Extracto
gen supresor del tumor de Wilms (WT1) se ha identificado como un oncogén en muchas enfermedades malignas tales como leucemia, cáncer de mama, mesotelioma y cáncer de pulmón. Sin embargo, el papel de WT1 en el cáncer de pulmón no de células pequeñas de la carcinogénesis (CPNM) sigue sin estar clara. En este estudio, se compararon los niveles de ARNm de WT1 en los tejidos de NSCLC con emparejado tejidos adyacentes correspondientes e identificado expresión significativamente mayor en las muestras de NSCLC. la proliferación de células de tres líneas celulares de cáncer correlacionados positivamente con la expresión de WT1; Por otra parte, estas asociaciones se identificaron en ambas líneas celulares y un modelo de xenoinjerto de ratón. Por otra parte, hemos demostrado que la sobre regulación de la ciclina D1 y la proteína retinoblastoma fosforilada (p-PRB) era mecánicamente relacionada con la aceleración de WT1 células a la fase S. En conclusión, nuestros resultados demostraron que WT1 es un oncogén y promueve la proliferación de células NSCLC por hasta la regulación de ciclina D1 y p-pRb expresión
Visto:. Xu C, Wu C, Xia Y, Z Zhong, Liu X , Xu J, et al. (2013) WT1 promueve la proliferación celular en células no pequeñas del cáncer de pulmón líneas celulares a través hasta la regulación de ciclina D1 y p-pRb in vitro e in vivo. PLoS ONE 8 (8): e68837. doi: 10.1371 /journal.pone.0068837
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Diciembre, 2012; Aceptado: 4 Junio 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [81170158] (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo un importante problema de salud pública tanto en hombres y mujeres, es actualmente el tipo de cáncer con mayor mortalidad en el mundo. La incidencia ha aumentado rápidamente debido a la extensa consumo de tabaco [1] - [3], y en China se ha producido un incremento del 26,9% en hombres y 38,4% en las mujeres durante los últimos cinco años [4]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) incluye varios subgrupos histológicos, adenocarcinoma, de células escamosas y carcinoma de células grandes, que comprenden 80 a 85% de la incidencia total, mientras que los casos restantes incluyen el grupo más distinto de cáncer de pulmón de células pequeñas ( SCLC) [2], [5] - [7]. En este estudio, nos centramos en el papel de WT1 en el desarrollo y la carcinogénesis del NSCLC.
El gen del tumor de Wilms (WT1) que se encuentra en 11p13q, codifica una proteína que contiene 52-54 kDa cuatro de zinc dedo factores de transcripción y fue identificado por primera vez como un gen supresor de tumor en nefroblastoma o tumor de Wilms, un cáncer de riñón pediátrico [8], [9]. La sobreexpresión de este gen también se descubrió en varias leucemias y tumores sólidos, como cáncer de mama, cáncer de pulmón y mesotelioma, y se planteó la hipótesis de que este gen desempeña un papel oncogénico [10], [11]. Oji Y et al sugiere que WT1 juega un papel importante en el crecimiento de las células pulmonares normales; la sobreexpresión de WT1 perturben el crecimiento y la diferenciación de las células pulmonares normales y, de acuerdo con sus hallazgos, conducen a cáncer de pulmón [11]. WT1 ha demostrado jugar un papel en la regulación de la proliferación celular y la apoptosis en muchos mecanismos biológicos y patológicos. Recientemente, se ha investigado como un objetivo potencial de la inmunoterapia para varios tipos de cáncer, incluyendo NSCLC y mesotelioma [12].
señal se ha informado de transductores y activadores de transcripción 3 (STAT3) que se sobreexpresa en muchos humana tumores malignos y activada por citoquinas y factores de crecimiento diferentes durante el desarrollo y progresión del cáncer [13], [14]. Se ha demostrado que STAT3 promueve la proliferación de células de cáncer a través de la regulación de genes que codifican inhibidores de la apoptosis, tales como reguladores de Mcl-1 y Bcl-XL y de ciclo de células incluyendo las ciclinas D1 /D2 y c-Myc [13] - [17 ]. Curiosamente Rong et al demostraron evidencia de que WT1enhanced la actividad transcripcional de STAT3 fosforilado (p-STAT3) que conduce a sinérgico sobre regulación de los genes aguas abajo incluyendo ciclina D1 y Bcl-XL, en fibroblastos de ratón, el melanoma y células hepáticas, así como de riñón embrionario humano las células [18]. Sin embargo, WT1 no se ha informado anteriormente en líneas celulares de cáncer de pulmón.
