Extracto
Numerosos cambios en los mecanismos epigenéticos se han descrito en varios tipos de tumores. En búsqueda de nuevos biomarcadores, se determinó la expresión del grupo Polycomb (PcG) EZH2 proteínas, Bmi1 y SUZ12 y modificación de las histonas asociadas H3K27me3 en el cáncer colorrectal. La expresión nuclear de las proteínas PcG y modificación de las histonas H3K27me3 eran inmunohistoquímica (IHC) manchada en una micromatriz de tejido (TMA), incluyendo 247 tejidos tumorales y 47 tejidos normales, y obtuvo utilizando el sistema de semi-automatizado Ariol. Los tejidos tumorales mostraron una mayor expresión de EZH2 (p = 0,05) y H3K27me3 (p & lt; 0,001) en comparación con sus homólogos normales. análisis combinados tendencia marcador indica que un aumento en el número de marcadores que muestran alta expresión se asoció con un mejor pronóstico. Alta expresión de los cuatro marcadores en el marcador combinado análisis se correlacionó con la mejor supervivencia de los pacientes y la supervivencia más larga libre de recidiva, con una supervivencia global (p = 0,01, HR 0,42 (0,21 hasta 0,84)), la supervivencia libre de enfermedad (p = 0,007, HR 0,23 (0,08 hasta 0,67) y el local de la supervivencia libre de recidiva (p = 0,02, HR 0,30 (0,11-0,84)). en conclusión, se encontró que la expresión de las proteínas PcG y H3K27me3 demostró valor pronóstico en nuestra cohorte de estudio. Mejor estratificación de los pacientes se obtuvo mediante la combinación de los datos de expresión de los biomarcadores investigadas en comparación con los marcadores individuales, lo que subraya la importancia de la investigación de marcadores múltiples simultáneamente
Visto:. Un Benard, Goossens-IJ Beumer, van Hoesel AQ, .. Horati H, H Putter, Zeestraten ECM, et al (2014) Valor pronóstico de la Polycomb proteínas EZH2, IMC1 y SUZ12 y histona modificación H3K27me3 en cáncer colorrectal PLoS ONE 9 (9):. e108265 doi: 10.1371 /journal.pone. 0108265
Editor: Richard L. Eckert, de la Universidad de Maryland Escuela de Medicina de los Estados Unidos de América
Recibido: 25 de abril, 2014; Aceptado: August 20, 2014; Publicado: 22 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Benard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
los nuevos biomarcadores pronósticos están garantizados en el cáncer colorrectal que podrían mejorar las decisiones para el tratamiento de los pacientes individuales, además de la TNM actual (Comité Conjunto sobre el cáncer, AJCC [1]) sistema de estadificación , ya que incluso los pacientes con la misma clasificación TNM presentes con grandes diferencias en la supervivencia y el tumor del paciente recurrencia [2], [3]. Los mecanismos epigenéticos han sido identificados como factores desregulados frecuencia en los tumores y son objetivos atractivos para la investigación de biomarcadores, debido a su papel en la regulación de la expresión génica y su naturaleza potencialmente reversible. Numerosos cambios en la metilación del DNA, las modificaciones de histonas y sus enzimas modificadoras se han descrito en varios tipos de tumores, incluyendo el cáncer colorrectal [4] - [6]. En este estudio, nos centramos en la expresión de las enzimas modificadoras de histonas del grupo Polycomb (PcG) y su modificación de las histonas asociadas, trimethylation de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), en tejidos de cáncer colorrectal.
