Extracto
Aunque los médicos pueden predecir qué pacientes están en riesgo de desarrollar metástasis, las terapias tradicionales a menudo resultan ineficaces y la enfermedad metastásica es la causa principal de muerte de los pacientes de cáncer; Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar terapias anti-metastáticos que se pueden administrar durante largos períodos de tiempo para inhibir específicamente la motilidad de las células cancerosas.
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somnífera
extractos de raíz (ERW) tienen actividad anti-proliferativa y el componente activo, witaferina A, inhibe la proteína pro-metastásico, vimentina. La vimentina es una proteína de filamentos intermedios y forma parte del programa de epitelio de transición mesenquimal (EMT) para promover la metástasis. Aquí, determinamos si WRE estandarizado para witaferina A (sWRE) posee actividad anti-metastásico y si se inhibe la motilidad del cáncer a través de la inhibición de la vimentina y el programa de EMT. Varias formulaciones de sWRE fueron creados para enriquecer para witaferina A y una solución madre de sWRE en EtOH podrían recuperar más de 90% de la witaferina A que se encuentra en el polvo de extracto original. Esta formulación sWRE cáncer de mama inhibido la motilidad celular y la invasión en concentraciones menores de 1μM mientras que la citotoxicidad insignificante a esta dosis. sWRE tratamiento interrumpido morfología vimentina en líneas celulares, lo que confirma su actividad inhibidora vimentina. Para determinar si sWRE EMT inhibido, TGF-β se utilizó para inducir EMT en las células epiteliales mamarias humanas MCF10A. En este caso, sWRE impedido inducción EMT e inhibió 3-D invasión esferoide. se tomaron en un xenotrasplante y de mama de ratón modelo de carcinoma humano de estos estudios. En ambos modelos, sWRE y witaferina A mostraron una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral y la formación de nódulos metastásicos de pulmón con una toxicidad sistémica mínima. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que bajas concentraciones de sWRE inhiben la metástasis del cáncer potencialmente a través de la inhibición de EMT. Por otra parte, estas dosis de sWRE tienen casi ninguna toxicidad en los órganos normales de ratones, lo que sugiere la posibilidad de que el uso clínico de las cápsulas WRE administrados por vía oral
Visto:. Yang Z, García A, S Xu, Powell DR, Vertino PM, Singh S, et al. (2013)
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somnífera
extracto de raíz Inhibe la metástasis del cáncer mamario y epitelial a mesenquimal transición. PLoS ONE 8 (9): e75069. doi: 10.1371 /journal.pone.0075069
Editor: Michael Klymkowsky, Universidad de Colorado, Boulder, Estados Unidos de América
Recibido: March 1, 2013; Aceptado: 9 Agosto de 2013; Publicado: 12 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un R21 del Centro Nacional de Medicina complementaria y Alternativa (1R21AT005231) adjudicado a la AIM, la Charitable Trust Godfrey, y contra el cáncer de golfista. Este trabajo también fue apoyado por una CCSG P30 otorgado al Instituto de Cáncer Winship (3P30CA138292). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de mama es uno de los cánceres más comunes entre las mujeres en los Estados Unidos y la segunda causa principal de muerte por cáncer femenino [1]. Mayor que 90% de las muertes de pacientes de cáncer de mama se atribuyen a la enfermedad metastásica en el que el tumor primario ha invadido sitios distantes. Puesto que estas células metastásicas suelen ser muy agresivos, difíciles de detectar, y quimioresistente [2], una estrategia terapéutica podría ser para prevenir la enfermedad metastásica en lugar de tratar una vez que ocurra.
El proceso metastásico se pueden clasificar en tres etapas- invasión de células tumorales en el tejido circundante, intravasación en los vasos sanguíneos o linfáticos, y la extravasación en un nuevo entorno de acogida [3-5]. En muchos casos, las células metastásicas se someten epitelial a mesenquimal transición (EMT), donde los eventos genéticos y epigenéticos causan una célula epitelial polarizada para convertirse migratoria e invasiva [6]. A nivel molecular, EMT provoca una ganancia de vimentina y fibronectina expresión, y la pérdida de E-cadherina en la membrana celular [7,8]. La evidencia acumulada muestra que la EMT es un mecanismo importante que lleva la progresión del cáncer de mama y metástasis [9-13].
