Extracto
miRNAs sangre circulante podría ser útil como un marcador biológico para detectar el cáncer de pulmón temprano. Se investigaron los niveles séricos de cuatro diferentes miRNAs en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y se evaluó su valor diagnóstico para el NSCLC. Las muestras de suero de 112 pacientes con CPNM y 104 controles (20 fumadores actuales sin cáncer de pulmón, 23 pacientes con neumonía, 21 pacientes con cáncer gástrico, y 40 controles sanos) fueron sometidos a reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa basada en sonda TaqMan (RT-PCR) . Los datos mostraron que los niveles séricos de miR-182, miR-183 y miR-210 se upregulated significativamente y que el nivel de miR-126 se downregulated significativamente en pacientes con CPNM, en comparación con los controles sanos. Más características operativas del receptor (ROC) análisis de la curva reveló que el suero de miR-182, miR-183, miR-210, o el nivel de miR-126 podría servir como un biomarcador de diagnóstico para la detección temprana CPNM, con una alta sensibilidad y especificidad. La combinación de estos cuatro miRNAs con el antígeno carcinoembrionario (CEA) se incrementó aún más el valor de diagnóstico, con un área bajo la curva (AUC) de 0,965 (sensibilidad, 81,3%, especificidad, 100,0%, y la exactitud, 90,8%) utilizando el modelo de regresión logística análisis. Además, los niveles relativos de suero de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 podían distinguir NSCLC o en etapa temprana CPNM de los fumadores actuales de tabaco sin cáncer de pulmón y neumonía o pacientes con cáncer gástrico con una alta sensibilidad y especificidad. Los datos del presente estudio validan que los cuatro miRNAs suero podrían servir como un biomarcador para el diagnóstico precoz de tumores NSCLC
Visto:. Zhu W, Zhou K, Zha Y, Chen D, J Él, Ma H, et al . (2016) Valor diagnóstico de suero de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 niveles en pacientes con estadio temprano de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 11 (4): e0153046. doi: 10.1371 /journal.pone.0153046
Editor: Canción Guo Zheng, Penn State University, Estados Unidos |
Recibido: 28 Octubre, 2015; Aceptado: 21 Marzo de 2016; Publicado: 19 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Zhoushan (# 2011C12039,#2011C12040) para YKZ y WYZ, la Oficina médica de la provincia de Zhejiang (# 2015ZDA032,#2016143029) para HBL y WYZ, la Oficina del Ministerio de Salud-Médico de la provincia de Zhejiang (# WKJ2014-2-021) para YKZ, y el Programa Provincial de Zhejiang para el cultivo de talentos innovadores de salud de alto nivel a XGL. Estos organismos de financiación no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo, y hasta un 85% de cáncer de pulmón se clasifica como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [1]. Hasta la fecha, más del 75% de los pacientes con CPNM se diagnostican en estadios avanzados o metastásicos de la enfermedad, lo que resulta en una tasa de supervivencia global pobre de menos del 15% [1]. No resecable NSCLC también conduce a una alta tasa de recurrencia del tumor después de la quimio-radioterapia, contribuyendo así a una pobre supervivencia [1]. Por el contrario, la tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con CPNM estadio patológico IA alcanza actualmente al 83,9% y la de CPCNP en estadio IB es de aproximadamente 66,3% [2]. Por lo tanto, la detección temprana sigue siendo la clave para mejorar la supervivencia de los pacientes con CPNM. Hasta la fecha, el diagnóstico de CPCNP en estadio inicial se basa principalmente en la tomografía computarizada, resonancia magnética, tomografía por emisión de positrones, la citología de esputo, o el examen histológico de los tejidos de broncoscopia [3]. Estas técnicas son caras o, en general no es práctico para la detección temprana NSCLC en una gran cohorte de la población. Por lo tanto, el desarrollo de un biomarcador arterial no invasiva o mínimamente invasiva, tal como ADN [4], los genes metilados de circulación de la sangre [5], las células tumorales, o microRNAs (miRNAs), podría proporcionar un nuevo enfoque para la detección clínica temprana de NSCLC . Por otra parte, el desarrollo de marcadores biológicos más estables, sensibles y específicos podría proporcionar un fácil de utilizar y herramienta precisa para los médicos en el diagnóstico del cáncer antes de lo que es posible en la actualidad.
