Extracto
sialidasa elimina el ácido siálico de sialoglicoconjugados y desempeña un papel crucial en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Varios cánceres humanos expresan un nivel anormalmente alto de la asociada a la membrana isoform.Visualization sialidasa plasma de la actividad de sialidasa en vivir tejidos de mamíferos sería útil no sólo para la comprensión de las funciones de sialidasa, sino también para el diagnóstico del cáncer. Sin embargo, ya que la actividad enzimática de la sialidasa de mamíferos es extraordinariamente débil en comparación con la de sialidasas bacterianas y virales, ha sido difícil para detectar la actividad de sialidasa en tejidos de mamíferos. Hemos sintetizado un derivado de ácido siálico a base de benzothiazolylphenol novela (BTP-Neu5Ac) como sustrato de sialidasa fluorescente. BTP-Neu5Ac puede visualizar las actividades de sialidasa sensible y selectiva en rodajas de cerebro de rata agudos. Las células cancerosas implantadas de forma ortotópica en colones de ratones y los cánceres de colon humano (estadios T3-T4) también se detectaron claramente con BTP-Neu5Ac. Los resultados sugieren que BTP-Neu5Ac es útil para formación de imágenes histoquímico de las actividades de sialidasa
Visto:. Minami A, Otsubo T, Ieno D, Ikeda K, Kanazawa H, Shimizu K, et al. (2014) Visualización de la actividad sialidasa en mamíferos tejidos y la detección del cáncer con una novela fluorescente sialidasa sustrato. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10.1371 /journal.pone.0081941
Editor: Alberto G. Passi, Universidad de Insubria, Italia |
Recibido: 25 Julio, 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: 10 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Minami et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) (KAKENHI;. no 24790080), la Sasakawa Científica Beca de Investigación de la Sociedad de Ciencias de Japón y la subvención de la Fundación Naito de Promoción de Proyectos específicos de investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
sialidasa (EC 3.2.1.18) elimina el ácido siálico de sialoglicoconjugados, tales como glicoproteínas y glicolípidos. sialidasa de mamíferos se sabe que tiene 4 isoformas (Neu1, NEU2, NEU3 y Neu4) y desempeña muchos papeles en las funciones celulares incluyendo la diferenciación, el crecimiento, la apoptosis y la migración y en la supervivencia y proliferación de las células del cáncer [1], [2]. La visualización de la distribución detallada de la actividad sialidasa en tejidos de mamíferos nos puede ayudar a comprender las funciones fisiológicas y patológicas de sialidasa. Además, ya que el nivel de expresión de NEU3, una sialidasa asociada a la membrana de plasma, se incrementa notablemente en diversos cánceres humanos, como de colon, renal, de próstata y cáncer de ovario [1], [2], [3], la detección de actividades de sialidasa de membrana en el tejido de cáncer viable también será útil para el diagnóstico del cáncer y la supervisión en tiempo real de cáncer durante una operación quirúrgica.
X-Neu5Ac (5-bromo-4-cloroindol-3-il-α-DN-acetilneuramínico ácido) es un substrato de sialidasa artificial ampliamente utilizado para la formación de imágenes y citoquímico histoquímica de actividad de la sialidasa. Compuesto X (5-bromo-4-cloro-3-hidroxi-indol) se libera de X-Neu5Ac con sialidasa y se oxida a un azul índigo visible insoluble en agua. Para mejorar la especificidad de la tinción, los sustratos indigogenic se utilizan a menudo con una mezcla equimolar de K
3 [Fe (CN)
6] y K
4 [Fe (CN)
6] como una catalizador de oxidación. Sin embargo, la sensibilidad no es suficiente para observar la distribución detallada de la actividad de sialidasa en los tejidos de mamíferos [4]. La actividad enzimática de la sialidasa de mamífero es notablemente baja en comparación a la de las bacterias y los virus [5], [6]. Para mejorar la sensibilidad de X-Neu5Ac, un sensibilizador como Fast Red Violet LB (FRV LB) como un acoplador para formar un colorante azoico se utiliza con X-Neu5Ac [6], [7], [8]. Sin embargo, ya que se necesita una reacción de dos etapas para la tinción con el FRV LB, la tinción no específica causada por el sensibilizador es inevitable y hace que sea difícil de usar, especialmente en campos clínicos. En el presente estudio, hemos desarrollado nuevos sustratos fluorescentes sialidasa, derivados de ácido siálico a base de benzothiazolylphenol (BTP-Neu5Ac), para la visualización altamente sensible y específico de la actividad sialidasa en los tejidos de mamíferos que viven por una reacción de un solo paso.
