Extracto
Introducción
En la mayoría de los casos de cáncer de cuello uterino, el ADN del VPH se integra en el genoma de células de carcinoma. Esta inserción mutacional constituye un marcador molecular muy específica de ADN tumoral para cada paciente. ADN circulante tumor (ctDNA) es un marcador emergente de la dinámica tumorales que requiere detección motivo molecular específica. Para determinar si la secuencia de la unión de células viral podría ser utilizado en la práctica clínica como un marcador específico de ctDNA, se analizaron una serie de sueros de pacientes de cáncer de cuello uterino.
métodos y las conclusiones
Suero especímenes de 16 pacientes diagnosticados con cáncer de cuello uterino HPV16 /18-asociado, y para el cual el locus de integración viral habían sido previamente localizado, fueron analizados. muestras de suero secuenciales, tomadas en diferentes momentos durante el curso de la enfermedad, también estaban disponibles para dos de estos casos. ctDNA se encontró en 11 de 13 pacientes con el tamaño del tumor superior a 20 mm en el diagnóstico y el análisis de muestras de suero secuenciales mostraron que la concentración de ctDNA en pacientes suero se relaciona con la dinámica de tumores.
Conclusiones
Nos informan de que el VPH inserción mutacional constituye un marcador molecular altamente específico de ctDNA en pacientes con tumores asociados al VPH. El uso de este enfoque original, ctDNA se detectó en los pacientes con cáncer de cuello uterino más sobre la etapa I y la concentración ctDNA fue encontrado para reflejar la carga tumoral. Además de su posible valor pronóstico y predictivo, la inserción mutación VPH es probable que constituya un nuevo sustituto molecular de la enfermedad mínima residual y de la recidiva tumoral subclínica en asociado al VPH. Esto es de gran importancia en la perspectiva de la terapia anti-VPH específica
Visto:. Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, S Saada, de la Rochefordière A, et al. (2012) Virus del Papiloma Humano mutacional de inserción: marcador específico de ADN circulante tumoral en el cáncer de cuello uterino pacientes. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10.1371 /journal.pone.0043393
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: July 20, 2012; Publicado: 24 de Agosto, 2012
Copyright: © Campitelli et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una asociación con la Maison Goyard y por una generosa donación de la Sra A. Mauresmo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue apoyado en parte por la asociación de La Maison Goyard, Equipaje- de lujo el fabricante, a través del evento 'Un Bagage vierta Curie'. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Los tipos específicos de virus del papiloma humano (VPH) son reconocidos como el factor etiológico importante en el cuello uterino neoplasia [1]. En las lesiones pre-invasivas, los genomas virales están presentes como moléculas episomal en el núcleo de las células infectadas. En la mayoría de los casos de carcinoma invasivo, sin embargo, las secuencias de ADN de VPH se integran en el genoma celular [2], [3], [4]. así la integración genoma viral representa un paso crucial en la tumorigénesis [5]. Un sitio de integración viral único solo se ha encontrado en más de 80% de los cánceres de cuello uterino [6].
La clonalidad característica, especificidad y estabilidad en el tiempo de la inserción de ADN de VPH en el genoma de células de carcinoma constituyen un muy específica marcador genético de ADN tumoral. Los datos recientes han demostrado que el ADN mutante se pudo detectar en la sangre de pacientes con tumores y que la cantidad de ADN circulante tumor (ctDNA) estaba relacionada con la dinámica de tumores [7]. Esto abre grandes perspectivas para el uso de ctDNA como biomarcador tumoral en pacientes con cáncer [8]. En el cáncer de cuello de útero en estadio avanzado, varios estudios han señalado la presencia del VPH ADN circulante (c-ADN HPV) [9], [10], [11] o de circulación VPH ARN [12]. Estos estudios mostraron que era posible detectar ácidos nucleicos virales en la sangre de pacientes con cáncer de cuello uterino, pero debido a la falta de sensibilidad [10], [13], [14] y la especificidad cuestionable [11], [13], la datos fue de poco impacto clínico. En este contexto, se diseñó un estudio para evaluar el valor de la mutación por inserción de ADN del VPH como un marcador para la detección y la cuantificación de ctDNA el momento del diagnóstico en el suero de pacientes con cáncer de cuello uterino invasivo. También estudiamos las variaciones de la concentración ctDNA durante el curso de la enfermedad. Además, para comparar la sensibilidad de nuestro ensayo original y específica a que se basa en la detección de secuencias de ADN de VPH, también hemos buscado para c-HPV ADN usando cebadores localizados en el gen E7 de HPV16 /18.
