Extracto
Introducción
El cáncer de páncreas (PCA) es un tumor agresivo que se asocia con altas tasas de mortalidad. La mayoría de los pacientes son diagnosticados PCA por lo general en las etapas finales de los años tumorales cuando las opciones terapéuticas son limitadas. Los microARN (miARN) participan en el desarrollo de tumores y son comúnmente dysregulated en PCA. Como prueba de principio de estudio, que tuvo como objetivo evaluar el potencial de miRNAs fecales como biomarcadores para el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
ARN total fue extraído de las heces utilizando miARN Mini Kit de Qiagen . Para la expresión de los genes miARN los análisis se seleccionó un subconjunto de 7 miRNAs que se dysregulated frecuencia en la PCA (miR-21, -143, -155, -196a, -210, -216a, -375). Posteriormente, los niveles de expresión de estos miRNAs se determinaron en muestras fecales de los controles (n = 15), pancreatitis crónica (n = 15) y pacientes de PCA (n = 15) usando ensayos TaqMan-PCR cuantitativa.
Resultados
Todos los miRNAs seleccionados fueron detectables en las muestras de heces con una alta reproducibilidad. Cuatro de los siete miRNAs (miR-216a, -196a, -143 und -155) se detectaron en concentraciones más bajas en las heces de los pacientes de PCA en comparación con los controles (p & lt; 0,05). Análisis de la expresión de los genes miARN fecal en los controles y los pacientes con pancreatitis crónica y PCA reveló que la expresión de miR-216a, -196a, -143 -155 und fueron más altas en los controles y la más baja en PCA. La expresión de los miRNAs tres restantes (miR-21, -210 y -375) se mantuvo sin cambios entre los controles y los pacientes con pancreatitis crónica o bien PCA.
Conclusión
Nuestros datos proporcionan nuevas pruebas de para la expresión diferencial de miRNAs en las heces de pacientes con PCA. Si validado con éxito en estudios prospectivos a gran escala, los biomarcadores miARN fecales pueden ofrecer herramientas novedosas para la investigación de cribado PCA
Visto:. Enlace A, Becker V, Goel A, T Wex, Malfertheiner P (2012) Viabilidad de Los microARN fecales como nuevos biomarcadores de cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (8): e42933. doi: 10.1371 /journal.pone.0042933
Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 9 Enero, 2012; Aceptado: July 16, 2012; Publicado: 8 Agosto 2012
Copyright: © Link et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas (PCA) es la segunda causa de las muertes relacionadas con el cáncer gastrointestinal en Europa y EE.UU. [1], [2]. A pesar de la investigación básica y clínica intensiva la supervivencia media de los pacientes con PCA se mantiene aproximadamente 6-10 meses después del diagnóstico, lo que pone de relieve la biología del tumor agresivo de esta enfermedad [3]. La mayoría de los pacientes con PCA (& gt; 80%) presentes con diseminación tumoral regional o distante el momento del diagnóstico que los hace no elegibles para extirpación quirúrgica del tumor, que es en la actualidad la única terapia curativa potencial para esta malignidad [1], [3]. Además de los posibles modificaciones preventivos del cáncer de estilo de vida (dieta, ejercicio físico, dejar de fumar, etc.), el cribado y la detección temprana de la PCA se considera como la estrategia más prometedora para la reducción de la mortalidad asociada a la PCA [4] - [6]. detección clínica actual y el manejo diagnóstico de los pacientes de PCA se basa en técnicas de imagen como la ecografía endoluminal (USE) o tomografía computarizada multidetector con contraste. Sin embargo, debido a su naturaleza invasiva, el uso de la radiación, y la baja sensibilidad /especificidad, tales técnicas en el mejor de sólo podrán utilizarse para el cribado en pacientes de alto riesgo (por ejemplo hereditaria PCA, el síndrome de Peutz-Jeghers, etc.) [6], [7]. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata para la identificación y desarrollo de nuevos biomarcadores de diagnóstico, tecnologías de preferencia no invasivos que podrían predecir el desarrollo de la PCA o su diagnóstico en etapas más tempranas.