en el presente estudio, encontramos que el BTP-Neu5Ac puede visualizar las actividades de sialidasa sensible y selectiva en rodajas de cerebro de rata agudos. BTP-Neu5Ac también puede detectar claramente las células cancerosas implantadas de forma ortotópica en colones de ratón y cánceres de colon humano.
Materiales y Métodos
procedimientos sintéticos
La síntesis de compuestos se describe en detalle en S1 archivo
Materiales
los siguientes productos fueron comprados de los vendedores que se indican:.. sialidasa de
Arthrobacter ureafaciens gratis (AUSA, recombinante expresada en
Escherichia coli
, Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.), X-Neu5Ac (Peptide Institute, Osaka, Japón), halotano (Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japón), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón), penicilina y estreptomicina (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE.UU.), suero bovino fetal (FBS, AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia), ficoeritrina (PE) y conjugado de cabra anti-IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, EE.UU.) y de conejo anti-CD71 (receptor de transferrina) anticuerpo policlonal (Ensayo de Biotecnología, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los reactivos utilizados para la fabricación de soluciones tampón se compraron de Wako Pure Chemical Industries.
animales experimentales
Las ratas y los ratones se adquirieron de Japan SLC (Hamamatsu, Japón). Ellos fueron alojados en condiciones normales de laboratorio (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) y tenían acceso a agua del grifo y la dieta
ad libitum
. Las luces se encienden automáticamente a las 8:00 y apagan a las 20:00. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la guía de la Sociedad Farmacológica japonés para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y los protocolos fueron aprobados previamente por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Shizuoka.
Análisis del espectro
espectros fluorescentes de 5 mM BTP2, BTP3 y BTP4 en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, pH 7,3, 200 l) que contenía NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, 2,5 mM CaCl
2, MgCl 1,3 mM
2 , 1,0 mM NaH
2 PO
4, NaHCO 26,2 mM
3 y 11 mM de D-glucosa se midió con un lector de microplacas, Infinito M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). Los espectros de excitación fueron adquiridas con longitudes de onda de emisión a 518 nm para BTP2, 526 nm para BTP3 y 542 nm para BTP4. espectros de emisión fueron adquiridas con longitudes de onda de excitación a 370 nm para BTP2, 372 nm para BTP3 y 374 nm para BTP4. vistas de fluorescencia de mM BTP2 5, BTP3 y BTP4 en ACSF y BTP2, BTP3 y BTP4 sobre un papel de filtro se obtuvieron imágenes de bajo excitación de luz UV de 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Francia) con una cámara digital, CX1 ( . Ricoh, Tokio, Japón)
análisis cuantitativo de la actividad sialidasa
AUSA (10
0-10
5,7 mU ml
-1: una unidad se definió como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1 mol de ácido siálico por 1 min.) se incubó en 100 l de tampón de 100 mM fosfato de sodio (pH 7,3) que contiene 10 mM BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac o resorufina -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) a 37 ° C durante 60 minutos en una microplaca negro de 96 pocillos (Corning, Corning, NY, EE.UU.). La reacción se terminó mediante la adición de 150 ml de carbonato de sodio (500 mM, pH 10,7) a cada pocillo. La intensidad de fluorescencia se midió con un lector de microplacas (ex /em: 370 nm /518 nm para BTP2, 372 nm /526 nm para BTP3, 374 nm /542 nm para BTP4 y 570 nm /585 nm para resorufina).