La PcG proteínas actúan en grandes varios complejos de proteínas, los llamados complejos Polycomb represivas (PRC) 1 y 2 [7]. proteínas PcG juegan un papel importante en el desarrollo embrionario y la proliferación celular [8], [9], y también están implicados en la inducción epitelial-mesenquimal transición (EMT) [10]. La expresión aberrante de varias proteínas y correlaciones con los resultados del paciente PcG han sido reportados en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, la expresión de BMI1 oncogén dedo anular Polycomb (BMI1), un componente de PRC1 y un factor importante en las células madre [11], [12], se encontró que se correlaciona con el resultado del paciente en varios tipos de cáncer [13] - [dieciséis]. Potenciador de zeste homólogo 2 (EZH2), una proteína clave en el complejo PRC2, también se encontró que tienen valor pronóstico en varios tipos de cáncer [17] - [20]. SUZ12 Polycomb represivas complejo subunidad 2 (SUZ12), otro componente clave del complejo PRC2, se encontró que tienen funciones promotores de tumores en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon [21] - [23]. Se encontró que la modificación de las histonas asociadas H3K27me3 ser superiores expresados en los tejidos tumorales, y que se asocia con un mejor pronóstico en el cáncer no microcítico de pulmón de células [24] y el cáncer de mama [19].
El uso de la tinción inmunohistoquímica (IHC ) y la puntuación semiautomático, se estudió la expresión de las proteínas PcG EZH2, Bmi1 y SUZ12 y su modificación de las histonas asociadas H3K27me3 en una cohorte de 247 pacientes con cáncer de estadio TNM colorrectal I-III, en correlación con el resultado clínico. Como las proteínas PcG actúan juntos en la misma modificación de las histonas, la hipótesis de la combinación de los cuatro marcadores sería más informativo con respecto a los resultados clínicos en comparación con cada uno de los marcadores individuales.
Materiales y Métodos
selección de pacientes
los tejidos tumorales se obtuvieron de una serie consecutiva de 408 pacientes con cáncer colorrectal que fueron sometidos a resección quirúrgica del tumor primario en el Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) entre 1991 y 2001. los pacientes que se sometieron preoperatorio tratamiento, que tenía tumores bilaterales, o un historial de cáncer que no sea el carcinoma de células basales o
tumores in situ
, fueron excluidos de los análisis del estudio. Además, se incluyeron sólo los pacientes con un diagnóstico histológico de carcinoma colorrectal estadio TNM I a III, según lo determinado por un patólogo experimentado. Esto dio lugar a un estudio de cohorte de 259 pacientes, con un seguimiento medio de 8,6 años. estaban disponibles para todos los pacientes de la cohorte del estudio de datos clínico-patológicos. Los datos fueron censuradas por la derecha cuando los pacientes estaban vivos o libre de recurrencia en su última fecha de seguimiento. Características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Información de registros de pacientes fue anónima y se identificaron de-antes de su análisis de acuerdo con las directrices éticas nacionales ( "código de uso secundaria adecuada de tejido humano", Federación Holandesa de Sociedades Científicas Médicas), y aprobado por el médico Comité ético de la Universidad del Centro Médico de Leiden (LUMC). Este estudio se realizó de acuerdo a las directrices OBSERVACIÓN (NCI-EORTC) [25].