La importancia de los biomarcadores no invasivos tiene tiempo que se reconoce. En consecuencia, sangre, heces u otros fluidos corporales se cree actualmente que las mejores vías para la investigación de biomarcadores que incorpora un amplio espectro de alteraciones genéticas y /o epigenéticos asociados con el cáncer [6], [8]. En base a este paradigma, múltiples biomarcadores tales como hTERT, CA72-4, osteopontina, REG4, MIC-1,
K-ras
,
P-53
o metilación aberrante de las islas CpG de los genes supresores de tumores están actualmente bajo evaluación [3], [9] - [11]. Sin embargo, hasta la fecha, sólo el antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9) ha encontrado su utilidad clínica en la detección precoz de la enfermedad recurrente, tras el tratamiento quirúrgico de los pacientes PCA [12]. Sin embargo, el uso de CA 19-9 para el PCA-selección no se recomienda debido a la baja sensibilidad y especificidad [13].
Los microARN (miRNA), las pequeñas transcripciones no codificantes de $ ~ $ 22 nucleótidos, tienen poco sido identificado como una nueva clase de moléculas celulares con implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas significativas [14]. MiRNAs juegan un papel importante en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos [15]. En virtud de la regulación de la expresión génica, los miRNAs están involucrados en las primeras etapas de la patogénesis del cáncer de varios cánceres humanos [15], [16]. Además, la existencia de los patrones de expresión de los genes miARN únicas permitir la identificación de diferentes tipos y subtipos de cáncer [17] - [19]. Una de las características más interesantes de miRNAs es su estabilidad biológica en comparación con el ADN o ARNm. MiRNAs son notablemente protegidos de la degradación endógena y exógena debido a su tamaño y exosomal pequeña presencia en los fluidos del cuerpo [20], [21]. Sobre la base de este paradigma, varios grupos de investigación han demostrado independientemente el potencial de los genes miARN como biomarcadores basados en sangre para PCA [21] - [23]. Mientras que el enfoque basado en la sangre es todavía un tema de la investigación intensiva, también se ha sugerido que las alteraciones genéticas y epigenéticas relacionadas con el cáncer gastrointestinal se pueden detectar en las heces potencialmente [8], [24]. Teniendo en cuenta el alto volumen (~ 1,5 l) de la producción de jugo pancreático y la excreción en el intestino, se ha planteado la hipótesis de que los cambios moleculares relacionados con el cáncer precancerosas o principios pueden ser detectables en las heces y sangre de pacientes con cáncer de páncreas, proporcionando una fuerte razón fundamental para fecal la investigación de biomarcadores [8]
.
Teniendo en cuenta que la ACP se asocia con el patrón de alteración única de los genes miARN expresión, la hipótesis de que la firma miARN expresión puede ser identificables en las heces de pacientes con neoplasia de páncreas. En consecuencia, en el presente estudio, se evaluó el potencial de expresión de miRNA fecal análisis para la identificación de PCA. Como prueba de principal, se demuestra que varios miRNAs fecales se expresan diferencialmente en los pacientes con enfermedad pancreática. Piloto de análisis de muestras de heces de pacientes con pancreatitis crónica y PCA sugieren un posible papel de miRNAs fecales como nuevos biomarcadores en la detección precoz del PCA.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas
El estudio se realizó en las muestras fecales archivados de pacientes consecutivos que han sido recogidos para los análisis clínicos y las heces recogidas de forma prospectiva a partir de sujetos sanos. Todos los voluntarios sanos reclutados prospectivamente siempre el consentimiento informado y el protocolo fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional en el Baylor University Medical Center [24]. Las muestras fecales archivados se des-identificados, ya que el consentimiento informado por escrito no se pudo obtener debido a la migración del paciente o la muerte, y el protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Magdeburgo (Magdeburg, Alemania). Un total de 45 muestras de heces, incluyendo 15 controles, 15 pacientes con pancreatitis crónica y 15 pacientes de PCA se incluyeron en el estudio. Las muestras de control fueron seleccionados al azar de las muestras de heces para la detección de
Helicobacter pylori Hoteles en las heces de los pacientes con trastornos GI-no malignas como el reflujo o gastritis. Las muestras de pacientes con pancreatitis crónica y PCA fueron seleccionados de pacientes consecutivos con muestras de heces congeladas disponibles, que se recogieron para el análisis de
elastasa
niveles fecales como una prueba de diagnóstico de rutina para la insuficiencia pancreática exocrina. Los datos clínicos y demográficos de los pacientes se presentan en la Tabla 1.