Detección de actividad sialidasa en una membrana de PVDF
AUSA (10
-1-10
4 mU) fue borrado en una difluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un dotblotter de 96 pocillos (círculo del tamaño así: 28,3 mm
2, Sanplatec, Osaka, Japón). Cada pocillo se lavó con tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 7,3), y después se añadieron 50 l de 10 mM BTP4-Neu5Ac o X-Neu5Ac en tampón de fosfato de sodio. Después de la incubación a 37 ° C durante 6 horas, soluciones de reacción se eliminaron, y luego se observaron las membranas de PVDF con una cámara digital bajo luz UV (365 nm) para BTP4-Neu5Ac o con un SZX7 microscopio estereoscópico (Olympus, Tokio, Japón) bajo la luz visible para X-Neu5Ac.
Imágenes de la actividad sialidasa en rodajas de cerebro
ratas Wistar (macho, de 7-10 semanas de edad, n = 3) fueron anestesiados con halotano y decapitados. El cerebro de cada rata se recogió rápidamente y se sumergió en ACSF enfriado en hielo para suprimir la excitación neuronal excesiva y daños. ACSF usado en este experimento se burbujeó continuamente con 95% O
2 y 5% de CO
2. cortes coronales del cerebro (400 micras de espesor) se prepararon mediante el uso de un LinearSlicer PRO-7 (Dosaka EM, Kyoto, Japón) en ACSF enfriado en hielo. rodajas de cerebro agudos se mantuvieron en ACSF a temperatura ambiente durante al menos 60 min y después se incubaron con 400 l ACSF que contiene 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) o BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) a 27 ° C durante 1 hr. cámaras de incubación se hace burbujear continuamente con 95% de O
2 y 5% de CO
2 durante la tinción. Los cortes se lavaron tres veces con ACSF y se transfieren a platos a base de vidrio de 3,5 mm IWAKI (Asahi Glass, Tokio, Japón) llenos de ACSF. La fluorescencia se observó usando un microscopio de fluorescencia IX71 (filtro filtro de excitación /emisión: BP330-385 /BA420 o BP330-385 /BA510IF, Olympus). nivel de fondo de fluorescencia para obtener imágenes de la actividad de sialidasa se determinó mediante la incubación de los cortes de cerebro en ACSF sin un sustrato. En todas las observaciones con el microscopio de fluorescencia, ganancia de una cámara DP70 microscopio digital (Olympus) se creó no para detectar la fluorescencia de fondo.
Para el conjunto de imágenes de la zona de corte de cerebro, se tomaron imágenes de forma secuencial y cada pieza era de baldosas usando Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, EE.UU.). Cuando sea necesario, el mismo procesamiento se llevó a cabo en el siguiente experimento.
citotoxicidad
células MDCK fueron expuestos a un medio libre de suero (SFM) que contiene 10 o 100 mM BTP-Neu5Ac o BTP. LDH liberada se midió utilizando un ensayo enzimático acoplado (CytoTox-OneTM, Promega, WI, EE.UU.).
Ratón modelo de tumor de colon
colon murino se cultivaron en DMEM suplementado 26 NL-17 de carcinoma de células con 10% de FBS, 100 unidades de ml
-1 penicilina y 100 mg ml
-1 estreptomicina a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 en una atmósfera húmeda. células de cáncer de colon fueron implantados ortotópicamente siguiendo un protocolo basado en el método descrito por Takahashi
et al.
[9] ratones BALB /cCrSlc (machos, 6 semanas de edad) se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y después se anestesiaron con hidrato de cloral (400 mg kg
-1 peso corporal). Para inducir la colitis, se inyectaron por vía rectal los ratones con 200 l de HCl 0,1 M en un sitio de colon 1,5 cm distante del ano a través del ano. Después de 10 min, se inyectó a los ratones por vía rectal con 200 l de 0,1 M de KOH para la neutralización, seguida de la inyección con 400 l de PBS. Después de 9 horas, los ratones fueron anestesiados de nuevo y se inyectaron por vía rectal con 200 l de Colon26 NL-17 células (8 × 10
6 células) en suspensión con DMEM sin suero de la misma manera. El ano se sujetó inmediatamente con un pequeño Klemme por 2 hr. A la 1 (n = 3) o 2 semanas (n = 3) después de la implantación ortotópico de cáncer de colon, dos puntos fueron cosechadas después de la perfusión intracardiaca con PBS para eliminar la sangre de todo el cuerpo.