En este estudio, que tuvo como objetivo identificar la expresión de la proteína WT1 en las muestras de NSCLC en comparación con los tejidos adyacentes, investigar la proliferación de WT1 promoción de la función in vitro e in vivo e identificar su relación con la activación transcripcional de p-STAT3.
Materiales y Métodos
Los pacientes
NSCLC y los tejidos adyacentes incluidos en este estudio correspondiente se obtuvieron de 85 consecutivo pacientes que tenían enfermedad de novo y sometido a resección quirúrgica. Ellos fueron incluidos entre diciembre de 2010 y abril de 2011 en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (Nanjing, China). El diagnóstico correcto fue evaluada por un patólogo con experiencia y de la puesta en escena de NSCLC por un oncólogo clínico de acuerdo con la Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC) 7º-TNM de clasificación. El tejido adyacente se encuentra dentro de 3 cm del borde del tejido tumoral.
RT-PCR
RNA se obtuvo a partir de tejidos se congelaron y líneas celulares de NSCLC utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , método EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ARN y cualidades fueron examinados por Beckman Coulter DU800 espectrofotómetro (Beckman, Brea, CA, EE.UU.). cDNA se sintetizaron con un kit de reactivos Primescript ™ RT (Takara, Japón). 12 l de RNA total se mezcla con 8 l Primescript tampón y 20 de agua tratada con DEPC l se incubó a 37 ° C durante 15 min, 85 ° C durante 5 s y se almacenó a 4 ° C hasta su uso.
QRT -PCR
se empleó ABI Prism7500 Secuencia Sistema Detector (ABI, EE.UU.) para determinar el nivel relativo de ARNm en tejidos tumorales y tejidos adyacentes. El análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) para WT1 y β-actina se realizó con SYBR® Premix ExTaq ™ (Takara, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR se realizó con 10 l 2 x tampón Premix, 0,5 l de cada cebador 5 'y 3', y muestras de 1 l o agua destilada hasta un volumen final de 20 l. Cada vial se desnaturalizó a 95 ° C durante 1 min. desnaturalizado a 95 ° C durante 15 s, recocido a 60 ° C durante 15 s y extendida a 72 ° C durante 30 s usando los siguientes cebadores: cebador directo WT1, 5'GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3; cebador inverso WT1, 5'TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 '. β-actina cebador directo, 5'CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 '; ß-actina cebador inverso: 5'ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 '; al final de la fase de extensión, se llevó a cabo la detección de fluorescencia. Para discriminar específica de productos de ADNc no específicos, una curva de fusión se obtuvo al final de cada ejecución.
se emplearon cultivo celular
A549, H1299, H1650 y 293T líneas celulares (ATCC) para la estudio actual. A549, H1299 y H1650 se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), mientras que 293T se cultivaron en medio DMEM rico en glucosa suplementado con suero bovino fetal 10%. Todas las células se mantuvieron en un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO
2.
Lentivirus Producción y Transducción
WT1A (-17aa-KTS isoforma) gen se sintetizó (adquirido de GenScript, Piscataway, NJ) con la digestión restrictiva utilizando Mlu I y se subclonó plásmido pLV-GFP (regalo de D. Beicheng Sol, Universidad de Nanjing Medical University, china), y nombrado pLV-GFP-WT1. Para generar el plásmido que expresa WT1-shRNA, los oligonucleótidos de doble cadena se clonaron en el vector pLL3.7 (regalo de D. Chen Yun, Universidad de Nanjing Medical University, China) y nombrado pLL3.7-WT1-shRNA. Las secuencias de WT1-shRNA utilizados son aac TCAGGGTTACAGCACGGTC TTCAAGAGA GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt c. Las letras mayúsculas representan secuencia específica WT1 y las letras minúsculas representan secuencias de horquilla. lentivirus recombinante se genera a partir de células 293T usando precipitación con fosfato de calcio. A549, H1299, H1650 se transfectaron con lentivirus utilizando polibreno (8 ug /ml). Representante imágenes de tipo salvaje y las células transfectadas se muestran en la Figura S1.