construcción de microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
(FFPE) los tejidos tumorales incluidas en parafina fijadas con formalina de cada uno de los pacientes de la serie consecutiva de pacientes con cáncer colorrectal (n = 408) se obtuvieron de los archivos de patología del LUMC y utilizaron para construir un microarray tisular (TMA), como se describe anteriormente [26]. Las secciones de 4 micras fueron cortadas de cada bloque TMA y utilizados para la tinción IHC. colorrectal tejidos histológicamente normales, según lo determinado por un patólogo experimentado, de 47 pacientes con tejidos tumorales correspondientes incluidos en este estudio fueron también recolectaron y se prepararon para IHC. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para IHC: anti-EZH2 (612667, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), anti-IMC1 (ab14389, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-SUZ12 (ab12073, Abcam) y anti-H3K27me3 (ab6002, Abcam). Todos los anticuerpos se han validado para su uso en inmunohistoquímica por Western blot [27] - [30]. Todos los anticuerpos primarios fueron utilizados en diluciones óptimas predeterminadas y IHC se realizó utilizando un protocolo de IHC estándar [31]. Brevemente, la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las secciones en una solución de 0,3% de peróxido de hidrógeno (en PBS) durante 20 min. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento de las secciones durante 10 minutos a 95 ° C en un tampón de citrato (pH 6; pH Solución Objetivo mínimo de recuperación, Dako, Glostrup, Dinamarca) para EZH2, BMI-1 y H3K27me3 y por calentamiento de las secciones de 10 min a 95 ° C en un tampón de Tris-EDTA (pH 9; pH Target Retrieval Solution alta, Dako) para SUZ12. TMA secciones se incubaron con los respectivos anticuerpos primarios durante la noche (16 horas). La tinción se visualizó usando el sistema de detección de Dako EnVision VERDADERO, peroxidasa /DAB +, conejo /ratón (Dako). Los TMA secciones teñidas fueron escaneados utilizando una magnificación de 20x en el sistema Ariol semiautomático (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). áreas de células tumorales (tejidos tumorales) y epitelio de colon (en los tejidos normales) fueron marcadas en la pantalla del ordenador en la inspección visual, seguido por un cuidadoso entrenamiento del sistema Ariol para identificar correctamente los núcleos positivamente teñidas y negativos dentro de las áreas de tejido marcados, para cada uno de los marcadores por separado. La expresión nuclear, que se define como el porcentaje de núcleos teñidos positivamente en la zona marcada de cada núcleo de tejido, fue entonces evaluado por el software Ariol. Varios núcleos de azar se evaluaron para cada sección TMA mediante inspección visual después de un análisis automático con el fin de verificar la correcta identificación de los núcleos teñidos positivamente.
Los análisis estadísticos
Los datos se analizaron en consulta con un especialista en estadística (HP ) con el programa SPSS 20.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.). 12 pacientes fueron excluidos de los análisis estadísticos, ya que no se disponía de todos los datos de los cuatro marcadores para estos pacientes, lo que resulta en una cohorte de pacientes consistía definitiva de 247 pacientes. Como los datos de los marcadores individuales no se distribuyen normalmente (Shapiro Wilk-test), no paramétrico de Wilcoxon se realizaron pruebas para evaluar las diferencias en la expresión nuclear entre el tumor y los tejidos normales emparejados (n = 47) para cada uno de los marcadores. correlación de rangos con signos de Spearman se realizaron análisis para investigar la correlación entre la expresión nuclear de las proteínas individuales PcG y modificación de las histonas H3K27me3. Cox análisis de tendencias de riesgo proporcional se realizaron para la supervivencia univariado y multivariado de los marcadores individuales. Covariables incluidas en todos los análisis multivariados fueron edad a la operación, el sexo, el estadio TNM del tumor (tumor etapas I a III), localización del tumor, el tamaño del tumor, el estado de la estabilidad de microsatélites (MSS). Covariables "tumor en el seguimiento" y "terapia adyuvante" se introdujeron como variables dependientes del tiempo. La supervivencia global (OS) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la muerte (por cualquier causa). la supervivencia libre de enfermedad (DFS) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la aparición de un segundo tumor primario colorrectal, recurrencia locorregional o recurrencia distante o muerte por cáncer colorrectal. Locorregional la supervivencia libre de recurrencia (LRRFS) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la aparición de una recurrencia locorregional o la muerte por cáncer. la supervivencia libre de recidiva a distancia (DRF) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la aparición de una recurrencia distante o muerte por cáncer.