miARN es una clase de no codificantes ARN pequeños de hasta 24 nucleótidos de longitud que es muy estable en la circulación de la sangre; por lo tanto, podría ser útil para la detección NSCLC, proporcionando una alta sensibilidad y especificidad [6, 7]. De hecho, varios estudios previos han demostrado que los niveles de miRNAs circulantes están alterados en los pacientes con NSCLC, en comparación con los individuos sanos [8-12]. Por ejemplo, Mitchell
et al
. [8] en 2008 informó por primera vez que el suero de miR-141 está regulada positivamente en el cáncer de próstata, lo que sugiere que podría distinguir a los pacientes con cáncer de próstata de los controles sanos. Además, Markou
et al
. [9] han descrito niveles alterados de tres miRNAs circulantes (es decir, el miR-21, miR-10a y miR-30e-5p) en pacientes con CPNM y demostró su potencial utilidad en la detección de NSCLC. Otros estudios analizaron adicionalmente la sensibilidad y la especificidad de diferentes miRNAs en el diagnóstico de NSCLC de estadio temprano [6, 10]. Por ejemplo, Tang
et al
. [11] han demostrado que la combinación de miR-21, miR-155 y miR-145 era un biomarcador adecuado para distinguir a los pacientes de NSCLC de los controles, ya que produjo una sensibilidad de 76,5%, una especificidad del 81,3% y un área bajo la curva (AUC) de 0,87. Un estudio adicional evaluó la dinámica de suero de miR-21 y miR-24 en pacientes con CPNM pre y post-operatorias como biomarcadores para predecir la efectividad del tratamiento [12]. En general, el uso de un panel de miRNAs aumenta la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico diferencial de las primeras etapas del CPNM, ya que la expresión de los genes miARN se altera en una serie de enfermedades incluyendo cáncer, enfermedades infecciosas, o incluso individuos sanos que fuman tabaco. Por lo tanto, en este estudio, se validó estos cuatro miRNAs como está mal regulada específicamente en el suero de pacientes con NSCLC [9, 13-15] y exploramos su valor en el diagnóstico precoz y diferencial de la enfermedad. Este estudio demuestra que el uso de un conjunto de miRNAs proporciona una herramienta de diagnóstico útil para el diagnóstico precoz del NSCLC.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Un total de 221 de sangre Las muestras que cumplen los criterios de elegibilidad fueron recogidos desde el hospital de Zhoushan, provincia de Zhejiang, china, entre enero de 2011 y septiembre de 2014. Estas muestras incluyeron 112 pacientes con CPNM, 20 fumadores actuales sin cáncer de pulmón, 23 pacientes con neumonía, 21 pacientes con cáncer gástrico y 40 sanos controles. Pulmón y cánceres gástricos se diagnosticaron histológicamente y confirmado por dos patólogos, de acuerdo con los criterios de la Red Nacional Integral del Cáncer [16, 17]. Los pacientes con neumonía fueron diagnosticados sobre la base de las manifestaciones clínicas, el cultivo bacteriano del esputo, y los hallazgos radiológicos. Todos los pacientes tenían sin historia previa de la terapia, incluyendo la cirugía, la quimioterapia, radioterapia o terapia con antibióticos. Los pacientes y sujetos control estaban libres de otras enfermedades concomitantes, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la diabetes, la hipertensión, el asma, la hepatitis, la tuberculosis y trastornos neurológicos o psiquiátricos. La Tabla 1 resume las características clínico-patológicas de los sujetos de estudio. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Zhoushan China. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. Todos los participantes eran de la etnia han china.
Las muestras de sangre se recogieron de todos los participantes temprano en la mañana. Los sueros se separaron inmediatamente después de la recogida de sangre y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Los técnicos de laboratorio fueron cegados a la identidad del paciente. Un método de quimioluminiscencia se utilizó para medir miARN en el suero. Como parte de la evaluación clínica de rutina, los datos relativos a los niveles de antígeno carcinoembrionario (CEA) se determinó a partir de los registros médicos de los pacientes del hospital de Zhoushan.