-Western Blot ensayo
Las proteínas se extrajeron a partir de células cultivadas y en los tejidos de los ratones, cuantificó usando un ensayo de proteína (método BCA, Beyotime, china). Las proteínas se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, bloqueados en leche en polvo al 4% a temperatura ambiente durante 1 hora y a inmunotinción con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche utilizando anti-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, EE.UU.), anti-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, señalización Cell Technology, Beverly, MA, EE.UU.), anti-ciclina D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, EE.UU.), anti-p -pRb (1:1000, Señalización Cell Technology, Beverly, MA, EE.UU.), anti-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), anti-Bcl-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, MA , EE.UU.) y anti-GAPDH (1:1000, Kangchen, china). Los resultados se visualizaron por medio de un sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce ECL sustrato Western blot sistema de detección, Thermo, Pittsburgh, PA, EE.UU.) y se expusieron en el Sistema Molecular Imager ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Recuento celular Kit-8 (CCK-8) Ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (6,0 x 10
3 células /pocillo). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de CCK-8 (Beyotime Instituto de Biotecnología, China). La absorbancia de cada pocillo se leyó en un espectrofotómetro (Thermo, Pittsburgh, PA, EE.UU.) a 450 nm (A450). Tres experimentos independientes se realizaron por quintuplicado.
citometría de flujo Análisis
fue tomada análisis de citometría de flujo para detectar el estado de la apoptosis y el ciclo celular. Se recogieron las células, se lavaron dos veces, y se resuspendieron en 100 l de PBS que contenía 3 l de anexina V y 3 l de PI (KeyGen, China) de acuerdo con la recomendación del fabricante. La adquisición y análisis de datos de la apoptosis se realizaron por el centro de citometría de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA).
El análisis del ciclo celular se evaluó por el contenido de ADN detectado utilizando la citometría de flujo instalación (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Después de recogida por tripsinización, las células se suspendieron con 70% de etanol y se mantuvieron a 4 ° C durante 30 min. Filtró a través de la malla, y se analizó el contenido de ADN de los núcleos teñidos. Todos los experimentos se realizaron tres veces para asegurar los resultados facticidad.
tumorigenicidad en ratones desnudos
Para investigar los efectos de WT1 en el crecimiento del tumor in vivo, se estableció el modelo de xenoinjerto de 4-semana- edad ratones Balb /c
nu /nu. Empleamos 90 ratones Balb /c
nu /nu (adquirido de centro de investigación modelo animal de la Universidad de Nanjing en China) en este estudio y los dividimos en 5 grupos al azar (n = 6 por grupo) para cada línea celular (A549 /H1299 /H1650). Todas las células se tripsinizan y se resuspenden con 100 l de PBS (que contiene 50 l de Matrigel), respectivamente, y por vía subcutánea inyectados en la axila de cada ratón desnudo (5 × 10
6 células por ratón). Una semana después de la inyección, los tumores dimensiones se midieron cada 4 días y después de un mes todos los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores (Figura S2). El volumen se calculó utilizando la fórmula siguiente: volumen = longitud x anchura
2 × 0,5
La inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% y se cortan desde el bloque de parafina de 5 micras de espesor.. Después de desparafinado con xileno y la rehidratación con una serie graduada de etanol, los portaobjetos se calentaron en la autoclave durante tres minutos usando tampón de citrato (pH 6,0) y se incubaron con el anticuerpo primario WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, EE.UU.), p-STAT3 (1:400, señalización Cell Technology, Beverly, MA, EE.UU.), ciclina D1 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, EE.UU.) y p-pRb (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. Tampón de bloqueo de suero o dilución de anticuerpo se prepararon como controles negativos. Los anticuerpos primarios utilizados fueron todos el mismo que para el análisis de transferencia Western. Las fotografías fueron tomadas por microcope (Nikon Eclipse 50i) y el software v4.0 NIS-Elements. Los valores promedio de densidad óptica integrada (IOD) se obtuvieron de cinco campos al azar por diapositiva utilizando el software Image-Pro Plus (v5.0). Todos los datos se detectó tres veces por lo menos.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD basada en tres experimentos separados. la prueba t de Student, ANOVA y de dos caras prueba exacta de Fisher se utilizó para evaluar la significación estadística de las diferencias en todos los experimentos pertinentes. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró como significación estadística, y P & lt; 0,001 fue considerado altamente significativo. Todos los análisis estadísticos fueron analizados utilizando el programa SPSS v17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
1. Los niveles de ARNm de WT1 se sobreexpresa en el CPNM muestras
Se investigaron 85 pares de NSCLC y las muestras adyacentes correspondiente mediante inmunohistoquímica y PCR en tiempo real. Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla S1. la expresión de WT1 en los tumores fue significativamente mayor en comparación con los tejidos adyacentes. imágenes representativos se muestran en la Figura 1A. El análisis estadístico de los valores de IOD de 85 portaobjetos teñidos con WT1 se muestra en el histograma de la figura 1B (* p & lt; 0,05). Como se ilustra en la Figura 1C, el nivel de mRNA de WT1 se sobreexpresa significativamente en muestras de NSCLC (** p & lt; 0,001). Además, nuestros resultados indicaron que el nivel de mRNA de WT1 se asoció tanto con tumor frente a normal y con el estadio del tumor, véase la Tabla S1 (** p & lt; 0,001). Tomados en conjunto, estos resultados están en concordancia con los hallazgos previos que indican que el aumento de expresión de WT1 se asocia con NSCLC.
A, tinción inmunohistoquímica de WT1 en el tumor (izquierda) y muestras adyacentes (derecha). B, el valor promedio de la densidad óptica integrada (IOD) se evaluó mediante el análisis de cinco campos por portaobjetos y se registra en el histograma. C, el análisis de PCR en tiempo real del nivel de WT1 mRNA en tumor y los tejidos adyacentes en relación con ß-actina. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt; 0,05,
** P & lt;. 0.001
2. La expresión de WT1 promovió la viabilidad de CPNM líneas celulares in vitro
Para encontrar una WT1-shRNA que podría efectivamente disminuye la expresión de WT1 en líneas celulares de cáncer, tres candidatos WT1-shRNA (Tabla S2) y se sintetizaron probado utilizando análisis Western-blot y PCR en tiempo real. Hemos encontrado que WT1-shRNA3repressed la expresión de WT1 en A549 /H1299 /H1650 con la máxima eficiencia (Figura 2A). Entonces, detectamos la expresión de WT1 en todas las líneas celulares para confirmar la lentivirus por análisis Western-blot y PCR en tiempo real. Se encontró que la expresión de WT1 en el A549 /H1299 /H1650 transducidas con pLL3.7-WT1-shRNA fue mucho menor en comparación de los controles; simultáneamente, la expresión de WT1 en A549 /H1299 /H1650 transducidas con PLV-GFP-WT1 fue mucho más alta en comparación con los controles. También se encontró que los dos vectores (pLL3.7-WT1 y PLV-GFP) no tuvo ningún efecto sobre la expresión de WT1 (Figura 2A y la Figura S3). A continuación, se realizó la CCK-8 de ensayo para poner a prueba la viabilidad; los resultados indicaron que la sobreexpresión de la viabilidad celular WT1 mejorado, mientras que la baja regulación de WT1 exhibido el efecto contrario y la discrepancia era cada vez más evidente con el tiempo (Figura 2B). Por lo tanto, estos resultados indican que el WT1 promovió la viabilidad celular de NSCLC in vitro.