Las muestras de heces recogida
Se recogieron todas las muestras y se procesan de manera uniforme mediante el uso de tubos de recogida de heces de muestra (Sarstedt AG, Nümbrecht, Alemania) como se practica en los entornos clínicos de rutina. Se pidió a los pacientes ambulatorios para recoger las heces en el hogar y llevar las heces durante la próxima presentación en el departamento. Muestra de heces de pacientes estacionarios se han recogido en forma similar. Antes de alcanzar el laboratorio las muestras se almacenaron a + 4 ° C o a temperatura ambiente. Una vez que las muestras llegaron al laboratorio, las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenan de forma continua a -30 ° C hasta su uso posterior.
aislamiento de ARN
ARN total (incluyendo miRNAs) se extrajo de muestras de heces utilizando Qiagen de miRNAeasy Mini Kits (Qiagen) como se describe anteriormente [24]. Brevemente, aproximadamente 30-50 l de heces alicuotar congelado se homogeneizó con agua libre de RNasa a un total 150 l y rápidamente se lisaron con 800 l de reactivo de lisis QIAzol (Qiagen, Hilden, Alemania). La precipitación se lleva a cabo con cloroformo y la fase acuosa se mezcló con 1,5 volúmenes de etanol al 100%. Después de la elución, la calidad del ARN se evaluó mediante relaciones A260 /A280 usando espectroscopía UV y las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su posterior análisis.
MicroARN cuantificación mediante PCR en tiempo real
Cuantitativa miARN expresión se realizaron análisis utilizando TaqMan miARN ensayos (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) o el método SYBRgreen de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describe anteriormente [24]. Después de la transcripción inversa, las muestras se realizaron utilizando iCycler IQ® sistema de detección (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Para evitar un sesgo entre placas /variabilidad, la expresión de los genes miARN análisis se realizaron utilizando una sola placa de 96 pocillos por duplicado. Las diferencias entre los grupos se presentan como Ct, que representan las diferencias entre el valor Ct media de la miARN de interés y el valor medio de la Ct normalizador miARN. Utilizamos miR-16 para la normalización miRNA fecal en todas las muestras ya que se ha demostrado que se expresa más consistentemente en diferentes muestras fecales incluyendo muestras de pacientes con cáncer colorrectal, como se describe anteriormente [24]. Selección de microRNAs se realizó utilizando los criterios siguientes: a) reportados como microARN específicos de páncreas (miR-375) [25]; b) se ha informado de la implicación potencial en la carcinogénesis pancreática (miR-21, -196a, -210, -143, -155, -375, -216a) [26] - [28]; c) la expresión diferencial de miRNAs se ha informado de la sangre (miR-21, -155, -196a, -210) [21] - [23] y /o líquido pancreático (miR-21, -155; Tabla 2) [29 ]. primer secuencias de los ensayos de RT-PCR se enumeran en la Tabla S1.
