3% y 1,1% después del tratamiento 5Aza (Fig. 4B). En las células DU145, las tasas de metilación de las islas CpG 1 y 2 se redujo de 36,7% y 85,6% a 12,6% y 47,9%, respectivamente, después del tratamiento 5Aza (Fig. 4C). En las células PC3, tanto de las tasas de metilación se redujo de 85% y el 71% a 38,3% y 44,1% después del tratamiento 5Aza (Fig. 4D). Estos resultados se corresponden con los datos obtenidos de análisis de transferencia Western (Fig 3A & amp;. 3B), lo que sugiere que la regulación a la baja de la proteína y los niveles de ARNm de SFRP1 fue inducida por
SFRP1
metilación de genes con el aumento de grado de malignidad de líneas celulares de CaP
a, diagrama esquemático de la región promotora SFRP-1 (regiones de color azul: islas CpG.). isla CpG 1 era de 1454 pb a 1613 pb. isla CpG 2 era de 1.831 pb a 2257 pb. B-D, la metilación de las islas CpG 1 (panel izquierdo) y la isla CpG 2 (panel derecho) en LNCaP, DU145 y PC3 células, respectivamente tratada con o sin 5Aza. Cada círculo representa un metilado (negro) o no metilado (blanco) dinucleótido CpG. Cada fila representa un clon diferente.
Discusión
CaP es el cáncer no cutáneo más comúnmente diagnosticado en hombres con una mayor tasa de incidencia de cada año [40-42]. Las características patológicas de CaP son inmensamente complejo [43]. Los tumores en muchos pacientes con CaP están en una forma indolente, que no tienen ningún efecto sobre la supervivencia de los pacientes y con frecuencia son objeto de vigilancia en lugar de un tratamiento inmediato, mientras que una pequeña proporción de tumores pertenecen a progresar rápidamente tumores malignos, que amenazan seriamente la vida de los pacientes [44,45]. Además, debido a las características fisiológicas y anatómicas de CaP, es difícil observar los primeros síntomas obvios de los pacientes, lo que lleva a un gran número de pacientes diagnosticados en una etapa avanzada [46]. Por lo tanto, es importante mejorar el diagnóstico precoz del CaP a través de la identificación de biomarcadores predictivos y pronósticos. En este estudio, hemos demostrado que el antagonista Wnt SFRP1 era un biomarcador predictivo y pronóstico favorable y su expresión se correlaciona inversamente con la expresión de β-catenina.
vía de señalización Wnt juega un papel importante en varios procesos celulares, tales como la diferenciación celular, la proliferación y la migración, y su desregulación correlaciona con varias enfermedades incluyendo el cáncer [47]. La vía de señalización /β-catenina Wnt está anormalmente activado en una amplia gama de tumores malignos humanos [48-54]. Esta activación aberrante contribuye a la tumorigénesis por hasta la regulación de la expresión de varios genes diana aguas abajo, como
MDR-1, de Livin, la ciclina D1
y
c-Myc
[15,55]. β-catenina es un componente central de la vía de señalización Wnt, y su localización alterado se reconoce como un marcador de la activación de la vía. Los datos de tinción inmunohistoquímica mostró que la localización β-catenina en muestras de hiperplasia benigna de próstata humanos fue localizado predominantemente en la membrana celular con los niveles de expresión de proteínas bajo (panel derecho Fig 2A.); sin embargo, en las muestras de CaP humanos, β-catenina localiza principalmente en el citoplasma y el núcleo con la cantidad de expresión de proteína más alta en comparación con la de las muestras benignas hiperplasia prostática (Fig. 2B panel derecho). Se ha informado de que β-catenina interactúa con AR y aumenta la actividad transcripcional estimulada por andrógenos de AR, lo que sugiere que el papel de β-catenina en la carcinogénesis de próstata puede no estar limitado a la activación transcripcional de TCF /LEF [56]. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de β-catenina fue positivo en el 47,5% de las muestras de CaP, mientras que sólo el 10% (1/10) la expresión positiva se observó en las muestras de la hiperplasia prostática benigna (Tabla 2). La expresión positiva de β-catenina en el CP también se correlacionó significativamente con la puntuación de Gleason, la tasa de supervivencia y la respuesta a la terapia endocrina (Tabla 1). Hemos demostrado que los pacientes con CaP expresión β-catenina positiva tuvieron una tasa de supervivencia global significativamente más pobre (fig. 1B). Por otra parte, la expresión de β-catenina significativamente hasta reguladas a medida que aumenta el grado de malignidad (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que la expresión de β-catenina está estrechamente relacionada con pronóstico más pobre, y que la activación aberrante de la vía de señalización Wnt contribuye al desarrollo del CaP.
SFRP1 ejerce su función en la vía de señalización Wnt como una antagonista del receptor de frizzled bien conocido, y ha sido sugerido para ser un supresor tumoral en varios cánceres humanos [57,58]. Los datos de tinción inmunohistoquímica demostraron que la localización de SFRP1 distribuye uniformemente en el citoplasma (panel izquierdo Fig. 2A), en consonancia con su expresión en varios otros tejidos [34,59]. Sin embargo, SFRP1 localización es predominantemente citoplasma perinuclear de las vías biliares y de la vejiga cáncer [16,60]. La diferencia en la distribución de SFRP1 puede ser debido a la expresión específica de tejido.