Una expresión de WT1 de tipo salvaje células de NSCLC y células transfectadas con CPNM por lentivirus que contiene pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) y pLV-GFP-WT1 (WT1) por Western-blot. B, La viabilidad de las células de NSCLC se evaluó mediante el ensayo de CCK-8: la sobreexpresión de WT1 promueve la viabilidad celular mientras que la inhibición de la expresión de WT1 reduce el efecto. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt; 0,05,
** P & lt;. 0.001
3. La expresión de WT1 entrada en la fase S del ciclo celular acelerado por hasta la regulación de ciclina D1 y proteína P-pRb
Para investigar el mecanismo por el cual WT1 promueve la proliferación de células NSCLC, se estudiaron los efectos de la expresión de WT1 en el ciclo celular a través de análisis de citometría de flujo. Los resultados mostraron que el porcentaje de la fase S en el grupo sobreexpresión WT1 fue mayor en comparación con el control, mientras que el grupo knockdown WT1 fue menor (amp Figura 3A y; 3B). Este resultado sugiere que WT1 potencialmente promovió la proliferación de células de NSCLC mediante la aceleración de la entrada en fase S del ciclo celular.
A, Análisis del ciclo celular de las células de tipo salvaje con CPNM y transducidas con WT1-shRNA o WT1. Se utilizaron células de tipo salvaje como control. B, se calculó el análisis de la fase G1-S-fase /y grabado en los histogramas. C, el análisis de la apoptosis celular de las células de tipo salvaje con CPNM y los transducidas con WT1-shRNA o WT1. Se utilizaron células de tipo salvaje como control. D, análisis de Western Blot de la expresión de WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 y Y705), ciclina D1, p-PRB, caspase3, Bcl-2L en células de NSCLC indicados. GAPDH se utilizó como control de carga. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt; 0,05,
** P & lt;. 0.001
Con el fin de dilucidar el mecanismo, se detectó la expresión de ciclina D1 y p-pRb porque se requiere esta actividad para el ciclo celular G1 /S de transición por Western-blot. Como se ilustra en la figura 3D, la ciclina D1 y proteína p-pRb se incrementó tanto en las células que sobreexpresan WT1 y redujo en WT1 células hacia abajo-regulada. Sobre la base de WT1, una mayor actividad transcripcional de p-STAT3, y otros hallazgos de Rong et al, se detectó la actividad de STAT3 y p-STAT3 (S727 y Y705) y encontramos que la fosforilación de ambos S727 y Y705 se sobreexpresa en todas las líneas celulares . Sin embargo, hasta la fecha, no existen informes que han investigado si WT1 está asociada con la fosforilación de STAT3. Además, también se detectó la apoptosis y no encontramos ningún efecto de WT1 (Figura 3C & amp; 3D). Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que WT1 acelera la entrada en fase S del ciclo celular hasta la regulación de ciclina D1 y expresión de la proteína p-pRb.
4. La expresión de WT1 promovido el crecimiento del tumor in vivo xenoinjertos
Para determinar si WT1 afectada progresión NSCLC in vivo, hemos establecido un modelo de tumor de xenoinjerto usando ratones Balb /c
nu /nu. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con forma estable PLV-GFP-WT1 y pLL3.7-WT1-shRNA A549 infectado /H1299 /H1650 células en un solo sitio, respectivamente, con el plásmido vacío y de tipo salvaje WT1 como controles. Como se ilustra en la figura 4A, se encontró que no hubo diferencias significativas entre las células de tipo salvaje y las células transducidas con PLV-GFP y GFP-pLL3.7; esto indicaba que la curva de crecimiento del tumor en las células transducidas con PLV-GFP-WT1 marcadamente se aumentó en comparación con el control, mientras que la curva de crecimiento de tumor en las células transducidas con pLL3.7-WT1-shRNA fue significativamente inhibida. Los tejidos tumorales obtenidas de ratones desnudos fueron presentados en la luz brillante (Figura 4B izquierda) y el sistema de imágenes de fluorescencia in vivo (Figura 4B derecha). Se encontraron aumentos significativos en el volumen del tumor cuando las células fueron transducidas con PLV-GFP-WT1 en comparación con las células de tipo salvaje; en contraste, el volumen del tumor de las células transducidas con pLL3.7-WT1-shRNA se redujo significativamente. Además, se detectó la expresión de la proteína WT1 en los tumores obtenidos a partir de ratones desnudos por análisis Western-blot. Encontramos que no hubo ningún cambio en comparación con las células in vitro (Figura 2A derecha y la Figura 4C). Estos resultados sugieren que WT1 promueve el crecimiento de tumor implante subcutáneo in vivo.