Micro RNA microarrays de perfiles de expresión y análisis de datos
Micro RNA microarrays de perfiles de expresión se realizó con el objetivo de evaluar la presencia de una selección de miRNAs en las heces como se describe anteriormente [24]. Brevemente, el ARN total se extrajo a partir de una sola muestra de heces de un sujeto sano usando Mini Kit miRNAeasy de Qiagen como se describe anteriormente. La amplificación y la hibridación se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina, Inc., San Diego, CA). procesamiento de datos de microarrays y el análisis se realizaron utilizando el software BeadStudio de Illumina. La normalización se ha realizado utilizando el paquete de software Lumi Bioconductor crear registrar los valores de expresión de los genes miARN [30]. Después de la etapa de filtración sonda conservadora, que excluía las sondas que no alcanzaron un valor de detección de P & lt; 0,05 los análisis dieron como resultado la detección fiable de 630 sondas
El análisis estadístico
Los datos se realizaron análisis con. GraphPad Prism 4.0 (San Diego, CA, EE.UU.) o SPSS 17.0 (IBM Deutschland GmbH, Munich, Alemania). Se analizaron las diferencias entre los dos grupos utilizando la prueba t de Student. Se analizaron las diferencias entre más de dos grupos utilizando el método de Kruskal-Wallis con comparación múltiple de Dunn apropiada
post hoc
prueba. Los análisis de correlación se realizaron mediante la prueba de Pearson. Siempre que sea apropiado, la regresión logarítmica se utilizó para calcular el R
2 y para crear la ecuación de la pendiente. Un valor de p de dos caras de. & Lt; 0,05 fue considerado como significativo
Resultados
Selección de miRNAs fecal
Para investigar si los pacientes tienen PCA detectables fecales alteraciones de expresión de los genes miARN, que por primera vez los análisis sistemáticos de la literatura con el objetivo de seleccionar varios miRNAs con mayor evidencia de la desregulación de los genes miARN en pacientes de PCA. Sobre la base de la expresión de los genes miARN diferencial en los tejidos tumorales pancreáticas [18], [26] - [28], las alteraciones en el jugo pancreático [29] y en la sangre [21] - [23], como se describe anteriormente. Posteriormente, se seleccionaron 5 upregulated (miR-21, -210, -143, -155, -196a) y 2 miRNAs downregulated (miR-216a y -375) para análisis posteriores. La Tabla 2 proporciona una visión global de las alteraciones relacionadas con el PCA de expresión de los genes miARN. Para obtener una visión global de la detectabilidad de los miRNAs seleccionados en las heces de los voluntarios sanos, fecal de perfiles de expresión de los genes miARN se ha realizado mediante microarrays miARN utilizando una sola muestra de heces de los voluntarios sanos. Como se muestra en la Figura 1A, todos los seleccionados miRNAs estaban presentes en las heces en concentraciones detectables
(A) expresión de miARN microarray análisis se realizaron con Illumina microarrays para evaluar la presencia de miRNAs seleccionados (miR-16,. - 375, -196a, -216a, -21, -143, -155 y -210) en una sola muestra de heces del sujeto sano. miARN expresión fecal se convierten en valores siguientes Lumi Bioconductor normalización de expresión-log. (B & amp; C) La expresión de los genes miARN elegido fue confirmada en todas las 45 muestras incluyendo los controles, la pancreatitis crónica y pacientes con cáncer de páncreas. La figura (B) representa los valores Ct expresión miARN prima para la evaluación cualitativa. (C) La normalización se realizó a través de Ct-método estándar utilizando el miR-16 como normalizador fecal interna.
La variación y la normalización de miRNAs fecales
A continuación, se evaluó la expresión de los genes miARN en todo muestras simultáneamente. En general, todos los miRNAs fecales analizadas mostraron un alto grado de variación (más de 10 Ct 's) de los valores brutos (Figura 1B). Para normalizar la expresión de los genes miARN, Ct-valores se calcularon utilizando el miR-16 como un normalizador endógena interna como se describe anteriormente [24]. Tras la normalización, hemos descubierto que los niveles de expresión de miR-375, -21 y -210 demostraron baja (desviación estándar (± DE) de 0,76, 0,71, 0,78, respectivamente), y las de miR-216a, -143 y -155 ( SD ±: 3,31, 1,97, 2,15, respectivamente) mostró una alta variación entre individuos en todas las muestras (Figura 1C)
estabilidad
a largo plazo de miRNAs fecales
Se ha demostrado previamente que. miRNAs fecales son estables en muestras recién tomadas o FOBT-kits [24], pero no se sabe si los miRNAs son estables durante el almacenamiento a largo plazo. Para probar la estabilidad de miRNAs en las condiciones de almacenamiento a largo plazo, se analizaron muestras fecales de miARN un grupo adicional de 30 sujetos sanos. Entre estos, se recogieron muestras fecales quince (1-15) entre 2004 y 2006 y quince muestras (16-30) entre 2009 y 2010. Como se muestra en la Figura 2A, todos los miRNAs analizados mostraron niveles similares de expresión tanto para el miR-16 y miR-196a. Media ± SD para miR-16 (Figura 2B) fue 30,53 ± 2,21 para las muestras después de un almacenamiento a largo plazo en comparación con 29,59 ± 1,39 para las muestras recogidas recientemente (p = 0,172), y el de miR-196a fue 33.41 ± 2.84 vs 32.75 ± 1,43 (p = 0,426), respectivamente (Figura 2C). Después de la normalización con el miR-16, significa? Ct valor de miR-196a fue -2,88 ± 1,03 para las muestras recogidas de 2004-2006 -3,16 ± 0,93 (p = 0,441) para las muestras recogidas durante 2009-2010 (Figura 2D).