Sobre la base de la distribución sesgada de los datos de expresión de cada uno de los marcadores individuales, la mediana de expresión se utilizó para dividir a los pacientes en grupos de alta expresión (por encima de la mediana) y baja expresión (por debajo de la mediana). Los cuatro marcadores se combinaron entonces en una nueva variable, basado en el número de marcadores que muestran alta expresión nuclear, lo que resulta en la siguiente agrupación: todo bajo (grupo 1), 1 alta (grupo 2), 2 alta (grupo 3), 3 alta (grupo 4) y todos alta (grupo 5). análisis de riesgo proporcional de Cox univariante y multivariante se realizaron utilizando los números de grupo como una variable categórica, utilizando el grupo 1 (todo bajo) como grupo de referencia. Basándose en estos resultados decidimos combinar grupos de pacientes 2, 3 y 4 en un grupo de pacientes; Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando más de tres grupos de pacientes. Además de los análisis de riesgo proporcional de Cox, se realizaron análisis de tendencia utilizando los números de grupo como variables continuas para evaluar la influencia de los marcadores combinados en la supervivencia del paciente y la recurrencia tumoral. Resultantes coeficientes de riesgo (HR) representan la HR por cada unidad de aumento (aumento del número de grupo). curvas de incidencia acumulada se hicieron para DFS, LRRFS y DRF, lo que representa riesgos competitivos [32]. Las curvas de Kaplan-Meier se utilizan para visualizar las diferencias entre los tres grupos de pacientes para OS. Para todos los análisis estadísticos, los valores de p de dos caras ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos, y los valores de p & lt; 0,05 se consideraron p≤0.1 una tendencia
Resultados
Expresión en el tumor. en comparación con los tejidos normales emparejados colorrectales
La expresión nuclear de todos los marcadores individuales (EZH2, Bmi1, SUZ12 y H3K27me3) en los tejidos tumorales se comparó con la expresión nuclear en los tejidos colorrectales normales emparejados. Al analizar las diferencias de expresión en la cohorte de estudio como un todo, solamente mediana expresión H3K27me3 y EZH2 fueron significativamente diferentes entre tumor y los tejidos normales (p & lt; 0,001 y p = 0,05, respectivamente; Figura 1A). En los tumores individuales, sin embargo, todos los marcadores mostraron marcadas diferencias en la expresión en comparación con sus homólogos normales (Figura 1B). Los análisis de supervivencia basada en continuación- o por encima de la mediana de expresión en los tejidos normales no mostraron diferencias en la supervivencia del paciente o la recurrencia del tumor (datos no mostrados).
(A) muestran diferencias en la expresión nuclear, medida como la porcentaje de núcleos teñidos positivamente, entre los tejidos normales y tumorales (n = 47). Boxplots muestran la mediana y el rango de expresión de cada uno de los marcadores individuales en normal (N) y muestras de tumor (T). Los porcentajes medianos de núcleos positivos se dan para cada uno de los marcadores. P-valores representan diferencias estadísticas entre las muestras normales y tumorales, calculados mediante la prueba de Wilcoxon. (B) Los histogramas muestran la diferencia en la expresión entre el tumor y los tejidos normales emparejados (eje Y) para cada uno de los pacientes individuales (eje x). Las diferencias en la expresión se calcularon como sigue: Expresión de diferencia = expresión en el tejido tumoral - expresión en el tejido normal. Los valores negativos indican mayor expresión en tejidos normales, los valores positivos indican una mayor expresión en los tejidos tumorales.
análisis marcador individual en los tejidos tumorales
Ejemplos de identificación de núcleos de células tumorales positivas y negativas para cada uno de los marcadores individuales por el sistema Ariol se muestran en la Figura 2. se analizaron primera si la expresión de la modificación de histonas H3K27me3 se correlacionó con la expresión de las proteínas individuales PcG. La expresión nuclear (porcentaje de núcleos positivos) de H3K27me3 fue de hecho correlacionó positivamente con la expresión de EZH2 (p & lt; 0,001), BMI1 (p & lt; 0,001) y SUZ12 (p = 0,05). No se observó correlación entre la expresión de los marcadores individuales y estadio tumoral TNM. Para los análisis de supervivencia, los pacientes se dividieron en grupos de expresión bajo y alto en base a la mediana de expresión de cada uno de los marcadores individuales, tal como aparece en la Figura 1A. En los análisis de supervivencia de los marcadores individuales, IMC1 mostró una fuerte correlación con la supervivencia del paciente (SG y SLE) y la recurrencia tumoral (LRRFS y DRF) en ambos análisis univariante y multivariante (tabla 2). EZH2 y H3K27me3 mostraron correlaciones significativas por sólo DFS. Para los tres marcadores (BMI1, EZH2 y H3K27me3), de alta expresión se asocia con una mejor supervivencia del paciente en comparación con los pacientes que muestran una expresión baja, con los valores de p para la DFS de p = 0,07 (BMI1), p = 0,04 (EZH2) y p = 0,06 (H3K27me3). SUZ12 no mostró diferencias en la supervivencia del paciente o la recurrencia del tumor basado en baja o alta expresión del marcador en los tejidos tumorales.