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somnífera gratis (Ashwagandha) plantas son ampliamente utilizados en el este medicina india. El extracto de raíz de W. somnifera (WRE) se compone de 14 compuestos conocidos como withanólidos, con witaferina siendo A la más prominente [14-16]. Witaferina A es una lactona esteroidal que induce la apoptosis e inhibe el crecimiento del tumor por la orientación proteínas de señalización, tales como P53, FOXO3A, Notch-1, Hsp90 y STAT3 [17-22]. Witaferina Un tratamiento conduce a la detención del ciclo celular, el aumento de reactivo estrés oxidativo [23-26], la inhibición de la vía de JAK /STAT [27], la inhibición de la angiogénesis [28], y la forma de celda modificado y el comportamiento [29]. Witaferina A también posee actividad anti-invasiva potente, lo que podría ser debido a su interacción con la vimentina proteína pro-migratoria.
La vimentina es filamentos intermedios de tipo III y clásico marcador de proteína EMT [30]. Aunque las funciones de vimentina en el mantenimiento de la estructura celular, también es un polímero altamente dinámico que ensambla y disimula en una celda móvil. Cuando las células se someten a EMT, la expresión de vimentina se incrementa y esto se piensa para proporcionar células con un más mesenquimal, fenotipo pro-motilidad [31]. El papel exacto de la vimentina durante la EMT y el desarrollo no es clara, ya que un modelo de ratón knockout vimentina no mostró graves defectos de desarrollo [32]. Estudios adicionales sin embargo hicieron pasar a demostrar que estos ratones presentaron una disminución de fibroblastos cicatrización de heridas, y una capacidad reducida para contratar una red de colágeno [33].
Se propone witaferina Una de unirse a la vimentina mediante una modificación covalente de cisteína 328 [34], lo que lleva a los cambios en la morfología de la vimentina y la fosforilación [29]; Sin embargo, otros datos muestran que la mutación de cisteína 328 no afecta a la inhibición inducida vimentina-A witaferina [29]. Cuando se administra por vía intraperitoneal (IP), witaferina Un efectivamente inhibe la metástasis del cáncer de mama y tiene casi ninguna toxicidad observable [35].
que se conoce sobre la actividad antitumoral de la witaferina Un extracto de la raíz de los padres menos, WRE . Efectos similares se observan en el crecimiento del tumor, el ciclo celular y la angiogénesis con el tratamiento WRE [36-40] junto con efectos inmunomoduladores en colon y cáncer de pulmón [41,42]. Sin embargo, los estudios que comparan directamente a WRE witaferina A no se han realizado, y su actividad anti-metastásico no ha sido bien estudiado. Además, WRE posee varias ventajas sobre witaferina A, ya que puede ser administrado por vía oral en una cápsula y los withanólidos activos podría tener sinergia farmacológica; Por lo tanto, quisimos determinar la eficacia anti-metastática de WRE estandarizada (sWRE) al componente activo puro, witaferina A, en el cáncer de mama. Demostramos que sWRE puede inhibir la invasión de células de cáncer de mama humano
in vitro
y metástasis en los dos modelos de ratón de aloinjerto y xenoinjerto de cáncer de mama, similar a la pequeña molécula pura witaferina A. sWRE induce reorganización vimentina y morfológicas cambios celulares en humanos Las células de cáncer de mama y, muy importante, inhibe la inducción de la EMT en las células epiteliales mamarias humanas normales. Nuestros resultados arrojan luz sobre el potencial de sWRE como una medicina alternativa complementaria novedoso utilizado como una terapia preventiva contra la metástasis en pacientes con cáncer de mama de alto riesgo.
Métodos
Reactivos y anticuerpos
WFA fue adquirido de ChromaDex (Irvine, CA) y fue proporcionada por WRE Ciencias del verdor (Noblesville, IN) con el certificado de análisis que indica que está libre de metales pesados, bacterias y hongos. El anticuerpo contra vimentina se adquirió de Sigma (St. Louis, MO), E-cadherina de BD Biosciences (Bedford, MA), fibronectina de Abcam (Cambridge, MA), y GAPDH de Cell Signaling (Beverly, MA).