Para evaluar la estabilidad a largo plazo de las muestras, se realizó un análisis de miARN en las muestras fecales recogidas a diferentes puntos de tiempo. Las muestras 1-15 fueron recogidos entre 2004 y 2006 y las muestras 16-30 entre 2009 y 2010 a partir de sujetos sanos. Todas las muestras se almacenan y se procesan en condiciones similares. La figura (A) muestra las variaciones en el miR-16 y la expresión de miR-196a entre todas las muestras de heces. (B) de miR-16 y (C) la expresión de miR-196a en los análisis de subgrupos mostró una expresión similar (p & gt; 0,1). (D) normalizada de expresión de miR-196a es comparable en largo y las muestras almacenadas a corto plazo (p = 0,441). (E) Dado que miR-216a estaba presente en las heces a concentraciones más bajas, y su expresión se analizó por dos RT-PCR cuantitativa independiente corre para evaluar la reproducibilidad del análisis (p & lt; 0,0001). La normalización se realizó con el uso de miR-16 como normalizador interna.
reproducibilidad de los resultados de los miRNAs con baja expresión
Entre todos analizaron miRNAs, MIR-216a estaba presente en las heces al más bajo concentración (Figura 1C). Para investigar si los genes miARN incluso con baja expresión puede ser fiable y reproducible analizados en las heces, hemos realizado dos mediciones independientes de expresión. Como se demuestra en la Figura 2E, la expresión de miR-216a se detectó de forma reproducible en las heces de todas las muestras a pesar de su baja concentración (R
2 = 0,761, p & lt; 0,0001)
Expresión diferencial de miRNAs fecales en pacientes de PCA.
Para evaluar si los genes miARN enfoque de análisis de la expresión fecal podría ser útil en el diagnóstico de PCA, se evaluaron 45 muestras fecales. Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Quince muestras de heces de los controles se compararon con quince de cada uno de los pacientes con PCA y con pancreatitis crónica. Los 7 miRNAs ensayadas que se dysregulated en abundancia en el cáncer de páncreas, estuvieron presentes en las heces, aunque con variaciones específicas en la expresión de los genes miARN. Cuatro de 7 miRNAs (miR-196a, -216a, -143 y -155) se expresaron en niveles significativamente más bajos en las muestras de heces de pacientes con PCA en comparación con los controles (Kruskal-Wallis con post test de Dunn p & lt; 0,05 para miR-196a y miR-216a y p & lt; 0,001 para el miR-143 y -155). Entre éstos, sólo miR-143 y -155 revelan diferencias significativas entre los pacientes con pancreatitis crónica y controles. Curiosamente, los análisis de subgrupos entre los tres grupos reveló disminución gradual en el
mediana
? Ct de miARN expresión en muestras fecales de los controles para reducir la expresión en pacientes con pancreatitis crónica y la más baja en los pacientes con PCA (miR-196a: -2.50 vs. -3.00 vs. -3.65; miR-216a: -5,30 vs -9,10 -10,80 vs.; miR-143: -5,20 vs -6,00 vs -7,35 y miR-155: 0,15 vs -1.95 vs. -2.55 para los controles contra la pancreatitis crónica vs. PCA, respectivamente) como se muestra en la Figura 3. Cabe mencionar que a pesar de la expresión de los genes miARN más bajos en las heces de los pacientes con PCA y la pancreatitis crónica, miARN expresión diferencias no fueron estadísticamente significativas. Cabe destacar que el miR-21, -375 y -210, que se desregula con frecuencia en los cánceres de páncreas, se comprobó que estaban sin cambios en las heces de los controles y los pacientes con pancreatitis crónica y PCA (Figura 3).