El entrenador de superposición sistema Ariol muestra la correcta identificación del positivo (indicado por puntos amarillos) y negativo ( puntos azules) núcleos en núcleos tumorales. TMA diapositivas fueron escaneados utilizando una magnificación de 20x. Se muestra para todos los marcadores tumorales son núcleos con tinción positiva (
fila superior
) y los núcleos tumorales negativos (
fila inferior
). El sistema Ariol fue entrenado para identificar las células positivas y negativas para cada marcador individual.
marcadores combinados
La hipótesis de que la combinación de múltiples marcadores se traduciría en una mejor estratificación de los pacientes. Por lo tanto, se realizaron análisis estadísticos sobre las combinaciones de enzimas modificadoras de histonas. Estos análisis mostraron que, efectivamente, que combinan múltiples marcadores resultaron en diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de pacientes y los coeficientes de riesgo más pronunciados, lo que indica un efecto más pronunciado sobre la supervivencia del paciente. La combinación de enzimas modificadoras de histonas EZH2 y IMC1 mostró diferencias significativas tanto para la supervivencia del paciente y la supervivencia libre de recidiva, con p = 0,02 (HR = 0,72; IC del 95% 0,54-,94) de DFS y p = 0,012 (HR = 0,71; 95% CI 0,54-0,92) para LRRFS en el análisis multivariado. Combinando EZH2 y SUZ12 mostró una tendencia a la DFS en los análisis multivariados, con p = 0,08 (HR = 0,77; IC del 95% 0,57 a 1,04). La combinación de IMC1 y SUZ12 mostró diferencias significativas para la supervivencia del paciente, con p = 0,02 (HR = 0,76; IC del 95% 0,61 a 0,96) para la supervivencia global y p = 0,05 (HR = 0,73; IC del 95% 0,54 a 1,00).
Debido a que las tres proteínas PcG actúan juntos en varios complejos de proteínas para regular la expresión H3K27me3, la hipótesis de que la combinación de todos los marcadores (IMC1, EZH2, SUZ12 y H3K27me3) en una variable daría como resultado aún mejor la estratificación de los pacientes. Los pacientes se dividieron en cinco grupos basados en el número de marcadores que muestran alta expresión nuclear. Esto resultó en los siguientes grupos de pacientes: todo bajo (grupo 1), una alta (grupo 2), dos de alta (grupo 3), tres de alto (grupo 4) y todos alta (grupo 5). Características de los pacientes de los 5 grupos de pacientes eran comparables a la cohorte del estudio (Tabla S1). Los análisis multivariados tendencia de los marcadores combinados, utilizando los números de los grupos de pacientes como variables continuas, mostró el cociente de riesgo de 0,79 hasta 0,88 para cada marcador adicional que muestra alta expresión nuclear en ambos análisis univariante y multivariante, lo que indica una mejor supervivencia del paciente y menor riesgo de recurrencia del tumor para cada marcador adicional que muestra alta expresión (Figura 3A). Cuando se introdujeron los números de los grupos de pacientes como variables categóricas, se observó una tendencia similar (Figuras 3B y 3C). En general, las proporciones de riesgo para OS disminuyeron al aumentar el número de grupo, lo que indica una mejor supervivencia del paciente cuando más marcadores fueron altamente expresado en comparación con el "todo bajo" expresión grupo (grupo 1). Los pacientes que mostraron alta expresión de todos los marcadores, el "todo lo alto" grupo (grupo 5), mostraron la mejor supervivencia global (p = 0,01, HR = 0,42, IC 95% 0,21-0,84) en comparación con el grupo de referencia 1, que mostró la supervivencia más corta. Los grupos 2, 3 y 4 mostraron proporciones similares de riesgo (Figuras 3B y 3C), que también