muestras de cáncer de colon humano
Dos piezas quirúrgicas se obtuvieron de adenocarcinoma de colon humano (UICC T clasificación T3 y T4) y se tiñeron con BTP4-Neu5Ac dentro de 2 horas después de la cirugía. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General de Shizuoka (Protocolo de 13-03-59) y la Universidad de Shizuoka (Protocolo 25-2) y está en consonancia con la Declaración de los Derechos Humanos, Helsinki, 2002. Todos los pacientes dieron informado por escrito consentimiento.
la detección del cáncer de colon con BTP4-Neu5Ac
Mouse y tejidos de cáncer de colon humano se incubaron en PBS que contenía 100-200 M BTP4-Neu5Ac a 37 ° C durante 60 minutos. Después de lavar con PBS, se observó la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (filtro de excitación /filtro de emisión: BP330-385 /BA420) o sistema de imágenes IVIS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.). nivel de fondo de fluorescencia se determinó mediante el uso de dos puntos normales incubadas en PBS sin BTP4-Neu5Ac.
manchas histopatológicos
Mouse y dos puntos humanos que habían sido utilizados para obtener imágenes de la actividad sialidasa se fijaron con paraformaldehído al 4% . Después de ser embebido con parafina, el tejido se corta en secciones de 4-7 micras de espesor y se tiñeron mediante el uso de anticuerpo anti-CD71 de conejo como anticuerpo primario, cabra conjugado con PE anti-anticuerpo de conejo IgG como anticuerpo secundario y 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón).
reproducibilidad
Todas las coloraciones se repitieron al menos dos veces y se confirmó la reproducibilidad.
resultados y Discusión
diseño de nuevos substrato de sialidasa para formación de imágenes histoquímica
para visualizar la actividad de sialidasa en el tejido, la aglicona del substrato de sialidasa debe ser un tinte de tinción insoluble en agua que se une al tejido . Dado que el fluoróforo de 4-metilumbeliferil-α-D-
N
ácido -acetylneuraminic (4MU-Neu5Ac), un sustrato de sialidasa artificial comúnmente utilizado para la cuantificación de la actividad enzimática, es soluble en agua, 4MU-Neu5Ac no es adecuado para formación de imágenes histoquímica de actividad de la sialidasa. Benzothiazolylphenol (BTP), un fluoróforo insoluble en agua, muestra intensa fluorescencia en un estado sólido [10]. sondas fluorescentes basados en BTP se han utilizado para algunos indicadores biológicos y químicos [11], [12], [13]. Cuando los derivados BTP, BTP2 [14], BTP3 [15] y BTP4 [15], fueron puestos en un fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF, pH 7,3), que se precipitaron en la parte inferior de los tubos de ensayo (Figura 1 A).
A, se muestran vistas de fluorescencia de BTP2, BTP3 y BTP4 en ACSF (superior) y en papeles de filtro bajo 365 nm de luz UV (inferior). B-D, excitación (puntos azules y líneas) y emisión (puntos rojos y líneas) espectros de BTP2 (B), BTP3 (C) y BTP4 (D) se midieron en ACSF (pH 7,3). números rojos y azules representan la longitud de onda (nm) a la intensidad del pico de fluorescencia. Abreviaturas:. RF, intensidad de fluorescencia relativa
BTP2, BTP3 y BTP4 tienen diferentes espectros de emisión y excitación (Figura 1 B-D). Desde colorantes de tinción fluorescentes que tienen diferentes espectros de excitación y emisión tienen una ventaja sobre la selección de filtro establece para tomar imágenes de fluorescencia, que utiliza estos tres derivados BTP como la aglicona del substrato de sialidasa.