Figuras (A ) a (G) representan diferentes miRNAs que fueron seleccionados para el estudio sobre la base de las alteraciones en los tejidos de la PCA. * Representa p & lt; 0,05, *** - p & lt; 0,001. Abreviaturas: sujetos de control N, CP- pancreatitis crónica, PCA- cáncer de páncreas. Los datos se presentan como diagramas de caja y patillas: los límites superior e inferior de las cajas indican la 75
y 25
º percentiles, las líneas dentro de las cajas - las medianas, y la parte superior e inferior horizontal bares denotan la 90
y 10
º percentiles, respectivamente.
Una combinación de miRNAs como herramienta de diagnóstico para la PCA
se informó previamente que el patrón de expresión de varios miRNAs en lugar de solo miARN probablemente daría lugar a una mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de los cánceres humanos [28]. Basándose en esta suposición la hipótesis de que la combinación de 4 miRNAs expresados diferencialmente proporcionaría mejor discriminación de los pacientes con PCA en comparación con los controles. Desde los 4 miRNAs mostraron disminución gradual en la expresión de los genes miARN, se resumieron? Ct-valores de miR-196a, -216a, -143 y -155 para cada muestra. Como se muestra en la Figura 4, los
mediana
ΣΔCt-valores fueron: para los controles -12.78 -21.45 frente a frente a la pancreatitis crónica -23,25 por PCA (prueba de Kruskal-Wallis p & lt; 0,0002, controles posteriores a la prueba de Dunn vs. crónica pancreatitis o PCA p & lt; 0,05 y 0,001, respectivamente). El uso de esta combinación, se logró
mediana
diferencia de 10,47 (o 1418 veces) entre la ACP y los controles, mientras que la diferencia? Ct-valor por el miR-143 solo era 2,15 (4,4 veces)? Ct-Valor.
la suma de los valores de Ct-de miR-196a, -216a, -143 y -155 se realizó para calcular el valor de Ct-Σ. * - P & lt; 0,05, *** - p & lt; 0,001. Abreviaturas: sujetos de control N, CP- pancreatitis crónica, PCA- cáncer de páncreas. Los datos se presentan como diagramas de caja y patillas: los límites superior e inferior de las cajas indican la 75
y 25
º percentiles, las líneas dentro de las cajas - las medianas, y la parte superior e inferior horizontal bares denotan la 90
y 10
º percentiles, respectivamente.
Discusión
En este estudio de prueba de principio, se evaluó la viabilidad de miRNAs como fecales biomarcadores potenciales para la detección de PCA. El uso de un subconjunto de miRNAs que se dysregulated frecuencia en PCA, se encontró que el miR-196a, -216a, -143 y -155 están presentes en niveles más bajos en muestras fecales de pacientes con PCA en comparación con los controles. Además, se muestra que cambios en la expresión de los genes miARN fecal también se pueden detectar en los pacientes con pancreatitis crónica. Por último, se demuestra que una combinación de un subconjunto de miRNAs puede proporcionar un valor diagnóstico superior con una mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de la neoplasia de páncreas.
Además de las técnicas de imagen, hay una clara necesidad de modalidades alternativas para la detección precoz de la PCA. Por ejemplo, la colección invasiva del jugo pancreático o cepillado conducto pancreático puede parecer potencialmente prometedoras; esto sólo se puede realizar en un número limitado de pacientes, debido a su capacidad de invasión y la falta de idoneidad para fines de selección. la investigación de biomarcadores basados en la sangre siempre ha sido el foco, ya que tiene un enorme potencial para el desarrollo de enfoques de detección no invasivos. Sin embargo, las heces también se han sugerido como alternativa prometedora, especialmente para tumores malignos relacionados GI-, debido a desprendimiento constante de células exfoliadas y la producción de líquido pancreático [8], [24]. Se cree que los marcadores fecales pueden incluso tener un mayor rendimiento de diagnóstico, ya que las alteraciones relacionadas con el cáncer moleculares en el ADN, ARNm y miRNAs se pueden detectar mucho antes en las heces. Recientemente, nosotros y otros han demostrado que la detección de miRNAs fecales es un enfoque viable que tiene un alto grado de reproducibilidad, y que los pacientes con neoplasia de colon a menudo muestran una mayor expresión de miR-21 y -106a en comparación con los controles [24], [31 ]