A, volumen del tumor de ratones Balb /c
nu /nu ratones desnudos 31 días después de la inyección de células NSCLC. B, Los tejidos tumorales obtenidas de ratones desnudos que se presentan en la luz brillante (izquierda) y el sistema de imágenes de fluorescencia in vivo. C, la expresión de WT1 en los tejidos tumorales de ratones desnudos por análisis de transferencia Western. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt; 0,05,
** P & lt;. 0.001
5. WT1 afectó a la expresión de la ciclina D1 y p-pRb in vivo
En vivo, hemos validado aún más nuestros resultados in vitro en el que WT1 acelera la entrada de la fase S del ciclo celular hasta la regulación de ciclina D1 y p-pRb . Se investigó la expresión de STAT3, p-STAT3 (S727), la ciclina D1 y p-pRb en los tumores obtenidos a partir de ratones desnudos a través de la tinción inmunohistoquímica y análisis Western-blot. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B niveles, la ciclina D1 y p-pRb se incrementaron en WT1 que sobreexpresan los tejidos en comparación con los tejidos WT1 regulados hacia abajo. Mientras tanto, p-STAT3 (S727) se sobreexpresa en ambos tejidos. El análisis estadístico de los valores de IOD de los tejidos tumorales se muestra en el histograma (figura 5A, P & lt; 0,05). En conclusión, estos resultados indican que WT1 promueve el crecimiento del tumor in vivo y también depende de la regulación de la expresión de ciclina D1 y p-pRb.
A, tinción inmunohistoquímica de WT1, p-STAT3 (S727) , ciclina D1 y p-pRB en WT1 sobreexpresado (WT1) los tejidos tumorales y WT1 regulados hacia abajo los tejidos tumorales (WT1-shRNA) in vivo. se obtuvo el valor medio de la densidad óptica integrada (IOD) como se describe anteriormente, demostró que la expresión de la ciclina D1 y p-pRb fue significativamente hasta reguladas. B, análisis por transferencia Western de expresión de WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 y Y705), ciclina D1, p-PRB en tumores indicados. GAPDH se utilizó como control de carga. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt;. 0,05
6. La expresión de WT1 afectó a la expresión de la ciclina D1 y p-PRB en CPNM muestras
Además, evaluó la correlación entre la expresión de WT1 y el nivel de ciclina D1 y pRb p-85 con parafina tejido diapositivas de NSCLC humanos embebidos. Dos casos con diferentes niveles de expresión de WT1 se muestran en la Figura 6: Caso 1 (positivo fuerte) y Caso2 (débil positivo). El nivel de ciclina D1 y p-pRb fue hasta reguladas en comparación con el Caso 1 Caso 2. Como era de esperar, p-STAT3 (S727) estaba fuertemente manchado tanto en Caso 1 y Caso 2. Este resultado apoya la hipótesis de que WT1 podría aumentar la expresión de la ciclina D1 y p-pRb y regular el ciclo celular.
La tinción inmunohistoquímica de WT1, p-STAT3 (S727), la ciclina D1 y p-pRb en WT1 sobreexpresión (Caso 1) tejidos tumorales y baja expresión de WT1 (Caso 2) los tejidos tumorales in vivo. se obtuvo el valor medio de la densidad óptica integrada (IOD) como se describe anteriormente, demostró que la expresión de la ciclina D1 y p-pRb fue significativamente hasta reguladas. Los datos se representan como media ± DE.
* P & lt;. 0,05
Discusión
Durante las últimas décadas, aunque algunos estudios han investigado el papel de WT1 en el CPNM, su función no ha sido completamente aclarada. En este estudio, se encontró que la expresión del gen WT1 y proteínas en muestras de NSCLC fue notablemente hasta reguladas en comparación con los tejidos adyacentes; WT1 promueve la proliferación de células de NSCLC in vitro e in vivo, y la expresión de WT1 afectó el nivel de ciclina D1 y p-pRb que aceleró la proliferación celular en células de NSCLC y muestras clínicas. Con todos los resultados en conjunto, la hipótesis de que WT1 puede desempeñar un papel oncogénico en la promoción de la carcinogénesis y la progresión del NSCLC.