Suero Preparación, Aislamiento de ARN y cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa-reacción en cadena ( RT-PCR)
para obtener muestras de suero, 10 ml de sangre periférica se introduce en tubos de gel por separado y después se sometió a los 30 minutos de centrifugación a 1500
g
durante 10 min a 4 ° C . Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de 1,5 ml y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Para detectar la expresión de los genes miARN, 600 l de la muestra de suero de cada participante se sometió a aislamiento de ARN usando un kit de aislamiento de ARN mirVana PARIS (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies) y un gel de poliacrilamida desnaturalizado 15%. Las muestras de ARN se sometieron a una reacción de transcripción inversa usando un TaqMan MicroARN Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, qPCR se llevó a cabo en las muestras de suero por triplicado utilizando TaqMan 2 × PCR Universal Master Mix sin AmpErase UNG (Applied Biosystems) en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems). condiciones de amplificación qPCR se fijaron a un ciclo inicial de 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Los valores de ciclo umbral (Ct) se calcularon usando el software SDS 2.0.1 (Applied Biosystems). No plantilla controles se utilizaron en cualquiera de las fases RT PCR o para asegurar la amplificación específica de la diana. Los miARN control fue U6 pequeños ARN nucleares (snRNA), de acuerdo con un estudio previo [18]. Los niveles de expresión promedio de miARN de suero se calcularon utilizando la 2
-ΔCt método relativo a la media de U6 snRNA [19]. Para determinar el factor de cambio de miRNAs destino relativas a miRNAs expresó en los controles normales, la expresión se utilizó 2
-ΔΔCt [20]. Se calculó el valor medio de los cuatro Ct miRNAs, con exclusión de los valores atípicos (es decir, se replica con Ct difieren en más de un ciclo de la mediana). Además, si el valor medio Ct para U6 no era entre 20 y 32 ciclos, el ensayo se repitió al menos una vez en algunas de las muestras. Las muestras con niveles bajos de ARNsn U6 no se incluyeron para el análisis de datos en este estudio.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) y MedCalc software 9.0 (MedCalc software Inc., Mariakerke, Bélgica). Los datos se examinaron de acuerdo con el grado de homogeneidad. El desapareado
t
o la prueba de Mann-Whitney se utilizó para analizar las diferencias entre los sujetos y los controles o la correlación entre los niveles de expresión de los genes miARN y características clínico-patológicas de los pacientes. (ROC) curvas características de funcionamiento del receptor se generaron para evaluar la precisión diagnóstica de cada parámetro. El mejor par sensibilidad /especificidad fue seleccionado en base a la máxima Índice de Youden. Los valores de AUC también se calcularon y compararon mediante un enfoque no paramétrico [21]. Se realizó un análisis de regresión logística múltiple para evaluar la precisión diagnóstica de la combinación de miRNAs en suero en pacientes con CPNM. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y un
P valor
≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Expresión diferencial de suero miRNAs en diferentes enfermedades y controles sanos
sobre la base de estudios previos [9, 13-15, 22], se seleccionaron y evaluaron cuatro miRNAs suero desregulados en 216 muestras (es decir, 112 pacientes con CPNM, 23 pacientes con neumonía, 21 pacientes con cáncer gástrico, 20 fumadores actuales sin cáncer de pulmón, y 40 controles sanos). Nuestros datos muestran que los niveles de miR-182, miR-183 y miR-210 se upregulated significativamente en el suero de pacientes con CPNM, en comparación con los de los controles sanos por edad y sexo (
P & lt;
0,0001, 0,0181, y 0,0299, respectivamente), mientras que el suero de los niveles de miR-126 se redujo significativamente en los pacientes con CPNM (
P & lt; 0,0001
; Fig. 1)
los gráficos muestran puntos -plots de medianas y rangos intercuartiles de registro
valores de cada miARN-2 transformaron en sueros de 112 pacientes con CPNM (
negro
) y 40 controles sanos (
gris
). U6 snRNA se utilizó como referencia.