se reflejó en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que se ejecutan juntos en comparación con las curvas de supervivencia de los grupos 1 y 5. Por lo tanto, decidimos combinar los tres grupos de pacientes 2,3 y 4 en un solo grupo, lo que resulta en tres grupos de pacientes (grupo 1, los grupos de 2-4 y el grupo 5). Las curvas de Kaplan-Meier y parcelas de incidencia acumulada mostraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes derivados para OS, DFS, LRRFS y una tendencia a la DRF, que también se refleja en las tasas de supervivencia a 5 años (Figura 4). Se observaron la mejor supervivencia de los pacientes y de los períodos libres de recurrencia más largos para los pacientes que muestran una alta expresión de los cuatro marcadores ( "todo lo alto", el grupo 5) en las muestras tumorales, con tasas de supervivencia a 5 años del 77% para el sistema operativo, el 83% de DFS y DRF, y 86% para LRFS. Los pacientes en los grupos combinados 2-4, mostró una SG más corta, DFS y LRFS, con tasas de supervivencia a 5 años del 67% para SG y SLE, 69% para LRFS y 72% para DRF. Los pacientes en el "todo bajo" grupo (grupo 1), mostró una SG significativamente más corto, DFS y LRFS en comparación con cualquiera de los otros grupos de pacientes, con tasas de supervivencia a 5 años del 43% para el sistema operativo y LRFS, el 49% de DFS y el 55% para DRF. En su conjunto, las tasas de supervivencia a 5 años fueron menores cuando más marcadores mostraron una baja expresión. Los cocientes de riesgo en tanto univariante y multivariante también reflejan estos resultados (Tabla 3): Grupo 5 muestra la relación de riesgo más bajo en comparación con el grupo de referencia 1 (por ejemplo, HR = 0,23 multivariado (desde 0,08 hasta 0,67) para DFS). Esto indica un menor riesgo de un evento (la muerte del paciente o la recurrencia tumoral locorregional) para los pacientes en el "todo lo alto" grupo de OS, DFS y LRFS. Para DRF, resultados estadísticamente significativos fueron únicamente observados en el análisis univariado
Los grupos de pacientes fueron compuestos basados en el número de marcadores que muestran alta expresión:. Todo bajo (grupo 1), una alta (grupo 2), dos de alto ( grupo 3), tres de alto (grupo 4) y todos alta (grupo 5). (A) univariante y multivariante de regresión de Cox tendencia análisis se realizaron con los grupos marcadores combinados como variables continuas. Las razones de riesgo por incremento unitario de cada uno de los grupos de pacientes fueron graficados (B) y la lista (C), tanto para la tendencia de regresión de Cox univariante y multivariante análisis utilizando los grupos marcadores combinados como variables categóricas. El número de pacientes en los grupos de pacientes individuales fueron: Grupo 1 (n = 28), grupo 2 (n = 59), grupo 3 (n = 55), grupo 4 (n = 74) y el grupo 5 (n = 31) .
marcador combinado (EZH2, IMC1, SUZ12 y H3K27me3) grupos de expresión se dividieron en tres grupos de pacientes: grupo 1, grupos de 2-4 y el grupo de 5. el número de pacientes en los grupos de pacientes individuales fueron: grupo 1 (n = 28), grupo 2 (n = 59), grupo 3 (n = 55), grupo 4 (n = 74) y el grupo 5 (n = 31). Las curvas de Kaplan-Meier se hicieron para la supervivencia global (A) y curvas de incidencia acumulada se muestran para la supervivencia libre de enfermedad (B), locorregional la supervivencia libre de recurrencia (C) y la supervivencia libre de recidiva a distancia (D). las tasas de supervivencia a 5 años se dan para cada grupo de pacientes. Tablas a continuación las curvas indican los números en riesgo (#) por grupo para los diferentes puntos de tiempo.