La hidrólisis de BTP-Neu5Ac con sialidasa de
Arthrobacter ureafaciens
Hemos sintetizado a base de derivados de ácido siálico BTP (BTP-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac y BTP4-Neu5Ac, de acuerdo con el esquema de síntesis se muestra en la Figura 2 . Estos derivados de ácido siálico fueron solubles en agua y mostraron poca fluorescencia. Cuando BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac y BTP4-Neu5Ac se incubaron en ACSF que contiene 10
0-10
5,7 mU ml
-1 sialidasa de
Arthrobacter ureafaciens gratis (AUSA) a 37 ° C durante 60 min (pH 7.3), las intensidades fluorescentes se incrementa en proporción a la concentración de AUSA y alcanzó una meseta a altas concentraciones (Figura 3 a-C). Los coeficientes de extinción (M
-1 cm
-1) de BTP2, BTP3 y BTP4 en cloroformo fueron 14970, 12440 y 14350, respectivamente. Estos resultados indicaron que BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac y BTP4-Neu5Ac son útiles para el análisis cuantitativo de las actividades de sialidasa
condiciones:. (A) Amberlite IR-120 (H
+), MeOH seco, durante la noche, 92% de rendimiento. (B) AcCl-AcOH, durante la noche, cuant. (C) BTP2~4, NaH, THF-DMF, a temperatura ambiente, durante la noche. (D) NaOMe, MeOH seco, 6 h, temperatura ambiente, luego NaOH ac., MeOH, temperatura ambiente, 2 días.
A-D, intensidad de fluorescencia relativa proporcionalmente aumentó con cantidades crecientes de AUSA en 10 mM BTP2-Neu5Ac (a), BTP3-Neu5Ac (B) y BTP4-Neu5Ac (C) pero no en 10 mM Res-Neu5Ac (D). Cada barra y la línea representan la media ± S.E.M. (N = 3). Las intensidades de fluorescencia de cada barra negro se establecen en 10
5. Res: 10 M resorufina. E, AUSA borró en las membranas de PVDF se tiñó con 10 mM BTP4-Neu5Ac o X-Neu5Ac. Se observaron las membranas de PVDF bajo luz UV para BTP4-Neu5Ac o luz visible para X-Neu5Ac. El color azul causado por la tinción de AUSA con 100 M X-Neu5Ac se muestra a la derecha de la línea de puntos.
resorufina es un fluoróforo insoluble en agua con un tamaño molecular similar a la de BTP- Neu5Ac. sustratos glicosidasa basados en resorufina se han utilizado para la tinción citoquímica y medición de la actividad de la enzima [16]. En el caso de los derivados de ácido siálico con resorufina (Res-Neu5Ac), intensidades fluorescentes no se modificaron significativamente por AUSA (ANOVA de una vía, la figura 3 D). BTP-Neu5Ac sería más adecuado que Res-Neu5Ac para ajustarse al bolsillo de reacción de la sialidasa.
AUSA borró en una membrana de PVDF con diferentes concentraciones se tiñó con 10 mM BTP4-Neu5Ac. Como resultado de la observación bajo luz UV, intensidad de fluorescencia se podrían cambiar en un amplio rango dinámico (Figura 3 E, superior). La sensibilidad de BTP4-Neu5Ac era notablemente superior a la de X-Neu5Ac (Figura 3 E, parte inferior).
Visualización de la actividad de sialidasa en rodajas de cerebro de rata agudos
Para visualizar la actividad de sialidasa en el cerebro de rata, rodajas de cerebro agudas se incubaron con ACSF (pH 7,3) que contiene 1 mM BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac o 1 mM BTP4-Neu5Ac a 27 ° C durante 60 min. cámaras de incubación se burbujeó continuamente con 95% O
2 y 5% de CO
2 durante la tinción para mantener la condición rebanada sano. Después de lavar con ACSF, materia blanca mostraron una intensa fluorescencia en las rodajas se tiñeron con BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac y BTP4-Neu5Ac (Figura 4 A-C). Este resultado fue consistente con los resultados de los estudios anteriores que muestran que la materia blanca del cerebro de los mamíferos muestra actividad sialidasa intensa usando 4MU-Neu5Ac o X-Neu5Ac con FRV LB [8], [17].
