Extracto
retrovirus endógeno humano K (HERV-K) es el retrovirus más intacto en el genoma humano. Hay múltiples de larga duración o de larga duración provirus cerca de HERV-K en el mismo. Para analizar qué provirus HERV-K dan lugar a transcripciones virales en líneas celulares de cáncer y para probar si la radiación ionizante puede alterar los niveles de transcripciones HERV-K, estudios de RT-PCR se llevaron a cabo utilizando varias líneas celulares de cáncer humano. Primers de varias posiciones en el genoma viral se utilizaron y se incluyen pares diseñados para cruzar las uniones de empalme en los ARN virales. En ausencia de radiación ionizante, se detectaron las transcripciones de múltiples provirus HERV-K en líneas de células de próstata humana, cuello de útero, cabeza y cuello, o cáncer de mama, y los provirus de la que las transcripciones se originaron varió entre las diferentes líneas. Sólo una de las 13 líneas celulares de la prueba (línea de cáncer cervical C33A) no mostraron transcripciones HERV-K. ARN empalmados detectados incluyen los ARN virales empalmados como se espera en los sitios de empalme virales convencionales, además de varios ARN empalmados alternativamente. empalmados alternativamente transcripciones surgieron de provirus específicos, y se detectaron en la mayoría de las líneas celulares utilizadas. RT-PCR cuantitativa se realizó para evaluar los efectos de la radiación ionizante. Estos análisis mostraron que las transcripciones HERV-K fueron elevados en cuatro de las doce líneas ensayadas, específicamente todas las líneas de cáncer de próstata tres utilizados y una línea de cáncer de mama. Los aumentos fueron transitorios, alcanzando un máximo a las 24 horas después de una sola dosis de irradiación gamma que varió de 2,5 a 20 Gy, y volviendo a los niveles basales a las 72 horas. En resumen, estos estudios demostraron que la radiación ionizante puede afectar los niveles de transcripciones HERV-K en las células, y estos efectos pueden variar entre diferentes células. Los cambios en los niveles de transcripción HERV-K pueden afectar a múltiples procesos biológicos en las células, y los futuros estudios de los efectos de la radiación ionizante sobre HERV-K vale la pena perseguir
Visto:. Agoni L, J Lenz, Guha C ( 2013) y la variante de splicing Influencia de la radiación ionizante sobre Retrovirus endógeno humano K (HERV-K) Transcripciones en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10.1371 /journal.pone.0076472
Editor: Robert Belshaw, Universidad de Plymouth, Reino Unido
Recibido: 3 Julio, 2013; Aceptado: 27 Agosto 2013; Publicado: 18 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Agoni et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo contó con el apoyo del NIBIB 1 R01 EB009040 (CG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los efectos de la radiación (IR) de los retrovirus endógenos (ERV) ionizantes son en gran parte desconocidos. Los genomas de ADN de ERV se integran en el genoma de sus especies huésped como resultado de las infecciones de las células de la línea germinal en el tiempo evolutivo. Hasta la fecha, los efectos de la radiación ionizante en ERV se han explorado sólo en ratones [1], en donde se ha conocido por décadas que la radiación ionizante puede reactivar retrovirus endógenos de ratón (MERVs) [2] - [4]. La radiación ionizante también afecta a la respuesta inmune a las células cancerosas, y un estudio detecta + CD8 células T reactivos frente a un antígeno en un MERV murino, irradiado modelo de carcinoma de colon [5]. Por lo tanto es plausible que los efectos de la radiación ionizante sobre la expresión de retrovirus endógeno podría tener consecuencias para la respuesta inmune hacia las células tumorales
.