Los valores P Red de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 eran
& lt;
0,0001, 0,0181, 0,0299, y & lt; 0,0001, respectivamente, mediante la prueba de Mann-Whitney. *
P Hotel & lt; 0,05 entre pacientes y controles.
circulantes en suero miARN distingue con CPNM pacientes de neumonía pacientes, pacientes con cáncer gástrico, y los fumadores de tabaco
Hemos encontrado que los niveles relativos de suero de miR-183 y miR-210 de expresión se aumentó en los pacientes con NSCLC, en comparación con las de los fumadores (
P & lt; 0,0001 y 0,0024
, respectivamente). Los niveles séricos de miR-182, miR-183 y miR-210 también se incrementaron en los pacientes con CPNM, en comparación con las de los pacientes con neumonía (
P = 0,0197
, 0,0400, 0,0278 y, respectivamente); mientras que el nivel sérico de miR-182 se redujo en los pacientes con CPNM, en comparación a la de los pacientes con cáncer gástrico. Además, el nivel sérico de miR-183 se incrementó en los pacientes con cáncer gástrico en comparación con CPNM (
P & lt; 0,0001 y 0,0351
, respectivamente).
87 en etapa temprana (0 y yo) los pacientes con CPNM, los niveles séricos de miR-182, miR-183 y miR-210 se incrementaron significativamente, en comparación con las de los fumadores (
P = 0,0015
, & lt; 0,0001 y 0,0006, respectivamente ); También se incrementaron los niveles séricos de miR-183 y miR-210, mientras que el nivel de miR-126 se redujo, en comparación con los pacientes con neumonía (
P = 0,0293
, 0,0142, 0,0113 y, respectivamente). Los niveles séricos de miR-183 y miR-210 también se incrementaron y el nivel sérico de miR-182 se redujo, en comparación con las de los pacientes con cáncer gástrico (
P = 0,0239
, 0,0048, y & lt; 0,0001 , respectivamente; Fig 2). Sin embargo, no hubo una diferencia obvia en los niveles séricos de estos cuatro miRNAs (miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126) entre la fase inicial y los pacientes con CPNM en etapa tardía (
P
= 0,0724, 0,2874, 0,2991, y 0,4754, respectivamente).
Los niveles séricos de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 se evaluaron en 112 pacientes con CPNM, 20 fumadores actuales , 23 pacientes con neumonía, y 21 pacientes con cáncer gástrico mediante QRT-PCR. U6 snRNA se utilizó como referencia. *
P Hotel & lt; 0,05 entre los grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney.
A principios valor de detección del suero miRNAs Cuatro de los pacientes con CPNM vs controles sanos
A continuación, se realizó un análisis de la curva ROC para evaluar la valor diagnóstico de estos cuatro miRNAs circulantes suero y CEA. En primer lugar, hemos identificado un valor de corte que distinguía a 112 pacientes con CPNM de 40 sexo sano y controles emparejados por edad. Los datos de la curva ROC mostraron que los cuatro de estos miRNAs podría distinguir los pacientes con CPNM de los controles. En concreto, el nivel sérico de miR-182 tuvo una sensibilidad del 63,4% y una especificidad del 80,0% para diferenciar los pacientes con CPNM de los controles sanos, con una AUC de 0,734 en el punto de corte óptimo (
P & lt;
0,0001, 95% intervalo de confianza [IC]: desde 0,657 hasta 0,803). miR-183 tuvo una sensibilidad del 41,1% y una especificidad del 82,5%, con una AUC de 0,626 (
P = 0,0091
, IC del 95%: 0,544 a 0,703). miR-210 tuvo una sensibilidad del 33,9% y una especificidad del 100,0%, con una AUC de 0,616 (
P = 0,0121
, IC del 95%: 0,534 hasta 0,694). miR-126 tuvo una sensibilidad del 60,7% y una especificidad del 92,5%, con una AUC de 0,793 (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,719-0,854). CEA tuvo una sensibilidad del 55,4% y una especificidad del 77,5%, con una AUC de 0,711 (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,632 a 0,782; Figura 3). Clínicamente, el nivel de CEA en suero se utiliza rutinariamente para la detección del cáncer. De este modo, se comparó la AUC de CEA con el de los cuatro miRNAs y encontramos que el valor diagnóstico de la CEA no fue significativamente diferente de los de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 (
P
= 0,7290, 0,2056, 0,1818, y 0,1271, respectivamente). Sin embargo, los valores predichos de análisis de regresión logística mostró que el análisis ROC combinado de estos cuatro miRNAs además CEA revelaron un valor de ABC aumentó de 0,965, con una sensibilidad del 81,3%, una especificidad del 100,0% y una precisión del 90,8% (
P Hotel & lt; 0,0001, IC del 95%: 0,923-0,988; la figura 3 y en la Tabla 2). El análisis multivariante de regresión logística de la curva ROC de estos cuatro miRNAs más CEA se muestra en la Tabla S1.