A-C , la actividad de sialidasa se obtuvieron imágenes en rebanadas coronales agudos de los cerebros de ratas adultas con BTP2-Neu5Ac (a), BTP3-Neu5Ac (B) y BTP4-Neu5Ac (C) a pH 7,3. Abreviaturas: cc, cuerpo calloso; ec, cápsula externa; fi, fimbria; la cadera, el hipocampo; ic, cápsula interna. D, secciones de cerebro se tiñeron con diversas concentraciones (1-1000 m) de BTP4-Neu5Ac. E, la actividad de sialidasa fue fotografiada con 10 mM BTP4-Neu5Ac o 10 mM BTP4-Neu5Ac contiene DANA 1 mM, un inhibidor de la sialidasa. filtros de emisión que transmiten por encima de 420 y 510 nm se utilizaron en A-D y E, respectivamente. Las barras de escala en cada panel representan 2 mm.
Desde BTP4 se excita de manera más eficiente con el filtro de paso de banda de excitación (330-385 nm) de un microscopio de fluorescencia de BTP2 o BTP3, imágenes con BTP4-Neu5Ac exhibido la más intensa fluorescencia en estas series de BTP-Neu5Ac. También se analizó la sensibilidad y especificidad de BTP4-Neu5Ac hacia sialidasa. En el caso de formación de imágenes actividad de sialidasa con X-Neu5Ac y FRV LB, una alta concentración de X-Neu5Ac, generalmente 1 mM, que se necesita para mejorar la sensibilidad y especificidad hacia la actividad de sialidasa de mamíferos [7], [8]. Por otro lado, BTP4-Neu5Ac puede detectar actividades sialidasa con bajas concentraciones de sustrato incluso menos de 10 micras (Figura 4 D). Cuando el ácido 2,3-deshidro-2-desoxi-N-acetilneuramínico (DANA, 1 mM), un inhibidor de sialidasa, se aplicó durante la tinción con BTP4-Neu5Ac, la fluorescencia se atenuó notablemente en toda el área del cerebro (Figura 4 E). BTP-Neu5Ac se hidroliza específicamente con sialidasa, lo que resulta en un notable incremento en la intensidad fluorescente.
Desde BTP-Neu5Ac, un sustrato hidrófilo, llena en el espacio extracelular se hidrolizó con sialidasa de mamífero de los tejidos vivos en condiciones extracelulares fisiológicos , sialidasa podría escindir BTP-Neu5Ac principalmente en la superficie celular. La sialidasa NEU3 membrana plasmática hidroliza gangliósido eficiente y sustratos de bajo peso molecular tales como 4MU-Neu5Ac ligeramente [18], [19]. Aunque el pH óptimo de NEU3 es 3,8, NEU3 hidroliza gangliósido en incluso pH neutral [19], [20]. El Neu1 lisosomal sialidasa También se informó de que esté presente en las membranas plasmáticas y para hidrolizar 4MU-Neu5Ac eficiente [21], [22], [23]. Además, el NEU2 sialidasa citosólica tiene una forma unida a la membrana y se hidroliza 4MU-Neu5Ac [24]. Por lo tanto, no sólo NEU3 sino también otras isoenzimas sialidasa estarían involucrados en la actividad sialidasa detectada con BTP-Neu5Ac.
ensayo de citotoxicidad de BTP-Neu5Ac y BTP
Para la medición de la citotoxicidad, las células MDCK fueron expuestos a BTP-Neu5Ac o BTP para 6 (datos no mostrados) o 16 (5 Figura) hr. Como resultado de la medición de las cantidades de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de células con membrana dañada, no se detectó ninguna citotoxicidad significativa para BTP-Neu5Ac y BTP (ANOVA de una vía).
células MDCK fueron expuestos a se midió un medio libre de suero (SFM) que contiene 10 ó 100 mM BTP-Neu5Ac (a) o BTP (B) durante 16 horas y LDH liberada. la liberación de LDH se muestra como relación para completar la liberación de LDH (100%) por tratamiento con tampón de lisis.