La radiación ionizante se ha reportado para aumentar la actividad transcripcional de muchos virus, incluyendo CMV [6], [7 ], HPV [8] y el VIH [9], [10] en las células infectadas. Los mecanismos moleculares que son todavía en gran parte sin caracterizar, aunque para el VIH, IR ha sido reportado para aumentar la transcripción a través de la activación del promotor LTR [9], [10]. A nivel clínico, los estudios han demostrado una inesperada alta tasa de reactivación de la infección por el VHB latente en el carcinoma hepatocelular después de la radioterapia [11]. En las células infectadas por el VPH, aumento de la producción de las transcripciones y proteínas E6 /E7 se ha demostrado después de irradiación? [8]. A nivel clínico, el aumento de los linfocitos citotóxicos específicos (CTL) las respuestas contra los antígenos de HPV E6 /E7 han sido detectados en los pacientes con cáncer de cuello uterino después de la radioterapia [12]. Además de los efectos sobre los niveles de expresión del virus, la radiación ionizante se conoce para modular la respuesta inmune contra el cáncer [13] - [15]
retrovirus endógenos están presentes en el genoma de todas las células de un individuo y pueden ser. objetivos para la respuesta inmune como aquellas contra MERVs [16]. Ambas respuestas T y linfocitos B también se han observado contra los retrovirus humanos endógenos (HERV) [17] - [21]. En particular, la respuesta inmune se han observado contra el conjunto más reciente adquisición de los retrovirus en el genoma humano, HERV-K [18], [19], [22], [23]. HERVs existe en el genoma humano en forma de genomas de ADN retrovirales integrado llamado provirus. Colectivamente, se ha estimado que comprenden aproximadamente 8% del genoma humano [24]. En ausencia de presión de selección en el anfitrión para mantener estos provirus en una forma intacta, las mutaciones se acumulan inevitablemente en ellos largo del tiempo evolutivo alterando de esta manera los componentes genómicos virales y la inactivación de la infectividad viral. El subtipo HML2 de HERV-K es el único retrovirus han penetrado en el genoma del linaje humano desde la divergencia de los linajes de humanos y chimpancés ocurrió hace unos 6 millones de años [25] - [31]. Debido a que es el más recientemente insertada, HERV-K HML2 constituye el conjunto más intacta de los retrovirus en el genoma humano [25], [32] - [39]. A pesar de que, no proviral locus HERV-K individuo se sabe que es completamente funcional y capaz de producir viriones infecciosos, aunque la recombinación entre los loci hoy existentes en el genoma humano podría restablecer la infectividad viral [37]. Muchos de los provirus HERV-K son suficientemente intacta para codificar proteínas que pueden retener algunas funciones [25], [35], [36], [38], [39], y la expresión de estas proteínas se ha sugerido que se correlaciona con enfermedades incluyendo el cáncer [40] - [44].
HERV-K se transcribe en diversos grados en varias enfermedades humanas, incluyendo cáncer [20] [45], - [48], la infección por VIH [18], [49 ] - [51] y los trastornos autoinmunes [52], [53]. Individual loci HERV-K en el genoma humano se diferencian en la integridad de los marcos de lectura abiertos específicas, la funcionalidad de las proteínas codificadas, la integridad de los elementos que actúan en cis, y posiblemente en la capacidad de las secuencias de ADN que flanquea el ADN viral a afectar a la transcripción. Varían de aproximadamente 97 a más del 99% idénticos en las comparaciones por pares entre sí, y muchas de las diferencias entre ellos son simples cambios de pares de bases. Por lo tanto para identificar los loci HERV-K específico expresado en una muestra humana y para comprender a fondo el papel biológico de HERV-K en enfermedades humanas, en su caso, es necesario incluir el análisis de transcripciones virales a nivel de un solo nucleótido en cualquier estudio de ellos [54]. Hemos detectado previamente transcripciones HERV-K en líneas celulares de cáncer de próstata y observó que algunas de las transcripciones se empalmaron en posiciones inusuales en el genoma viral [55]. La detección de la variante de empalme de las transcripciones HERV-K en líneas de cáncer de próstata fue inesperado. En este informe, el análisis basado nucleótidos del locus específico HERV-K que se transcribe y la posibilidad de variantes de corte y empalme inusuales se extendió a otros tipos de líneas celulares de cáncer. También probamos la hipótesis de que la radiación ionizante puede alterar los niveles de transcripciones de retrovirus endógenos humanos K. proteínas HERV-K son conocidos por ser objetivos para ambas T y B- respuestas de los linfocitos [17] - [21], [46]. Como primer paso para determinar si los antígenos HERV-K pueden estar sujetos a la modulación inducida por irradiación y tal vez constituyan objetivos candidatos para antitumoral, la inmunoterapia basada en células T para el cáncer después de la administración de la radiación ionizante, se investigó si la radiación ionizante afecta a los niveles transcripciones de HERV-K en diversas líneas celulares de cáncer.