WT1 fue originalmente identificado como un gen supresor de tumores en el tumor de Wilms, y posteriormente se encontró que se sobreexpresa en una variedad de tumores sólidos [19]. Sin embargo, la relación entre la expresión y la carcinogénesis de WT1 en NSCLC sigue siendo controvertido. Oji et al. sugirió que WT1 podría perturbar el crecimiento y la diferenciación de las células pulmonares normales y contribuir a la oncogénesis de cáncer de pulmón [11]. Más recientemente, Hayashi S et al informaron de que la expresión del gen WT1 baja en los tumores de NSCLC era un signo de pronóstico negativo y también se asoció con la metástasis de los ganglios linfáticos [20]. Por otra parte, se demostró que la pérdida de WT1 indujo la senescencia y la disminución de la proliferación de células de cáncer de pulmón aguas abajo de oncogénicos KRAS de señalización [21] .STAT3 es constitutivamente activado en muchos tumores humanos, tales como de próstata, pulmón, cerebro, mama y cáncer de páncreas [13], [15], [22], [23]. Los genes abajo incluyendo ciclina D1, c-myc y Bcl-XL de STAT3, son potencialmente hasta reguladas por STAT3 fosforilado. Ciclina D1 es un regulador del ciclo celular que promueve las células de la fase G1 a la fase S, y fosforila la proteína pRb [24], que es una fosfoproteína nuclear que regula el crecimiento celular en la fase G1. Hipofosforilada pRb en S780 libera E2F de un complejo de inhibidor, que permite a la promoción de la transcripción necesaria para la progresión a finales de la fase G1 y la fase S [24] - [26]. Se ha informado de que la ciclina D1 y ciclina-quinasa dependían-4 (CDK4) pRb fosforilada y que pRb perdido su capacidad para unirse a E2F [27]. Por lo tanto, cuando la ciclina D1 se regula-up por STAT3 puede fosforilar pRb y promover el crecimiento celular mediante la liberación de E2F.
Rong et al ha informado de que la función de WT1 como supresor de tumores o oncogén dependía principalmente de las actividades de STAT3. En consecuencia, cuando se activó STAT3, WT1 funcionó como un supresor de tumor, pero cuando se desactiva-STAT3, WT1 funcionaba como una oncoproteína [18]. También propusieron que WT1 y STAT3 sinérgicamente promueven la proliferación celular hasta los genes que regula tales como la ciclina D1 y Bcl-XL. Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que WT1 podría funcionar como un oncogén en el CPNM.
En este estudio, hemos demostrado que WT1 se sobreexpresa en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos adyacentes. WT1 exhibió un efecto sobre la proliferación de células de NSCLC in vitro e in vivo: la sobreexpresión de WT1 promueve el crecimiento de células mientras que la baja regulación inhibe la proliferación de células de NSCLC. También se detectó la expresión de STAT3 en células de NSCLC muestras y, de acuerdo con Fernandes et al encontró que STAT3 sobreexpresada en tejidos de cáncer de pulmón [23]. Nuestros resultados mostraron que WT1 aceleró la entrada de células en fase S; Por lo tanto, se evaluaron los genes reguladores del ciclo celular tales como ciclina D1 y p-pRb y hemos encontrado que la expresión de la ciclina D1 y p-pRb fue de hecho hasta reguladas como se muestra en la figura 3D. Teniendo en cuenta nuestros resultados y los resultados anteriores de Rong et al, hemos encontrado que WT1 y STAT3 sinérgicamente promueven el crecimiento de células de NSCLC por hasta la regulación de los reguladores del ciclo celular ciclina D1 y p-pRb. Adicionalmente, se encontró que la expresión de WT1 se asoció tanto con metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio tumoral. Este resultado indica que la expresión de WT1 puede ser relevante para la invasión tumoral y la metástasis. Transición epitelial a mesenquimal (EMT) se considera un proceso esencial para la metástasis de carcinoma y la difusión de las células cancerosas del tumor primario y la migración a diferentes sitios del cuerpo [28]. Curiosamente, WT1 podría potencialmente conducir EMT a través de los objetivos relacionados con la EMT como caracol, barra y E-cadherina [29] - [31]. Para ello será necesario realizar más investigaciones para determinar la función de WT1 en la invasión tumoral y la metástasis.