La detección de células cancerosas en los tejidos del colon de ratones
Recientemente, la tecnología de imagen del cáncer ha progresado notablemente. Por ejemplo, Oku
et al.
Desarrolló una novela liposoma marcado con emisor de positrones para la tomografía de emisión de positrones (PET) a una pequeña imagen no invasiva del cáncer de cerebro en tiempo real [25]. Urano
et al.
Desarrollado un anticuerpo monoclonal cáncer de metas de conjugados con sondas de fluorescencia de pH activable para
vivo
la detección de tumores en [26]. Una sonda de cáncer fluorescente altamente sensible y específica tiene ventajas para la detección de cánceres pequeños porque el tamaño mínimo de un tumor detectado mediante el uso de la endoscopia de fluorescencia (aproximadamente ~ 1 mm) es mucho menor que la de PET, tomografía computarizada (CT) y la resonancia magnética ( RM) (aproximadamente 5-20 mm) [27], [28]. La detección temprana de los cánceres y después de una rápida curación de ellos impide eficazmente no sólo la alteración maligna del cáncer, sino también la metástasis distal y promete fuerte mejora del pronóstico.
Dado que el cáncer de colon se informó que exhiben actividad enzimática intensa de una membrana plasmática sialidasa asociada [29], se trató de detectar el cáncer de colon con BTP4-Neu5Ac en tejidos de colon viviente. Los ratones fueron implantados ortotópicamente con células Colon26 NL-17, que son células cancerosas altamente metastásicas aisladas a partir de un adenocarcinoma de colon de ratón 26. Después de 1 o 2 semanas, tejidos de colon se recogieron y se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 100 mM BTP4- Neu5Ac. Se observó fluorescencia intensa en el colon implantado con Colon26 NL-17 células, pero no en dos puntos inflamatorios o normales (Figura 6 A-C, Figura S1). Mientras que el tejido normal del colon mostró fluorescencia débil, la fluorescencia de cáncer de colon fue mucho más fuerte que la del tejido normal (Figura 6 D-F). Las regiones que muestran una intensa fluorescencia en el colon implantado con Colon26 NL-17 células se confirmaron poseer cáncer por tinción inmunohistoquímica (Figura 6 G). Por lo tanto, los cánceres de colon podrían distinguirse fácilmente de los tejidos normales usando BTP-Neu5Ac.
A, una semana después de la implantación de colon ortotópico de Colon26 NL-17 células, tejidos vivos de los dos puntos se tiñeron con BTP4-Neu5Ac. Punta de flecha indica la región cáncer. B y C, inflamatoria (B) o dos puntos normales (C) también se tiñeron con BTP4-Neu5Ac. Izquierda, central y paneles de la derecha en el panel A-C muestran campo claro, se fusionaron y vistas fluorescentes, respectivamente. D y E, la imagen ampliada de cáncer (D) y normal región (E) teñidas con BTP4-Neu5Ac. F, Fondo nivel de fluorescencia de los paneles D y E se muestra. G, La tinción inmunohistoquímica (fluorescencia roja) utilizando anticuerpo de conejo anti-CD71 y el anticuerpo IgG de cabra anti-conejo conjugado con PE y tinción nuclear con DAPI (fluorescencia azul) se llevaron a cabo para detectar el cáncer de colon en las secciones transversales de los tejidos de colon de ratón que eran utiliza para la imagen actividad de la sialidasa en los paneles a y D. las flechas indican la regiones que muestran una intensa fluorescencia de BTP en el panel a y D. la barra de escala en el panel C representa 2,5 mm y es común en los paneles a y B. la barra de escala en el panel F representa 0,5 mm y es común en los paneles D y E. La barra de escala en el panel G representa 0,2 mm.
sialidasa actividades expresadas en Colon26 NL-17 se comunicaron a ser más débiles entre adenocarcinoma de colon 26 sublíneas como NL- 4, NL-17, NL-22 y NL-44 [30]. Ya que incluso Colon 26 NL-17 adenocarcinoma implantado de forma ortotópica en colones de ratones se detectaron con BTP-Neu5Ac claramente, BTP4-Neu5Ac sería lo suficientemente sensible para la sonda de cáncer.