resultados
HERV-K transcripción en cáncer líneas celulares
HERV-K transcripción se ha reportado que ocurre en el cáncer humano . Sin embargo, la respuesta de HERV-K a la radiación ionizante no se ha probado en el cáncer o las células normales. Para verificar HERV-K transcripción y establecer una línea de base de referencia para los experimentos con IR, se realizó primera PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) en ARN aislado de las líneas de células 13 cancerosas de sitios de cáncer tratados comúnmente con radioterapia: próstata, cuello uterino, cabeza &erio; el cuello y el pecho. RT-PCR se realizaron usando pares de cebadores a partir de múltiples partes del genoma viral que se muestran en la Figura 1. Los cebadores de la proteasa viral (
pro
), la polimerasa (
pol
) eran capaces de detectar unspliced ARN viral, y el sobre (
env
) cebadores de genes fueron capaces de detectar ambos mRNAs env unspliced y separado empalmados. Los productos de tamaño esperado se observaron en 12 líneas celulares de los 13 probados para la
Pro Trial y
pol
amplicones y en 11 líneas celulares para la
env
amplicón (figura . 2A). Paralelas RT-PCR se realizaron con cebadores para la
GAPDH
gen para verificar la carga comparable exacta de ARN en todas las muestras y la carga de los geles. Controles sin transcriptasa inversa verifican que los productos se han generado a partir de plantillas de ARN y no de potencialmente la contaminación de ADN genómico (Fig. 2).
Un mapa genético de un provirus HERV-K (gris) insertados en las secuencias flanqueantes del genoma huésped es se muestra con un secuencia duplicada objetivo 5 o 6 pares de bases (TDS) indicaron como cajas negras. La transcripción viral primaria no empalmado, por separado-empalmado
env
ARNm y doblemente empalmados
rec
y
NP9
ARNm se muestran a continuación del genoma viral, junto con el ARN empalmado por separado [56] que no se conoce para codificar cualquier proteína. 3 'colas de poli (A) se indican (AAAA). La supresión de 292 nucleótidos de tipo 1 HERV-K provirus que abarcan la unión pol-env se indica (Δ292). Tipo 2 provirus HERV-K y sus transcripciones contienen estos nucleótidos. Las posiciones de los pares de cebadores de PCR se muestran en la parte inferior como flechas negras con los nombres por los que se identifican en todo el documento. Las flechas de color gris identifican cebadores utilizados para la PCR anidada. La línea de trazos en ángulo muestra las secuencias intrónicas extirpados que el 1X-env y pares de cebadores 2X-rec fueron diseñados para cruzar. El par de cebadores utilizados para RT-PCR cuantitativa se muestra también (q-env).
RT-PCR se realizó para detectar transcritos virales en cinco posiciones diferentes en HERV-K genoma, dos de los cuales a través de uniones de empalme para la detección de ARN empalmados en el cruce convencional env ARNm de empalme (1x-env) y las uniones de corte y empalme de ARNm rec. GAPDH RT-PCR se realizó de forma simultánea y sirvió como control positivo para la integridad del ARN y como la comparación de carga. Los productos se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa. posiciones genómicas de los cebadores usados se muestran en la Fig. 1. Los controles se realizaron en paralelo sin la transcriptasa inversa (-RT) como controles para excluir la contaminación de ADN. marcadores de tamaño de ADN se muestran a la izquierda.