El
P
valores de suero de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 y CEA, así como el valor predictivo de regresión logística fueron
& lt;
0,0001, 0,0091, 0,0121, & lt; 0,0001, & lt; 0,0001, y & lt; 0,0001, respectivamente.
Por otra parte, se utilizó el análisis de la curva ROC para evaluar el valor diagnóstico de estos cuatro miRNAs entre el 87 de etapa temprana CPNM (fase 0 y I) y 40 pacientes por sexo y emparejados por edad controles sanos. Los datos mostraron que los niveles séricos de miR-182 tuvieron un AUC de 0,781, con una sensibilidad del 67,8% y una especificidad del 85,0% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,699-0,849); miR-183 tenía una AUC de 0,638, con una sensibilidad del 41,4% y una especificidad del 82,5% (
P = 0,0065
, IC del 95%: 0,548 hasta 0,721); miR-210 tenía una AUC de 0,650, con una sensibilidad del 35,6% y una especificidad del 100,0% (
P = 0,0019
, IC del 95%: 0,561 a 0,721); miR-126 tenía una AUC de 0,845, con una sensibilidad del 62,1% y una especificidad del 97,5% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,770-0,903); mientras que el CEA tenía una AUC de 0,648, con una sensibilidad del 63,2% y una especificidad del 62,5% (IC del
P = 0,0045
, 95%: 0,558-0,731; la figura 4). El AUC de miR-126 fue más amplio en comparación con la de CEA (
P = 0,0012
). Sin embargo, los valores de AUC de miR-182, miR-183 y miR-210 no eran diferentes de las AUC de CEA (
P = 0,0589
, 0.8855, 0.9796 y, respectivamente). Además, los valores de predicción de los análisis de regresión logística mostró que el análisis ROC combinado de estos cuatro miRNAs además CEA muestran un valor de ABC aumentó de 0.975, con una sensibilidad del 88,5%, una especificidad del 92,5% y una precisión del 91,3% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,930 hasta 0,994; figura 4 y Tabla 2). El análisis multivariado de regresión logística de la curva ROC de estos cuatro miRNAs y CEA se muestra en la Tabla S1.
El
Los valores P
del nivel sérico de miR-182, miR-183, miR 210, miR-126 y CEA, así como el valor predictivo de regresión logística fueron & lt; 0,0001, 0,0065, 0,0019, & lt; 0,0001, 0,0045, y & lt; 0,0001, respectivamente.
Valor diagnóstico de estos cuatro miRNAs séricos más CEA en pacientes con CPNM frente a otros grupos de enfermedades
Las curvas ROC se construyeron para evaluar el valor diagnóstico de la expresión relativa (2
-ΔΔCt) de estos cuatro miRNAs más CEA en el diagnóstico de NSCLC. Los datos mostraron que los niveles de miR-182, miR-183 y miR-210 fueron significativamente distinta entre los pacientes con CPNM y los fumadores de tabaco, con AUC de 0,764, 0,781 y 0,714; sensibilidad de 71,4%, 71,4% y 50,9%; y las especificidades de 90,0%, 80,0% y 90,0%, respectivamente (
P & lt; 0,0001
,
& lt;
0,0001, y 0,0001; IC del 95%: 0,683-0,834, 0,701-0,848 , y 0,629 a 0,789; Fig 5), mientras que los niveles de miR126 y CEA tenía ninguna diferencia obvia en AUC para distinguir NSCLC y los fumadores de tabaco (
P
= 0,1322, 0,5053; Fig 5). Por otra parte, la combinación de estos cuatro miRNAs y CEA tenía una AUC de 0,861, con una sensibilidad del 83,0% y una especificidad del 80,0% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,790 hasta 0,915; la figura 5 y S2 Tabla).
el
los valores P Red de suero de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 y CEA, así como el valor predictivo de regresión logística se
& lt; 0,0001
, & lt; 0,0001, 0,0001, 0,1322, 0,5053, y & lt; 0,0001, respectivamente.