Detección de cáncer de colon en los tejidos humanos
se ha informado de que el nivel de expresión de mRNA NEU3 en el cáncer de colon humano es 3-100-veces más alta que en el tejido normal [29]. Por lo tanto, también tratamos de detectar el cáncer de colon humano con BTP4-Neu5Ac. Después de la incubación de los tejidos vivos de cáncer de colon humano, categorizados como T3 por la clasificación T de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC), en PBS que contenía 200 mM BTP4-Neu5Ac, se observó una intensa fluorescencia en las regiones del tumor pero no en las regiones normales (Figura 7 A-G). Las regiones que muestran una intensa fluorescencia y no de fluorescencia se confirmaron ser cáncer y tejidos normales, respectivamente, mediante el uso de la tinción con hematoxilina-eosina (Figura 7 H y I). Cáncer categorizado como también se detectó con T4 BTP4-Neu5Ac en los tejidos de colon humano (datos no mostrados). A pesar de que se necesita una evaluación adicional de la toxicidad, sería posible utilizar BTP4-Neu5Ac para la detección del cáncer no sólo en el examen patológico, sino también diagnóstico no invasivo
.
A, un espécimen de cáncer de colon humano (región encerrada con una línea blanca ) se obtuvo a partir de tejido de cáncer de quirúrgica (UICC T clasificación: T3). B-D, El tejido del colon se tiñó con BTP4-Neu5Ac. B, C y D muestra fotográfica, se fusionaron y las imágenes fluorescentes, respectivamente. E-G, imágenes de fluorescencia ampliada de normal (E) y el cáncer de regiones (F y G) fueron adquiridas con un microscopio de fluorescencia. H e I, Una rebanada longitudinal del tejido del colon se preparó en la línea de puntos en las regiones del panel B. No-fluorescencia y la fluorescencia en el panel C se tiñeron con hematoxilina-eosina y se muestran en los paneles H e I, respectivamente. Las barras de escala en el panel B, E y H representan 10 mm (común en los paneles B-D), 500 micras (común en los paneles E-G) y 250 m (común en los paneles H e I), respectivamente.
Conclusiones
Hemos desarrollado nuevos sustratos fluorescentes sialidasa para la tinción histoquímica de la actividad de sialidasa en los tejidos de mamíferos. Desde sialidasa juega un papel crucial en muchas funciones biológicas incluyendo catabolismo lisosomal, el sistema inmunológico y las funciones neuronales [2], [31], BTP-Neu5Ac es una herramienta poderosa para la investigación detallada de las funciones de sialidasa. Dado que las citotoxicidades de BTP-Neu5Ac y BTP fueron indetectables, BTP-Neu5Ac se pueden utilizar para el ensayo biológico de sialidasa en el tejido vivo, por ejemplo, time-lapse. Por último, se detectaron los cánceres de colon con BTP4-Neu5Ac en un tejido vivo, lo que sugiere que BTP-Neu5Ac también sería útil para las sondas de cáncer.
información de apoyo
Figura S1.
Detección de cáncer de colon con BTP4-Neu5Ac en dos semanas después de la implantación de las células cancerosas. Dos semanas después de la implantación de orthotopical Colon26 NL-17 células, dos puntos de ratón fueron teñidas con BTP4-Neu5Ac. dos puntos inflamatorias o normales también se tiñeron con BTP4-Neu5Ac. paneles de la izquierda y de la derecha muestran imágenes fluorescentes y las imágenes de campo claro se fusionaron con imágenes fluorescentes, respectivamente. La barra de escala representa 5,0 mm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s001 gratis (TIF)
Archivo S1.
procedimientos sintéticos y
espectros de 1H de nuevos compuestos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s002 gratis (PDF)