Estos datos confirmaron que las transcripciones HERV-K estaban presentes en la mayoría de las líneas celulares de cáncer humano analizadas. Había unos pocos casos en los productos HERV-K RT-PCR no fueron detectados (Fig. 2). Una línea celular de cáncer de cuello uterino, C33A, no dió productos de RT-PCR con cualquiera de los tres pares de cebadores, aunque lo hizo dar el producto esperado en el
GAPDH
amplificación del control (Fig. 2A). línea celular de cáncer de mama Uno, MDA-MB-468, falló constantemente para dar el
env
amplicón, aunque el
Pro Trial y
pol
productos estaban presentes (Fig. 2A ). Para aumentar la sensibilidad, un anidados RT-PCR se realizó durante el
env
amplificación usando cebadores situados como se muestra en la Figura 1. El
se detectó env
producto en el MDA-MB-468 de mama línea de cáncer, como lo fue en otras 11 líneas (Fig. 3A). Sin embargo, todavía era indetectable en las células de cáncer cervical C33A, lo que indica que los unspliced empalmados por separado y HERV-K ARNs no estaban presentes a niveles detectables en esta línea celular. reacciones de amplificación paralelas se realizaron sin transcriptasa inversa y fueron uniformemente negativos, lo que muestra que la amplificación fue a partir de plantillas de ARN y no de cualquier ADN genómico potencialmente contaminante (Fig. 3).
Nested PCR se realizó en productos de RT-PCR se muestra en la Fig. 2 para detectar transcritos virales en tres posiciones diferentes en HERV-K genoma. Dos de RT-PCR uniones de empalme transversal para detectar ARN empalmados en el cruce convencional env ARNm de empalme (1x-env) y REC y el ARNm NP9 (2X-rec, 2X-NP9) empalmar las uniones. Los productos se resolvieron por electroforesis. posiciones genómicas de los cebadores usados se muestran en la Fig. 1. Los controles se realizaron en paralelo sin la transcriptasa inversa (-RT) como controles para excluir la contaminación de ADN. Los marcadores de tamaño de ADN se muestran a la izquierda.
Presencia de HERV-K empalmadas Transcripciones en líneas celulares de cáncer
Para evaluar si las transcripciones HERV-K tienen suficiente integridad para los ARN a empalmar, se realizó RT-PCR a través de las dos uniones de empalme convencionales virales. Múltiples empalmados HERV-K mRNAs se han caracterizado [40], [56] - [58] que incluye el ARNm solos empalmado que codifica la proteína Env, y tres ARN doblemente empalmados, uno de los cuales codifica Rec, y otro de los cuales codifica NP9 (Fig . 1). existen provirus HERV-K HML2 como dos tipos diferentes denominados tipo 1 y tipo 2, dependiendo de si un tramo de 292 pb de los nucleótidos está presente (tipo 2) o borrado (tipo 1). En el tipo 1 provirus, la deleción elimina la porción terminal amino-codificación de
env
y
rec
, y causa una fusión en el marco de la
pol
y
env
marcos de lectura abierta (Fig. 1). Por el contrario, en el tipo 2 provirus, la porción terminal carboxilo-codificación de
pol
y el que por amino terminales de
env
y
rec ¿Cuáles son totalmente presente. El sitio de empalme 3 '(3'SS) para
env
mRNA y el primer intrón del
rec
mRNA está situado aguas arriba del tramo de 292 pb, pero el 5'SS para el segundo intrón de
rec
ARNm se encuentra dentro de los 292 pb (Fig. 1). Por lo tanto tipo 1 provirus no generan la
rec forma Red de ARN doblemente empalmados (Fig. 1) o codifican la proteína Rec.
El uso de primers diseñados para detectar la empalmado por enlaces sencillos,
env
ARNm (1X-env, Fig. 1) y las dos uniones de empalme en doblemente empalmados
rec
o
NP9
ARNm (llamado 2X-rec, Fig. 1), 11 de 13 líneas celulares fueron resultaron positivas con el 1X-
env
cebadores, y 10 de los 13 produjo productos con los cebadores 2X-rec (Fig. 2B). La detección de los productos de corte y empalme también proporcionó evidencia, además, que los productos de RT-PCR se derivan, de hecho, a partir de ARN codificadas por el virus y no de cualquier ADN genómico celular potencialmente contaminante. La detección de múltiples productos de tamaño con los cebadores 1X-env fue inesperado.