Materiales Métodos y
los pacientes y los tumores
a partir de una serie de HPV16 (14 casos) o HPV18 (2 casos) carcinoma de cuello uterino acumulada entre 2001 y 2011, se determinó el locus de inserción viral mediante el DIPS- método PCR [15]. En los 16 casos, las muestras de suero tomadas al momento del diagnóstico antes del tratamiento estaban disponibles. En dos de estos casos, las muestras de suero secuenciales adicionales tomadas durante el curso de la enfermedad también estaban disponibles. Catorce fueron los tumores de carcinoma escamoso invasivo y dos eran glandular. De acuerdo con la reglamentación francesa, todos los pacientes fueron informados y no se oponen a que sus muestras biológicas que se utiliza para la investigación. La carga viral, en muestras de biopsia del tumor se evaluó mediante PCR cuantitativa (qPCR) usando cebadores diseñados en el gen E7 de HPV16 /18, como [6] se describe anteriormente. Como las secuencias de ADN de HPV integradas pueden presentar amplificación en el locus de inserción, el número de copias de inserción mutacional también se evaluó mediante qPCR utilizando cebadores y reactivos proporcionados en la Tabla S1.
KLK3
estado del gen fue tomada como referencia dos copias.
análisis de ADN en suero
Se aisló el ADN de 200 l de suero con QIAamp Min Eluir Kit Virus de Spin (Qiagen , Courtaboeuf, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. La etapa de elución se realizó con 25 l de tampón suministrado. concentraciones de ADN aisladas se midieron usando un sistema de PCR cuantitativa (RT-qPCR) en tiempo real basado en Long Interspaced Elementos Nuclear de detección (LINE) secuencia [16]. Las diluciones de ADN humano normal se utilizaron como estándares y PCR se realizó en 25 l con SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Francia), mezcla de cebadores (1 M) y 2 l de DNA se eluyó con el siguiente condiciones de ciclo: 15 min a 95 ° C y 45 ciclos (15 s, 95 ° C; 15 s, 61 ° C; 1 min, 72 ° C), seguido de una etapa de disociación (15 s, 95 ° C; 15 s , 60 ° C; 15 s, 95 ° C). ensayo de RT-qPCR utilizando Sybr®Green (Applied Biosystems) fue diseñado para amplificar específicamente secuencias de ADN de unión de virus de células (eluido de ADN 2 l) o ADN E7 de HPV16 (eluido de ADN 2 l) con 400 nM de cada cebador en un volumen final de 25 l. Cada grupo de cebadores fue probado en diluciones en serie (de 50 ng /l a 0,5 pg /l) de DNA Matching tumor en Tris-EDTA Buffer con las condiciones del termociclador de 15 min a 95 ° C y 45 ciclos (15 s, 95 ° C ; 1 min, 62 ° C), seguido de una etapa de disociación (15 s, 95 ° C; 1 min, 60 ° C; 15 s, 95 ° C). Primer secuencias y MgCl
2 concentraciones se dan en la Tabla S1. La sensibilidad del ensayo de PCR tenía que ser igual o mayor que 5 pg /l para validar los conjuntos de cebadores. Con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección, 10 repeticiones de ensayo de RT-qPCR se realizaron en cada muestra de suero para la detección de ctDNA y de ADN c-HPV. La cantidad de ctDNA en 200 l de suero corresponde a la suma de la ctDNA detectado en cada réplica positiva. La concentración de ctDNA finalmente se expresa en copias /ml de suero.
Resultados
Clínicamente, estadio de FIGO eran de Ib a IVa y un caso fue una recaída pélvica del SCC de cuello uterino (Tabla 1). El tamaño del tumor fue de 10 a 120 mm. Los valores de antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC) disponible variaron de 1,1 ng /ml a 17,4 ng /ml (umbral de positividad: 1,5 ng /ml). ADN de VPH se integró en diferentes loci (Tabla 1). La carga viral en muestras de tumor varió de 0,5 a 160 genomas de HPV16 por célula (0.8 10
6 a 24 10
6 copias de HPV16 /g de ADN). La concentración de ADN circulante anfitrión varió de 6 10
1 a 77 10
3 copias /ml de suero (Tabla 1). Hemos sido capaces de detectar ctDNA en 11 de los 16 pacientes con diagnóstico de cáncer de cuello uterino invasivo. Tres casos negativos corresponden a la carcinoma etapa temprana (Ib) con un tamaño que varía de 10 a 20 mm (Tabla 1). La concentración sérica de ctDNA varió de 5 a 890 copias /ml de suero, lo que representa de 0,01% a 25% de ADN circulante host. C-ADN del VPH se detectó en 13/16 casos, los tres casos en fase inicial remanente negativo. Los valores variaron 5-8,5 10
3 copias /ml de suero (Tabla 1). Los tres valores más altos (8.5, 3.5 y 3.4 10
3 copias /ml) correspondían a los casos con alta carga viral en muestras de biopsia de tumor, lo que sugiere que el ADN derivado de moléculas episomales también fue detectado por el ensayo.
dinámicas ctDNA fueron analizados en muestras de suero secuencial en dos pacientes. El primer paciente recibió quimioterapia combinada seguida de braquiterapia útero-vaginal y la cirugía (Figura 1, caso n ° 6). El valor ctDNA disminuyó durante el tratamiento y fue nula al final de la terapia, en cuyo momento se observó una respuesta histológica completa en la muestra de la histerectomía. Dos meses más tarde, el paciente desarrolló una metástasis hepática 8 mm y se convirtió en ctDNA detectable de nuevo. niveles crecientes de ctDNA se encontraron más tarde, cuando el paciente desarrolló recurrencia en los ganglios abdominales. La misma dinámica se observaron en el segundo paciente tratado exclusivamente con quimioterapia (Figura 1, caso n ° 13). De interés durante el seguimiento, mientras que la RM pélvica no mostró ninguna modificación significativa, se observó un aumento de ctDNA. Poco después, el paciente presentó una recidiva abdominal asociado con altos niveles de ctDNA. La misma dinámica se observaron con el ADN del VPH-c.