En las primeras etapas del CPNM, los datos mostraron que los niveles de miR-182, miR-183 y miR-210 fueron significativamente distinta entre los pacientes con CPNM y los fumadores de tabaco, con AUC de 0,728, 0,787, y 0,748; sensibilidad de 67,8%, 74,7% y 55,2%; y las especificidades de 90,0%, 80,0% y 90,0%, respectivamente (
P & lt; 0,0001
,
& lt; 0,0001
, y
& lt; 0,0001
; IC del 95% : 0,634 a 0,810, 0,698 hasta 0,861, y 0,655 a 0,827; S1 figura), mientras que los niveles de miR-126 y CEA no tenían ninguna diferencia obvia en el AUC para distinguir NSCLC y los fumadores de tabaco (
P = 0,1205
, 0,4240; S1 figura). Por otra parte, la combinación de estos cuatro miRNAs además CEA tenía una AUC de 0,842, con una sensibilidad del 86,2% y una especificidad del 70,0% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,759 hasta 0,905; Fig S1 y S2 Tabla).
Además, las curvas ROC reveló que los niveles de suero de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 fueron capaces de distinguir NSCLC de neumonía, con AUC de 0,655 , 0.636, 0.646, y 0.679; sensibilidad de 61,6%, 70,5%, 93,8% y 52,7%; y las especificidades de 73,9%, 56,5%, 39,1% y 87,0%, respectivamente (
P = 0,0061
, 0,0259, 0,0350, 0,0002, IC del 95%: 0,568 a 0,735, 0,549 hasta 0,717, 0,559 hasta 0,726, 0,593 a 0,756; Fig 6). Sin embargo, el nivel de CEA no tenía ninguna diferencia obvia en el AUC para distinguir NSCLC y neumonía (
P = 0,1914
; la figura 6). Por otra parte, el valor diagnóstico de la combinación de los cuatro miRNAs además CEA tenía una AUC de 0,861, con una sensibilidad del 48,2% y una especificidad del 82,6%, para distinguir NSCLC de neumonía (
P = 0,0031
, 95 % IC: 0,586-0,750; la figura 6 y en la Tabla S3)
El
Los valores P Red de suero de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 y CEA como. así como el valor predictivo de regresión logística fueron 0,0061, 0,0259, 0,0350, 0,0002, 0,1914, y 0,0031, respectivamente.
En las primeras etapas del CPNM, los datos mostraron que los niveles de miR-182, miR-183, miR-210, miR126a, y CEA producida AUC de 0,618, 0,648, 0,667, 0,672 y 0,676, con una sensibilidad de 56,3%, 78,2%, 94,3%, 56,3% y 56,3% y especificidad de 73,9%, 52,2%, 39,1%, 87,0% y 73,9%, respectivamente, para distinguir NSCLC de neumonía (
P = 0,0487
, 0,0182, 0,0145, 0,0006, y 0,0059; IC del 95%: 0,521 a 0,709, 0.552- 0,737, 0,571 a 0,754, 0,576-0,759 y 0,580-0,762; S2 figura). La combinación de estos cuatro miRNAs además CEA produjo una AUC de 0,731, con una sensibilidad del 62,1% y una especificidad del 73,9% (
P & lt; 0,0001
, IC del 95%: 0,638-0,811; S2 y S3 figura Tabla).