Para comprobar que las bandas inesperadas tamaño se derivaron de HERV-K ARN y para lograr una mejor resolución de los productos PCR bandas en la electroforesis en gel de agarosa , se realizó PCR anidada (Figura 1). se observaron de nuevo múltiples bandas, y no se detectaron productos en ausencia de transcriptasa inversa, lo que confirma que se derivaron a partir de ARN virales empalmados (Fig. 3). Los productos de PCR fueron identificados por amplificación 1X-env en 12 de 13 líneas celulares y bandas de tres tamaños diferentes fueron detectados, con las relaciones de intensidad de las tres bandas que varían entre las diferentes líneas. productos de tamaño múltiples, también se observaron para el amplicón 2X-rec, incluyendo la débil banda de aproximadamente 500 pb y una banda prominente de aproximadamente 250 pb. Ambos productos de la PCR estaban presentes en MDA-MB-468 células de cáncer de mama, lo cual demuestra que el ARN viral empalmado estaba presente en esta línea celular. Para células de cáncer cervical C33A, ninguno de los productos anidados de ARN empalmado fue detectado, lo que confirma la ausencia de transcripciones HERV-K detectables en esta línea celular. Este análisis también detectó la presencia de transcritos NP9 en cinco de las líneas (Fig. 3).
Identificación de la persona HERV-K activa Loci
La razón para la detección de múltiples bandas de tamaño en la RT-PCR de las Figuras 2B y 3, en particular para el 1X-env RT-PCR, era incierto. Una posibilidad era que podrían reflejar las deleciones o inserciones únicas que se había acumulado en loci específicos HERV-K a lo largo del tiempo evolutivo que resulta en transcripciones de tamaño alterados, y estos locus particular, fueron los transcritos en las líneas celulares utilizadas. Otra fue que los sitios de empalme usado varió entre loci individuales HERV-K en el genoma humano, lo que resulta en diferentes productos de tamaño. Para distinguir entre estas hipótesis e identificar los loci específicos de origen de las transcripciones, los productos de PCR se muestran en la Figura 2 se secuenciaron. Esto requiere un análisis de las transcripciones a nivel de nucleótidos, porque los provirus son tan similares entre sí. Mientras provirus individuales acumulan mutaciones únicas en el tiempo evolutivo, algunos de los provirus HERV-K en el genoma humano son tan nuevos que son más del 99% idéntica, y el nivel de identidad puede variar en diferentes partes del genoma viral. Provirus que se formaron antes en el tiempo se han vuelto cada vez más divergentes. La secuenciación de productos de PCR suficientemente largos se puede utilizar para deducir la loci viral específico que coincida más estrechamente las transcripciones, incluso cuando las diferencias son menos de un nucleótido en 100 entre dos provirus particulares y las transcripciones de ARN de ellos. La Tabla 1 muestra 23 de las más intactas provirus HERV-K HML2 en el genoma humano a la que las secuencias se compararon [39].
Inicialmente, el
Pro Trial,
Opiniones y pol
env
productos de PCR fueron secuenciados directamente. Un ejemplo de
pro
secuencias de cuatro líneas celulares alineados con muchos de los provirus relativamente intactas HERV-K en el genoma humano se muestran en la Figura 4. Comparación de las secuencias mostró que las transcripciones HERV-K detectados coincidían con las compartidos por provirus humanos específicos, mostrando que derivan al menos en su mayor parte desde el subconjunto de provirus HERV-K HML2 que se formó después de que los linajes de humanos y chimpancés divergieron. En otras posiciones, había múltiples picos secundarios en los cromatógrafos de secuenciación, lo que indica que los productos de PCR se obtuvieron a partir de mezclas de las transcripciones de múltiples loci. La Tabla 1 resume los nucleótidos más predominantes ( "pluralidad", Tabla 1) en cada una de las posiciones en las que varios nucleótidos se observaron de forma inequívoca dentro de los
Pro Trial amplicones. Aunque, esto corresponde más de cerca el provirus HERV-K102 (Tabla 1), no era posible discernir por este análisis si este provirus fue, de hecho, transcribe, ya que también era plausible que la secuencia pluralidad de una mezcla de provirus transcritos solo coincidentemente emparejado este provirus. Las mezclas de secuencia variar en cierta medida entre las diferentes líneas celulares (Tabla 1), y se observaron de manera similar en las otras partes del genoma viral (datos no mostrados). Mientras que los puntos de vista que podrían obtener de la secuenciación directa de los productos de RT-PCR fueron por lo tanto limitado, las mezclas muestran que hicieron múltiples provirus fueron transcritas entre las distintas líneas celulares de cáncer.