en la actualidad, existe evidencia convincente de alteraciones específicas de tejido en la expresión de los genes miARN en PCA [21], [26] -. [28]. Esos miRNAs han sido objeto de múltiples estudios que demuestran complejas interacciones con las principales vías y metas en la carcinogénesis pancreática. Con base en los conocimientos existentes para miARN patrones de expresión en PCA, en el presente estudio se seleccionaron 7 miRNAs asociados-PCA que son o bien arriba (miR-21, -155, -143, -210 y - 196a) o hacia abajo-regulada (MIR -375, -216a) para la expresión de los genes miARN análisis en las heces. En un estudio pivotal, Bloomston et al. demostrado que la ACP tiene patrón de expresión de los genes miARN distinta con alteraciones específicas de miRNAs 25 vs. tejidos pancreáticos benignos y 21 miRNAs al comparar a los tejidos con pancreatitis crónica. El uso de este patrón de expresión de los genes miARN los autores podría distinguir tejidos de PCA de tejidos benignos y pancreatitis crónica con precisión de más del 90% [26]. Posteriormente, se demostró que la expresión de miR-21 y -196a se asoció con una alta proliferación (Ki67-index), presencia de metástasis en el hígado y la predicción de supervivencia pobre /pronóstico [19], [26]. Nuestros datos confirman informes anteriores que demuestran una notable estabilidad de miRNAs fecales en las heces, así como sus altas concentraciones presentes en muestras fecales [24], [32], [33]. Aplicando un enfoque basado en objetivos, encontramos diferencial de los genes miARN expresión de 4 de cada 7 miRNAs (miR-196a, -216a, -143 y -155) en las heces de pacientes con PCA en comparación con los controles, mientras que 3 miRNAs (miR-21, -375 y -210) se expresaron en niveles similares entre los distintos sujetos sanos y pacientes. En este estudio de prueba de principio de que era algo sorprendente observar que cuatro de los miRNAs expresados diferencialmente en nuestro estudio mostraron una disminución de la expresión de los genes miARN en las heces de los pacientes con PCA, mientras que los estudios anteriores han demostrado la regulación positiva de miR-196a, y -143 - 155 en los tejidos tumorales pancreáticas de pacientes con cáncer de páncreas y la baja regulación de miR-216a [26] - [28]. La hipótesis de que la razón para el cambio en vs. fecal tejidos expresión de estos miRNAs puede ser debido a las alteraciones en la salida del líquido de páncreas, que es con frecuencia patológica en pacientes con cáncer pancreático y puede ser parcialmente responsable de esta observación discrepante. Debido a la naturaleza retrospectiva del estudio, no hemos podido reunir datos para el estado de obstrucción del conducto biliar /pancreática o realizar tumoral emparejados y análisis fecal miARN. Sin embargo, nuestras ganancias hipótesis apoyo de varios otros estudios. En primer lugar, se ha demostrado previamente que los miRNAs seleccionados (miR-21, -210, -155, -196a) fueron regulados positivamente en el plasma de pacientes con PCA, lo que sugiere su implicación mecanicista en los cánceres de páncreas [21], [22]. En segundo lugar, un estudio independiente ha demostrado un aumento de la expresión de miR-155 en el líquido pancreático de pacientes PCA [29], más el apoyo a nuestra observación. En tercer lugar, la nuestra observación de la disminución gradual gradual en la expresión de miRNAs seleccionados en las heces de pacientes con pancreatitis crónica en comparación con los controles y los pacientes de PCA apoyar este argumento. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la expresión de los genes miARN fecal entre PCA y los pacientes con pancreatitis crónica que pueden reflejar ya sea el alto riesgo para el desarrollo de PCA en pacientes con parálisis cerebral de un lado o potencialmente pueden sugerir una relación de exocrina o insuficiencia pancreática endocrina .