Discusión
Además de las mutaciones génicas, los patrones aberrantes de expresión epigenética reguladores han sido reconocidos como eventos cruciales en el proceso tumorigénico, lo que resulta en cambios marcados en la expresión génica. Los cambios en la expresión de estos reguladores epigenéticos incluyen metiltransferasas de ADN y los consiguientes cambios en los perfiles de metilación del ADN y las enzimas modificadoras de histonas y los cambios resultantes en sus correspondientes modificaciones de las histonas. En este estudio, se determinó la expresión de tres proteínas PcG (EZH2, Bmi1 y SUZ12) y la modificación de histonas asociadas H3K27me3 en tejidos de cáncer colorrectal. La expresión aberrante de cada una de estas enzimas modificadoras de histonas, y de la modificación de histonas H3K27me3, ha sido indicado para contribuir a la tumorigénesis en varios tipos de cáncer y se ha correlacionado con el resultado del paciente [11] - [24]. Los estudios en la literatura muestran resultados contradictorios en relación con el valor pronóstico de las proteínas del grupo Polycomb en el cáncer colorrectal. Por ejemplo, la expresión de alto EZH2 se ha asociado con un mal pronóstico en una serie de pacientes con cáncer colorrectal por Wang
et al
. [33], mientras que no se encontró una expresión de alto EZH2 estar asociado con una mejor supervivencia libre de recaída en pacientes con cáncer de colon (pero no en pacientes con cáncer rectal) por Fluge
et al
. [34]. Además, se encontró una alta expresión de IMC1 que se correlaciona con buen pronóstico en el cáncer de mama en un estudio realizado por Pietersen
et al
. [35], mientras que IMC1 alta se asocia con un mal pronóstico en el cáncer de colon en un estudio realizado por Du
et al
. [36]. En nuestra cohorte del estudio, los datos de supervivencia para los marcadores individuales mostraron que la alta expresión de todos los marcadores se correlaciona con una mejor supervivencia del paciente y períodos libres de recurrencia más largos en comparación con los pacientes que muestran una baja expresión. Los resultados encontrados en este estudio corresponden a los descubrimientos previos de que la alta expresión de H3K27me3 se asoció con una mejor supervivencia de los pacientes en los tumores rectales [4]. En este estudio, hemos demostrado que la alta expresión de H3K27me3 fue en efecto, asociado con una mejor supervivencia del paciente y períodos más largos sin recidiva. Como hemos demostrado que la expresión de las proteínas PcG estaba directamente relacionada con la expresión de H3K27me3, esperábamos una correlación similar de la expresión de las proteínas PcG con el resultado clínico, el cual fue hecho confirmado por los resultados presentados en este manuscrito. Los altos niveles de H3K27me3, a causa de la expresión aberrante de proteínas PcG, pueda prevenir la expresión aberrante de oncogenes, la activación de secuencias retrotransposon (como LINE-1; [4]), y el resultado en otros (PAI) eventos genómicas que promueven la agresividad del tumor.