En el panel inferior, el HERV se muestran los provirus de larga duración -K utilizadas como referencias para identificar los lugares de origen de las transcripciones de ARNm. A la izquierda, se muestran las principales ramas de homínidos existentes, junto con los tiempos aproximados de su ramificación del linaje que conduce a los seres humanos modernos en millones de años atrás (MA). Provirus que se insertan en las posiciones precisamente ortólogos en humanos y otros homínidos, y por lo tanto son idénticos por descendencia, se indican.
Para investigar con más precisión qué loci HERV-K fueron transcritas, mezclas de RT-PCR productos fueron separados en secuencias individuales mediante la clonación en vectores de plásmidos. Esta investigación permitió también de lo que representaron los múltiples productos de tamaño (. Las figuras 2 y 3). El 1X-
env productos
RT-PCR (Fig. 2A) se escopeta clonado en vectores plasmídicos. Para los productos 1X-env, veinticuatro clones individuales de cada línea celular se ensayaron mediante selección por PCR para determinar el tamaño del amplicón clonado. Para las diversas muestras, de 4 a 13 clones se seleccionaron para la secuenciación, y los resultados se resumen en la Tabla 2. Los clones fueron seleccionados para abarcar el conjunto de diferentes productos de tamaño en cada línea, y por lo tanto el número de veces que se obtuvo ninguna secuencia no lo hizo reflejar su abundancia relativa entre las transcripciones HERV-K en cada línea celular. Además, la extensión de la secuenciación se limita a mirar los productos más comunes, y es probable que provirus menos abundantemente transcritos no fueron detectados por este análisis.
Estos análisis identificaron un total de seis diferentes loci individuales HERV-K entre las líneas 12 celulares (Tabla 2). Dos de ellos eran HERV-K102 y K108 HERV-(provirus en adelante se identifican simplemente como K102, K108, etc.). Junto con un tercio provirus, K (I), éstos se detectaron en múltiples líneas celulares (Tabla 2). productos de RT-PCR también se detectaron a partir de tres provirus adicionales, K107, K111, K117 y en una o unas pocas líneas de células de cada uno. se detectaron los transcritos de varios provirus en la mayoría de las líneas. Es probable que más extensa secuenciación de clones aumentaría el número de HERV-K loci detectado. Cinco de los loci de la que se detectaron los transcritos virales eran humanos específicos de provirus HERV-K, lo que confirma que las transcripciones detectadas derivan en gran parte del subconjunto de provirus HERV-K HML2 que se formó después de que los linajes de humanos y chimpancés divergieron. Así, la más detectada HERV-K empalmado
env
transcripciones en las líneas celulares de cáncer humano se obtuvieron a partir del subconjunto más recientemente adquiridos de los retrovirus en el genoma humano.
splicing alternativo de HERV- individual K activa Loci
la secuenciación del 1X-env productos de RT-PCR mostró empalme en las posiciones esperadas dentro del genoma HERV-K, pero, inesperadamente, también demostró transcripciones longitudinalmente en sitios adicionales (Figura 5). Se detectaron los sitios convencionales para el tipo 2 provirus, K108, K109, y K (I), y el tipo 1 provirus, K102 y K117 (Fig. 5). K108 es uno de los provirus más intactas en el genoma humano que tienen marcos de lectura abierta de longitud completa para todas las proteínas virales [25], [35], y convencionalmente empalmados transcripciones de ella se detectaron en siete líneas diferentes (Fig. 5). Sin embargo cuatro loci, K102, K (I), K117, y K111, mostró variantes de empalme 1X-env inusuales formados a partir de la utilización de alternativa 5 'y 3' los sitios de empalme. Los sitios de empalme alternativos que se utilizaron variada entre los diferentes provirus (Fig. 5). Aquellos que fueron detectados (Fig. 5) en algunos casos igualaron las señales de consenso para los spliceosomas mayores o menores, mientras que en otros casos no lo hicieron (Fig. 5). La mayoría de las transcripciones empalmados alternativamente eran de tipo 1 provirus, pero uno de ellos, K (I), era de un tipo 2 provirus. Así, el uso alternativo del sitio de empalme no era únicamente una consecuencia de la ausencia de la 292 pb. K111 es un provirus de edad avanzada que se formaron antes de la divergencia del linaje de gorilas del linaje humano-chimpancé hace o menos 8 millones de años [25], [59], pero los otros provirus desde que se detectaron aquí las transcripciones longitudinalmente están humano específico.