en este estudio, los perfiles de miARN se utilizó exclusivamente para ganar visión global para la identificación de los patrones de expresión de genes miARN en muestras fecales de pacientes con cáncer de páncreas. Dado que las muestras disponibles de forma retrospectiva fueron recogidos y almacenados a largo plazo, que a propósito evitamos perfiles de estos tejidos tumorales con el fin de evitar un posible sesgo de selección a través de una técnica basada en microarrays de alto rendimiento. A pesar de que los miRNAs seleccionados mostraron diferencias insignificantes entre CP y los pacientes de PCA, creemos que se cree que los resultados de provocar a la investigación PCA biomarcador, y proporcionamos una plataforma atractiva para la realización de estudios prospectivos adicionales en el futuro para evaluar sistemáticamente las diferencias potenciales en miRNAs que son exclusivos de estos subgrupos de pacientes con respecto a la condición de conducto pancreático y la bilis. Los resultados de nuestro estudio ponen de relieve la necesidad de seguir investigando sobre la importancia biológica de miRNAs desregulados en la neoplasia de páncreas. Como se muestra en la Tabla 2, la mayoría de los miRNAs analizados en nuestro estudio tienen múltiples objetivos de genes validado, relacionadas con cáncer en los cánceres humanos. Por ejemplo, Gironella et al. han demostrado que la proteína miR-155 dianas tumorales 53 inducida por la proteína nuclear 1 (TP53INP1) interrumpir su actividad anti-tumoral en las células de cáncer de páncreas [34]. Varios grupos han demostrado que el miR-21 metas PTEN, Reck PDCD4, que pueden ser responsables de papel oncogénico de miR-21 [35], [36]. Del mismo modo, miR-143, que está desregulado con frecuencia en los cánceres de páncreas, se ha demostrado que interactúan con KRAS [37] y la restitución de supresor de tumor miARN puede inhibir el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas usando entrega nanovector de miR-143/145 [38 ]. Además, el miR-196a y miR-210 se ha demostrado que desempeñan un papel oncogénico apuntando a varios genes supresores de tumores (ANXA1, KRT5, RAD52) que afecta a la proliferación y el estrés hipóxico [39] - [42], mientras que el miR-375 y -216a , que con frecuencia se downregulated en el cáncer de páncreas, han sido implicados en la secreción de insulina y en la regulación de la supervivencia y la proliferación celular por la orientación de varios oncogenes tales como PDK1, JAK2, ATG7 [25], [43] - [46]. Estos datos son atractivos para su posterior investigación intensiva de la importancia biológica de miRNAs como efecto biológico de exosomal miARN puede estar más allá de los efectos celulares tumorales o locales [47], [48].
Los datos actuales implican que los patrones de expresión de los genes miARN, en lugar de un solo miARN podría ser necesario para una mejor utilidad para un enfoque de diagnóstico basado en miRNA. Por ejemplo, en nuestro estudio, hemos realizado una simple suma de los valores de Ct que permitan realizar una mejor discriminación de los pacientes? Ct-valores de la mediana con PCA en comparación con los controles. Tal enfoque puede ser de importancia si se utilizan patrones de expresión de genes miARN fecal para la detección de otras malignidades GI. Esto es particularmente relevante ya que el análisis fecal se implementa ampliamente en la práctica clínica, por ejemplo, pruebas de sangre oculta en heces para la detección del cáncer colorrectal y para la evaluación de la elastasa pancreática en heces como un biomarcador para la insuficiencia pancreática exocrina. Si validado en el futuro, la visión del enfoque basado en los miARN fecal para la identificación de los tumores gastrointestinales podría traducirse fácilmente en los diagnósticos, un enfoque que, sin duda, tendrá un cumplimiento superior de pacientes en comparación con las pruebas de diagnóstico invasivas disponibles en la actualidad.
Aunque enfoque basado en los miARN prometedor, fecal necesita más investigación intensiva antes de la aplicación clínica. Como ha reconocido con anterioridad, debido a nuestra capacidad de incluir sólo el número limitado de muestras en este estudio de prueba de principio, la significación estadística de los resultados proporciona una evidencia limitada de aplicabilidad clínica y el potencial de fecal miARN para el diagnóstico de los pacientes de PCA en el futuro inmediato. No obstante, creemos que nuestros hallazgos son nuevos y futuros estudios que incluyen prospectivo de recogida de las muestras con diferentes fases del tumor con la anotación de bioquímica y clínica completa para la obstrucción de páncreas /vías biliares son necesarias debido a la posible incidencia de la obstrucción del conducto pancreático en los niveles de expresión de los genes miARN fecal .