Además de los marcadores individuales, combinaciones de proteínas PcG en correlación con la evolución del paciente ha sido estudiada por varios grupos de investigación. Por ejemplo, se informó de co-expresión de EZH2 y BMI1 estar asociado con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer [37] - [39]. En contraste, se informó sobreexpresión de EZH2 y IMC1 tener diferentes factores que influyen en el pronóstico del paciente en el cáncer de mama [35], y se encontró que no tienen valor pronóstico en el carcinoma urotelial de la vejiga [40]. En nuestro estudio de cáncer colorrectal cohorte, todas las combinaciones de enzimas modificadoras de histonas mostraron valor pronóstico. Para obtener más información acerca de las vías epigenéticas con potencial valor pronóstico en el cáncer colorrectal, se realizó un análisis multivariado de supervivencia utilizando los datos de expresión combinados de múltiples proteínas PcG (EZH2, Bmi1 y SUZ12) y su modificación de las histonas asociadas H3K27me3. La combinación de las tres proteínas PcG y su modificación de histona asociado resultó en significativamente mejor la estratificación de los grupos de pacientes en comparación con los marcadores individuales. En los análisis de marcador combinado, se observaron la mejor supervivencia de los pacientes y períodos más largos sin recidiva en los pacientes que muestran una alta expresión de los cuatro marcadores ( "todo lo alto") en las muestras tumorales. Los pacientes en el "todo bajo" grupo mostró una SG significativamente más cortos, DFS y LRFS en comparación con cualquiera de los otros grupos de pacientes. Los resultados del análisis combinado marcador de subrayar la cooperación de estas tres enzimas en PcG complejos, y por lo tanto proporcionar una mejor estratificación del riesgo de los pacientes.
Además de las funciones de EZH2, IMC1 y SUZ12 en la regulación epigenética de estructura de la cromatina y la expresión génica, la regulación directa de la función de la proteína se ha descrito para EZH2 y BMI1, incluyendo la fosforilación de proteínas y ubiquitinación. A EZH2 citosólica y SUZ12-que contiene el complejo metiltransferasa se ha relacionado con la polimerización de actina, un proceso importante en la proliferación celular [41]. Shuttling de la que contiene el complejo EZH2 y SUZ12 entre los diferentes compartimentos celulares puede explicar la débil tinción citosólica observado para EZH2 y SUZ12 además de la fuerte tinción nuclear para estos marcadores, en comparación con la estricta tinción nuclear observada para BMI1. Otra proteína no histona metilado por EZH2 es cardiaco GATA4 factor de transcripción. La metilación reduce su actividad transcripcional, lo que resulta en la inhibición del desarrollo cardíaco adecuado [42]. Estos ejemplos indican que la expresión aberrante de estas proteínas PcG influencias procesos clave como la transcripción de genes y la proliferación celular, la promoción de la transformación de células normales en células tumorales.
En conclusión, se demostró que la expresión combinada de proteínas PcG EZH2, IMC1 y SUZ12 y su modificación de las histonas asociadas H3K27me3 tiene valor pronóstico en nuestro estudio de cáncer colorrectal cohorte. la expresión del marcador combinado resultó en una mejor la estratificación de los pacientes en comparación con los marcadores individuales y por lo tanto proporciona una visión más clara de las funciones de estas proteínas y epigenéticos -Modificaciones en el cáncer colorrectal. Otras combinaciones de mecanismos epigenéticos deben ser investigadas en el cáncer colorrectal para desentrañar aún más la biología subyacente en los tumores individuales. Esto hará avanzar la búsqueda de nuevos biomarcadores para ser utilizados en un entorno clínico con el fin de clasificar mejor a los pacientes para el tratamiento.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Características de los pacientes de todos los grupos de pacientes utilizados en los análisis de marcador combinado. Características de los pacientes se muestran para todos los grupos de pacientes que se utilizan en el análisis combinado marcador. Los grupos de pacientes muestran características de los pacientes comparables a la completa cohorte de estudio de 247 pacientes (tabla 1). P-valores representan la prueba de Jonckheere-Terpstra utilizado para probar si las muestras provienen de la misma distribución. Para la variable "tamaño del tumor", se realizó una prueba de ANOVA de una vía para detectar diferencias estadísticas entre los grupos de pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0108265.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a CM Janssen para que nos proporciona las secciones de microarrays de tejidos utilizados para inmunohistoquímica.