también se analizaron las AUC entre NSCLC y cáncer gástrico, es decir, el miR-182, miR-183 y miR-210 mostraron AUC de 0,848, 0,645 y 0,661, con una sensibilidad de 69,6%, 70,5% y 56,3% y especificidades de 90,5%, 66,7% y 76,2%, respectivamente, para distinguir NSCLC de cáncer gástrico (
P & lt; 0,0001
, 0,0241, 0,0063 y; IC del 95%: 0.775- 0,904, 0,558 a 0,726, y 0,574 hasta 0,741, respectivamente; figura 7). La combinación de estos cuatro miRNAs más CEA mostró un AUC de 0,972, una sensibilidad del 97,3% y una especificidad del 85,7% para distinguir NSCLC de cáncer gástrico (
P & lt; 95% CI;
0,0001: 0.928- 0,993; figura 7 y Tabla S4)
el
P
valores de suero de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 y CEA, así como el valor predictivo. de regresión logística fueron & lt; 0,0001, 0,0241, 0,0063, 0,3961, 0,0744, y & lt; . 0,0001, respectivamente
En las primeras etapas del CPNM, las curvas ROC mostraron miR-182, miR-183, miR-210 y CEA con AUC de 0,826, 0,660, 0,699, y 0,706; sensibilidad de 66,7%, 73,6%, 66,7% y 83,9%; y las especificidades de 90,5%, 66,7%, 71,4% y 57,1%, respectivamente, para distinguir NSCLC de cáncer gástrico (
P & lt; 0,0001
, = 0,0150, 0,0009, y 0,0016; IC del 95%: 0.741- 0,892, 0,562 hasta 0,748, 0,603-0,783 y 0,611-0,790 respectivamente; S3 figura). La combinación de estos cuatro miRNAs y CEA mostró una AUC de 0,976, una sensibilidad del 94,3% y una especificidad del 90,5% para distinguir NSCLC de cáncer gástrico (
P & lt; 0,0001
; IC del 95%: 0.927- 0,996;. S3 figura y la Tabla S4)
suero miRNAs y NSCLC patología clínica
En cuanto a la patología clínica de CPCNP, se encontró asociación significativa entre los niveles séricos de los cuatro miRNAs y estado de fumar tabaco, la metástasis de los ganglios linfáticos, el subtipo histológico del tumor, el tamaño del tumor o el estadio patológico (
P & gt; 0,05
; datos no mostrados).
Discusión
miRNAs suero son útiles como nuevos biomarcadores tumorales para varios tipos de cáncer humano, pero existe una variación significativa en los datos entre los diferentes estudios de la misma enfermedad [23]. La variación se atribuye en gran parte a diferentes poblaciones de estudio, la falta de controles endógenos estándar para los miRNAs estudiados [24], la edad, el tamaño limitado de la muestra [25], y la diversidad funcional de miRNAs [26]. Por lo tanto, la validación de los niveles séricos de miARN es esencial para la futura aplicación en el diagnóstico de enfermedades. Por otra parte, los estudios anteriores se han centrado en el valor diagnóstico de miRNAs entre los pacientes con CPNM y controles sanos [14, 19, 25] que circula. Sin embargo, pocos estudios han informado sobre el valor diagnóstico de miRNAs que circula entre los pacientes con CPNM y los fumadores, pacientes con neumonía u otras personas con otras enfermedades malignas. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos detectado los niveles séricos de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 en pacientes con CPNM a la luz de nuestros estudios anteriores y aquí la bibliografía [9, 13, 14, 22] . Nuestros resultados demuestran que estos cuatro miRNAs son biomarcadores tumorales potenciales para el diagnóstico de NSCLC. Específicamente, se encontró que los niveles de miR-182, miR-183 y miR-210 se incrementaron significativamente en los sueros de pacientes con CPNM, mientras que los niveles de miR-126 se redujo significativamente en el suero de pacientes con CPNM, en comparación con los sanos controles. Los análisis de la curva ROC reveló que el miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 o solo era útil como biomarcador tumoral para la detección precoz del NSCLC, con una alta sensibilidad y especificidad. La combinación de estos cuatro miRNAs con CEA aumenta aún más el valor de diagnóstico, con una AUC de 0,965 (sensibilidad del 81,3%, una especificidad del 100,0%, y la precisión de 90,8%). Por otra parte, los datos también mostraron que los niveles de expresión relativa de suero de miR-182, miR-183, miR-210 y miR-126 permitieron la diferenciación de NSCLC o pacientes con CPNM en estadio temprano de los fumadores actuales, así como de los pacientes con neumonía o cáncer gástrico, con una alta sensibilidad y especificidad. En conclusión, nuestros datos actuales indican que los cuatro miRNAs suero podrían servir como biomarcadores tumorales para la detección precoz del NSCLC.