Discusión
Presentamos aquí que, mediante mutación de la integración de VPH como un marcador molecular, ctDNA se pudo detectar en el suero de la mayoría pacientes con diagnóstico de carcinoma de cuello uterino invasivo sobre etapa Ib y que la cantidad de ctDNA reflejan la dinámica de tumores. Puesto que el sitio de integración viral es único para cada paciente, este marcador es altamente específico, mucho más que el marcador SSC [17]. En cuanto a la sensibilidad, se podría detectar ctDNA en 11 de 13 (85%) pacientes con tumores en estadio II-IV, una velocidad en gran medida mayor que el 12% [9], 18% [13], 20% [14] y 50% [ ,,,0],11] de la positividad reportado hasta el momento para el ADN del VPH-c. La práctica de 10 repeticiones para la detección de ctDNA en cada muestra de suero puede dar cuenta de la mayor sensibilidad de nuestro ensayo. Por ejemplo, en la mayoría de nuestros casos positivos, menos del 50% de las repeticiones proporcionado evidencia de ctDNA. Sin embargo, en 2 de los 13 casos con un tamaño & gt tumor; 20 mm, no se encontró ctDNA mientras que c-HPV se detectó ADN. Ambos casos correspondieron a tumores con carga baja inserción VPH (≤1 copia /célula). En contraste, las células de carcinoma cervical frecuencia albergan genomas de VPH libres que también se liberan en la circulación general, aumentando así la tasa de detección de ADN circulante viral. Sin embargo este activo puede ser equilibrado por un riesgo de falsos positivos. Por ejemplo, los ensayos basados en la detección de ADN de VPH proporcionan tasas de falsos positivos de 13,5% en los individuos normales y 33% en los pacientes CIN3 [11]. Además, también se informó de discrepancias frecuentes entre genotipos de HPV que se encuentran en cáncer de cuello uterino y en el suero de los mismos pacientes [13]. Estas dificultades deben superarse mediante controles adecuados de especificidad y, para el propósito clínico, el análisis de HPV-c de ADN puede representar una alternativa útil en la identificación o el uso de secuencias de unión de células viral es difícil.
Análisis de secuencial muestras de suero mostraron la dinámica de los resultados: la concentración de ctDNA disminuyeron en tratamiento y el aumento en el momento de recaída. La positividad de ctDNA precedida recaída radiológica en un caso y se asoció con una metástasis de hígado 8 mm en el otro. ADN tumoral podría ser liberado más fácilmente a partir de tejido tumoral que corresponde a la recaída o metástasis que a la lesión primaria. También podría derivar de células tumorales circulantes. Un marcador molecular específica y cuantitativa de ctDNA se puede usar para seguir el curso del cáncer cervical. Durante el tratamiento inicial, ctDNA puede ayudar a evaluar el pronóstico de la enfermedad y la sensibilidad del tumor a la terapia. estudios prospectivos más grandes serán necesarios para validar esta utilidad. Durante el seguimiento, la concentración ctDNA podría ser un marcador sustituto altamente específico de la enfermedad residual mínima y la recaída subclínica. Esto es de gran importancia en la perspectiva de la terapia anti-HPV específico [18] cuya eficacia potencial depende en gran medida de la masa tumoral. Estos enfoques podrían extenderse fácilmente a otros tipos de tumores asociados al VPH, canal anal y carcinoma de cabeza y cuello, por ejemplo. La localización del sitio de integración del VPH no se evalúa actualmente en la práctica clínica. Las nuevas tecnologías como Next Generation Sequencing [19], sin embargo, deben facilitar esta determinación y proporcionar la caracterización molecular de los tumores óptima para personalizar el manejo de los pacientes. Además, la sensibilidad de la detección de ctDNA se puede aumentar fácilmente, simplemente mediante el análisis de una mayor cantidad de suero y /o mediante el aumento de la eficiencia del ensayo de PCR, por ejemplo, utilizando PCR [20] avances .Estas digitales facilitará la evaluación del uso de ctDNA en oncología clínica y biológica que mejorará el seguimiento de los pacientes tratados con cáncer de cuello uterino.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
secuencias de cebadores y reactivos para la detección de CT-ADN.
doi: 10.1371 /journal.pone.0043393.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Sr. F Radvanyi para un debate fructífero y la Sra A. Le Cunff y Z. Maciorowski por su ayuda en la preparación del manuscrito.