las porciones 5 'y 3' de un provirus HERV-K se muestran en la parte superior separadas por /y /. 5'SS y 3'SS indican los sitios de empalme convencionales de HERV-K, y sus posiciones están marcados con círculos negros. Las posiciones de los cebadores de PCR exteriores utilizados para la PCR anidada se muestran como flechas. Estructuras de la env empalmados productos de RT-PCR a partir de las líneas celulares y provirus indicados se esquematiza a continuación el genoma viral. líneas en forma de puntos muestran los intrones extirpados. Los círculos rojos muestran las posiciones de las secuencias de empalme donde se produjo poco convencional. Para cada producto cortado y empalmado, la secuencia de la parte superior muestra la secuencia de transcripción primaria deducida determinado a partir de la del locus genómico cognado, y la secuencia inferior muestra la secuencia del producto de RT-PCR. nucleótidos rojos se unieron en el producto cortado y empalmado. nucleótidos grises muestran los extremos de las secuencias intrónicas extirpados. Se muestra la posición de la deleción de 292 nucleótidos definitiva de tipo 1 provirus.
Las líneas celulares en las que se detectaron los sitios de empalme 1X-env alternativas se resumen en la Tabla 2 y la Figura 5. Para K102, se detectaron los mismos sitios de empalme alternativo en seis líneas celulares diferentes, y para K117, se detectaron los mismos sitios en dos (Fig. 5). Esto sugirió que las secuencias de los transcritos específicos (y los provirus de los cuales se derivaron) determinado uso alternativo del sitio de empalme. Se detectaron las transcripciones empalmados alternativamente en la mayoría de las líneas celulares, y en algunos casos, se detectaron tanto en los sitios de empalme convencionales y alternativos para determinados provirus (K102, K (I), y K117). No está claro a partir de este análisis de si la naturaleza de las células contribuyó a los patrones de empalme observadas. En resumen, los sitios de empalme alternativos detectado representaron las diferentes bandas de tamaño detectado en las reacciones de RT-PCR a través de la unión 1X-env de empalme (. Figs 2 y 3). Sin embargo, la detección frecuente de ellos y la variación entre los diferentes provirus HERV-K fueron inesperados, y la posible base biológica molecular para ellos era desconocido.
La secuenciación de los diferentes productos de tamaño también se llevó a cabo por PCR realizadas con los cebadores para detectar los ARN doblemente empalmados (datos no mostrados). Los aproximadamente 800 producto menos prominente, pb (Fig. 2B) correspondió a convencionalmente empalmado
rec
ARNm. PCRs anidadas confirmaron la presencia de mRNA rec en 9 de 13 líneas celulares (Fig. 3). Además, la secuenciación mostró que la banda prominente más pequeño en la Figura 2B corresponde al RNA empalmados de la 5'SS aguas arriba de
gag
a la 3'SS aguas abajo del segundo intrón en
rec
mRNA . Este ARN se ha descrito anteriormente [57], pero no se sabe que codifican ninguna proteína.
radiación ionizante (IR) Aumenta HERV-K Transcripción en líneas celulares de cáncer de próstata
Una vez establecido que HERV -K se transcribió en una variedad de líneas celulares de cáncer humano, nos preguntamos si la radiación ionizante puede alterar los niveles de transcripción viral. Cuantitativa, RT-PCR (qRT-PCR) se realizó en ARN aislado de las 12 líneas celulares que mostraron HERV-K transcripción. Las células en 50% de confluencia se irradiaron en una sola exposición a un
fuente de 137Cs. Las dosis de γ-irradiación se varió a 0, 2,5, 5, 10 o 20 Gy, y se recogieron las células en 1 de cada dosis, 3, 8, 24, y 72 horas después de la irradiación. El par de cebadores utilizado fue diseñado en
env
, aguas abajo de la deleción de 292 nucleótidos, de modo que detecta tanto ARN unspliced y mRNA env empalmados por enlaces sencillos (Fig. 1). Cada experimento se realizó tres veces por separado, y tres réplicas RT-PCR se realizaron en cada una de las réplicas biológicas.