A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en reportar el uso de suero combinado de miR -182, el miR-183, miR-210 y miR-126 niveles para diferenciar las primeras etapas de NSCLC de controles sanos, fumadores actuales, y la neumonía o pacientes con cáncer gástrico. De hecho, de forma individual, un estudio previo ha demostrado que los niveles séricos de miR-182 y miR-183 fueron elevados en pacientes con NSCLC, en comparación con los controles sanos [13]. Tanto el miR-182 y miR-183 pertenecen a la familia de miR-183 y actúan como onco-miRNAs en la tumorigénesis humana a través de la promoción del crecimiento de células tumorales y la migración por la orientación del crecimiento temprano factor de transcripción proteína de respuesta 1 [27, 28]. Un meta-análisis previo ha puesto de manifiesto que la expresión de los miembros de la familia miR-183 está regulada positivamente en muchos tipos de cáncer humano, en el que el NSCLC está clasificado en tercer lugar [29]. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos que demuestran que la expresión de miR-182 y miR-183 se aumenta no sólo en los tejidos tumorales de pulmón, sino también en el suero de pacientes con NSCLC [13]. Zheng
et al
. [30] han demostrado que el plasma de miR-182 es significativamente mayor en los pacientes con CPNM, pero no distinguió CPCNP en estadio I de los controles sin cáncer. Además, Abd-El-Fattah
et al
. [31] han demostrado que el miR-182 es elevada en pacientes con NSCLC o neumonía. Sin embargo, en contraste con nuestros resultados indican que el suero de miR-126 y miR-183 niveles fueron alterados entre la etapa 0 y I NSCLC, Lin
et al
. [32] han demostrado diferencias significativas en el suero de miR-126 y miR-183 niveles entre los pacientes con CPCNP en estadio IV y controles; mientras que en la fase I /II pacientes con CPNM, el miR-126 y miR-183 niveles se mantuvieron estables y consistentes. La razón de esta discrepancia es desconocida, pero puede estar relacionado con el tamaño limitado de la muestra y las poblaciones de estudio. Además, el nivel de miR-126 se downregulated en NSCLC en comparación con tejidos pulmonares cancerosos debido al hecho de que el miR-126 participa en la angiogénesis tumoral por la orientación de la expresión de vascular factor de crecimiento endotelial-A [33, 34]. Upregulated miR-126 también inhibe la adhesión de células tumorales, la migración y la invasión, que puede mediar parcialmente Crk expresión [35]. En nuestro estudio, hemos demostrado que el miR-126 se downregulated en sueros de pacientes con CPNM, en consonancia con un estudio previo [15]. Además, el miR-210 ha sido llamado "el micromanager de la vía de hipoxia" y está implicada en el crecimiento del tumor, la apoptosis y la angiogénesis [36]. Por otra parte, se ha informado de miR-210 que aumentarse en los tejidos tumorales de pulmón y esputo de pacientes con NSCLC [37, 38]. En el presente estudio, hemos demostrado la regulación positiva de miR-210 en suero en pacientes con CPNM, que puede actuar como un desarrollo onco-miARN en el CPNM.
Aunque el análisis de estos cuatro miRNAs se ha informado anteriormente, su valor diagnóstico de CPNM distinguir de otras enfermedades o condiciones, tales como el fumar tabaco actual, neumonía u otros tipos de cáncer, no se ha evaluado hasta la fecha. Nuestro estudio reveló que los niveles de miR-182, miR-183 y miR-210 en el CPNM o en etapa temprana CPNM fueron significativamente diferentes de las de los fumadores de tabaco, así como los pacientes con neumonía o cáncer gástrico, y mostraron un alto sensibilidad y especificidad. El nivel sérico de miR-126 era capaz de distinguir NSCLC de neumonía, mientras que los niveles séricos de CEA no tenían esa capacidad de distinguir de otras enfermedades NSCLC. Por lo tanto, estos cuatro miRNAs podrían tener el potencial para seguir evaluándose como biomarcadores para el diagnóstico precoz del NSCLC. Además, la combinación de estos cuatro miRNAs con CEA aumentó notablemente el valor AUC, con una alta sensibilidad y especificidad, lo que sugiere su posible papel en el diagnóstico temprano de NSCLC. Además, los estudios anteriores han demostrado que estos cuatro miRNAs se expresan diferencialmente en los sueros de otras enfermedades individualmente, pero no ha habido ningún estudio que reporta el uso de su combinación como un biomarcador para una enfermedad. Unos pocos ejemplos de estos miRNAs en la literatura son los siguientes: Li
et al
. [39] han demostrado que los niveles séricos de miR-182, miR-183 y miR-210 fueron mayores en las mujeres embarazadas con preeclampsia en su tercer trimestre de embarazo, en comparación con los controles. Además, Chen
et al
. (2
-ΔΔCt).
doi:10.1371/journal.pone.0153046.s007
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Acknowledgments
This