De forma inesperada, no encontramos que WT1 tuvo ningún efecto sobre la apoptosis de las células de NSCLC de acuerdo con citómetro de flujo de ensayo y también por Western -blot ensayo; esto es diferente de los hallazgos de Rong Y et al demostraron que WT1 aumentó la expresión de Bcl-XL [18]. También se informó de que WT1 es necesaria para la inhibición de la apoptosis en el cáncer de mama y cáncer de rabdoide por la disminución de Bcl-2 mRNA y los niveles de proteína [32], [33]; Sin embargo, otros informes indican que WT1 regulada negativamente el promotor de Bcl-2 en la línea celular de próstata [34]. Vicente S et al. informaron que no detectó ninguna diferencia en la respuesta al agotamiento del WT1 en líneas celulares de cáncer [21], lo cual era, de acuerdo con nuestros hallazgos. La razón de estas diferencias sigue siendo desconocido, pero mayor aclaración, de por qué WT1 y STAT3 sinérgicamente promover el nivel de ciclina D1, pero no tienen efecto sobre el nivel de Bcl-2L en NSCLC, se justifica. Los WT1 transcripcional co-factores identificados recientemente, como BASP1 (cerebro proteína soluble en ácido 1) y WTIP (interacción de proteínas WT1) podrían participar en estas diferencias en la regulación de la transcripción WT1 mediado de genes diana tales como Bcl-2L [35] - [37].
en conclusión, en este estudio, encontramos un nivel de expresión de WT1 significativamente mayor en las muestras de NSCLC en comparación con los tejidos adyacentes no cancerosas, que demostró la proliferación de WT1 función de promover in vitro e in vivo y identificamos su función oncogénica en NSCLC a través de la amplificación de la actividad transcripcional de p-STAT3 que hasta regula genes aguas abajo, incluyendo la ciclina D1 y la proteína retinoblastoma hipo-fosforilados (p-pRb). Por lo tanto, WT1 servir potencialmente como una diana terapéutica para el tratamiento del NSCLC.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El cuadro de tipo salvaje células de NSCLC y otros lentivirus transfectadas con la luz brillante (superior) y la luz verde (inferior). de tipo salvaje células de NSCLC que se hace referencia como control; Las células transducidas con pLL3.7 y PLV-GFP se hace referencia como GFP1 y GFP2; Las células transducidas con pLL3.7-WT1-shRNA denominan como WT1-shRNA y transducidas con PLV-GFP-WT1 referido como WT1 en la figura
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Los tumores obtenidos de los ratones desnudos. Los tumores obtenidos de los ratones desnudos, todos se presentan en esta figura. Cabe señalar que sólo se detectó 4 tumores en H1299-WT1-shRNA tumores del grupo y 5 en H1650-WT1-shRNA grupo en el sitio inyectado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s002
( TIF)
Figura S3.
expresión de WT1 ARNm de células de NSCLC. la expresión de WT1 de tipo salvaje células de NSCLC y células transfectadas con CPNM por lentivirus que contiene pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) y pLV-GFP-WT1 (WT1) por PCR en tiempo real. Los datos se representan como media ± DE. * P & lt; 0,05
doi: 10.1371 /journal.pone.0068837.s003 gratis (TIF)
Tabla S1..
Relación de expresión de WT1 y las características clinicopatológicas de NSCLC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s004 gratis (DOC) sobre Table S2.
La secuencia de WT1-shRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s005 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores agradecen a todas las personas que voluntariamente participado en el estudio y D. Beicheng Sol y D. Chen Yun (Universidad de la Universidad de Medicina de Nanjing, Nanjing, china) por sus plásmidos.