La mayoría de las líneas celulares, incluyendo las tres líneas de cáncer de cuello uterino ensayados, los tres tumores de cabeza y cuello, y tres de las líneas de cáncer de mama no mostraron diferencias notables en el nivel de transcritos de HERV-K en cualquier dosis de radiación ionizante y en cualquier punto (Fig. 6) tiempo. Sin embargo, todas las líneas celulares de carcinoma de próstata tres observó una elevación significativa de los niveles de transcripciones HERV-K (Fig. 6). Los aumentos en las tres líneas celulares de cáncer de próstata fueron más evidentes en las 24 horas después de la irradiación. Los niveles de viral
env
ARN a las 24 horas se aumentó de dos a ocho veces en comparación con las células no irradiadas. No paramétrico, se realizaron pruebas de rangos con signos de Wilcoxon-para comparar las mediciones en cada dosis de radiación gamma con aquellos a 0 Gy, y los P-valores se presentan en la Tabla 3. Todos los aumentos en las líneas celulares de cáncer de próstata a las 24 horas fueron significativas con valores de p & lt; 0,01. Por lo tanto, eran uniformemente significativa en estas líneas y no se observaron en todas las dosis de radiación utilizadas. Algunos aumentos de estas líneas fueron evidentes en algunas de las muestras a las 8 horas después de la irradiación, pero no a 3 horas. Todos los aumentos fueron transitorios, ya que por 72 horas después de la irradiación, los niveles de HERV-K habían vuelto a la línea de base con todas las dosis de γ-irradiación. En general, se observó el máximo nivel de inducción a 20 Gy, la dosis más alta utilizada, aunque se observaron aumentos significativos en todas las dosis y no había una correlación obvia entre la dosis específica y el aumento de pliegue entre las líneas celulares de cáncer de próstata.
posiciones genómicas de los cebadores usados se muestran en la Fig. Se han usado 1. Cinco dosis de radiación ionizante diferentes (0, 2,5, 5, 10, y 20 Gy), cada uno aplicado en una sola dosis, se muestran en diferentes colores en cinco momentos diferentes después de la γ-irradiación (1, 3, 8 , 24 y 72 horas). factor de cambio en relación con 0 Gy para cada punto de tiempo se obtuvo mediante la normalización de 3 genes de limpieza. Las barras representan las medias de tres independiente RT-PCR réplicas que llevan a cabo para cada uno de tres experimentos. Las barras de error muestran las desviaciones estándar.
Una de las líneas celulares de carcinoma de mama de cuatro (MCF-7) también mostraron un aumento en los niveles de ARN HERV-K-γ después de la irradiación (Fig. 6) . La cinética del aumento fueron similares a lo que se observó en las tres líneas de cáncer de próstata con un aumento máximo de seis veces observaron 24 horas después de la irradiación en las células tratadas Gy 10. Tanto los 5 y 10 dosis de Gy produjeron aumentos estadísticamente significativos (Tabla 3), y los aumentos de mayor de dos veces se observaron 8 y 24 horas después de varias dosis diferentes de γ-irradiación, lo que indica que hubo un efecto modesto de γ-irradiación en esta línea.
en resumen, los niveles de HERV-K ARN se incrementaron sustancialmente por la radiación ionizante en una fracción de las líneas celulares de cáncer probados. Los aumentos fueron transitorios y alcanzaron un máximo de aproximadamente 24 horas después de la irradiación. Este efecto se observó en todas las líneas celulares de cáncer de próstata tres probados, lo que sugiere que los HERV-K en estas células pueden ser particularmente sensibles a la radiación ionizante.
Discusión
Las principales conclusiones de este estudio fueron que la radiación ionizante aumenta los niveles de transcripciones HERV-K en algunas células de cáncer, y que los efectos varió entre las líneas ensayadas. En particular, todas las líneas de cáncer de próstata tres que se probaron exhiben una mayor significativamente los niveles de HERV-K ARN, que alcanzó un máximo de alrededor de 24 horas después de la exposición a una sola dosis de γ-irradiación y luego se calmó.