preparación sWRE
100% de etanol se calentó a 60 ° C y luego se mezcla con WRE a la concentración de 250 mg /ml durante 30 minutos en un vaso de precipitados de vidrio. después se destiló H
2O se añadió lentamente a disminuir la concentración de etanol a 90%, y se continuó agitando durante otros 30 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 4000 rpm en una centrífuga durante 15 minutos a temperatura ambiente y se recogió el sobrenadante. A continuación, el sobrenadante se pasó a un filtro de 0.22μm, se dividió en alícuotas, y se mantiene a -80 ° C para su uso futuro.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
humano MDA-MB-231 (ATCC#HTB -26), MCF-7 (# HTB-22) y T47D (# HTB-133) las líneas celulares de cáncer de mama fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Hs578-T, HCC1806 y MDA-MB-468 líneas celulares de cáncer de mama humano fueron proporcionados por el Dr. O, Regan (Universidad de Emory [45]). MCF10A humano línea de células epiteliales mamarias fue proporcionada por el Dr. Vertino (Universidad de Emory [45]). carcinoma de mama murino 4T1 células fueron proporcionados por el Dr. Dewhirst (Universidad de Duke [35,45]). T47D y HCC1806 se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS. MDA-MB-231, MCF-7, Hs578-T, MDA-MB-468 y 4T1 se cultivaron en DMEM 10% de FBS. las células MCF10A se cultivaron en DMEM /F12 suplementado con 5% FBS, 20 ng /ml EGF, 0.5μg /ml de hidrocortisona, 100 ng /ml de toxina de cólera, y 10μg /ml de insulina. Todas las líneas celulares se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera.
Ensayo de citotoxicidad
El Promega CellTiter 96
® acuosa no radiactivo Ensayo de proliferación celular (MTS) se llevó a cabo para determinar el
in vitro
citotoxicidad de sWRE. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos durante la noche y después se trató con sWRE a la concentración indicada durante 72 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante la determinación de la absorbancia a 490 nm como se describe por el fabricante (Promega, Madison, WI). La viabilidad celular se expresa como: A
grupo exp /A
de control X 100.
in vitro de curación de heridas ensayo
Una migración celular hiriendo ensayo se realizó como se describió anteriormente [43 ]. Las células fueron cultivadas en 6 pozos de la placa a 100% de confluencia. Después de la herida con una punta de pipeta, las células se lavaron con PBS y se añadieron nuevos medios de comunicación con la concentración respectiva de sWRE. Después, las células se les permitió migrar durante 24 horas a 37 ° C. Se tomaron imágenes de las células en el tiempo 0 y 24 horas con un microscopio Olympus IX51 widefield (Center Valley, PA) con un aumento de 5X con una cámara CCD Hamamatsu Orca ER.
Matrigel invasión de ensayo
Cell la invasión fue ensayada mediante la Roche xCELLigence RTCA DP (en tiempo real de la célula Analizador de doble placa) Instrumento (Indianapolis, IN). DMEM con 10% FBS se añadió a la cámara inferior de una CIM-Plate 16. 250μg /ml de Matrigel (BD Biosciences) se polimerizó en los pocillos de la cámara superior durante 1 hora a 37 ° C. Se añadió medio libre de suero a la cámara superior, se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C, y se tomó una medición de fondo. Las células se trataron previamente con diferentes concentraciones de sWRE en medio libre de suero durante la noche. a continuación, se añadieron Estas células a la cámara superior y la placa se incubó en 37 ° C con el lector de placas xCELLigence. Las mediciones de impedancia fueron tomadas en el fondo del pozo y el aumento de impedancia se correlaciona con el número de células migradas en aumento. Los cambios en la impedancia, lo que se refleja por los valores de índice de invasión de células, se monitorizaron durante al menos 24 horas.
Western blotting
niveles de proteína en los lisados de células se midieron usando un ensayo de BCA estándar. Los lisados celulares en tampón de muestra se separaron en un 10% en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de bloquear con 5% TBST que contiene leche libre de grasa, las membranas se incubaron por separado con anticuerpos contra vimentina, E-cadherina, fibronectina, y GAPDH a temperatura ambiente durante 2 horas. a continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugado con anticuerpos secundarios durante 1 hora. Las bandas se detectaron utilizando Amersham ECL Plus reactivos y luego se expusieron a una película.
imagen confocal
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y se trataron con sWRE durante 24 horas. Las células fueron fijadas y procesadas para microscopía de inmunofluorescencia como se describe anteriormente [35]. Las células se tiñeron utilizando un anticuerpo anti-vimentina primario y secundario Alexa 488 cabra conjugado anti-IgG de ratón. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos y utilizando imágenes Zeiss LSM510 META microscopio confocal con un objetivo 40X aceite de Plan-Neofluar (ND 1.3).
-PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado de las células utilizando el RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) y pretratada con DNasa I. ADNc entonces fue sintetizado utilizando cebadores hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa MMLV-. cebadores específicos de la diana se utilizaron para amplificar cDNA por triplicado utilizando una mezcla de reacción que contenía 1μl de la muestra de ADNc diluida apropiadamente, 0.2μmol /l cebadores y 12.5μl de IQ SYBR Supermix Green (Bio-Rad). 18S rRNA se amplificó a partir de las mismas muestras como control interno. La reacción se sometió a un arranque en caliente durante 3 minutos a 95 ° C y 40 ciclos de 95 ° C, 10 s; 55 ° C (de 18 años) o 63 ° C (vimentina), 30 seg. Los cebadores para el análisis de PCR en tiempo real para la vimentina fueron: 5 'AATGGCTCGTCACCTTCGTGAA3' y 'CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCAG3' 5 y para el 18S, 5 'G3 GAGGGAGCCTGAGAAACG' y 5
ensayo de invasión 'GTCGGGAGTGGGTAATTT GC3'
Tres dimensiones esferoide
placas revestidas con agarosa se hicieron mediante la carga de cada pocillo con 0,75% de agarosa en DMEM con 10% de FBS. Después de la gelificación, se añadieron las células MCF10A en los pocillos y se incubaron a 37 ° C. esferoides celulares formados dentro de 3-5 días. 5-10 esferoides se mezclaron con Matrigel en DMEM o DMEM más sWRE. La mezcla se colocó en el medio de una placa de Petri de formación de imágenes 35 mm con un#1.5 cubreobjetos (MatTek Corporation) y luego intercala en la parte superior con una hoja de la cubierta adicional. A continuación, la placa se coloca en una incubadora a 37ºC durante 30 min para permitir la polimerización Matrigel, se añadió entonces 2 ml de DMEM con 10% de FBS. El plato fue transferido a la célula viva PerkinElmer Ultraview ERS disco giratorio microscopio confocal [44] y las imágenes fueron adquiridas mediante objetivo 20X Zeiss (NA 0,75) cada 20 minutos durante 24 horas con una cámara Hamamatsu Orca ER.
En vivo sWRE estudio de toxicidad
ocho semanas de edad ratones hembra Balb /c se adquirieron de Harlan y se alojaron en las instalaciones de Modelos Winship cáncer Animal de acuerdo con el protocolo de IACUC aprobado. Los ratones fueron mantenidos en grupos de cinco por jaula y se alimentaron con la dieta control AIN76A y agua
ad libitum
. Los ratones se asignaron al azar en 3 grupos de 3 ratones por grupo y se trataron por sonda oral con vehículo (9% de etanol) o vehículo que contiene sWRE a 4, y 8 mg /kg de peso corporal, 3 veces a la semana durante 4 semanas. Los ratones de peso corporal se registró cada vez después de una sonda nasogástrica. Después de 4 semanas de tratamiento, los ratones se sacrificaron y se recogieron y se envían para su análisis patológico órganos (corazón, pulmón, hígado, bazo y riñón). Los efectos tóxicos se evaluaron por un patólogo veterinario ciego basado en la presencia de inflamación, necrosis y fibrosis utilizando una escala de normal (1+) a moderada (3+).
mamaria modelo de carcinoma
se realizaron todos los estudios del ratón, de acuerdo con nuestro protocolo Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad Emory Institucional aprobado. viejo ratones hembra de ocho semanas Balb /c fueron divididos al azar en 4 grupos con 10 ratones en cada grupo. 10
se inyectaron 6 4T1 células en PBS por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de cada ratón. Una semana después de la inyección, sWRE se les dio por sonda oral con vehículo o vehículo que contiene sWRE en 1, el peso corporal 4, y 8 mg /kg 3 veces a la semana durante 4 semanas. Witaferina A se inyecta por vía intraperitoneal por disolución en 10% de DMSO, 20% Cremophor-EL y 50% de PBS a 1, 4, y 8 mg /kg 3 veces a la semana durante 4 semanas. El volumen del tumor se registró antes de alimentación forzada mediante pinzas con volumen = (anchura)
2 x longitud /2. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas de tratamiento y nódulos pulmonares metastásicos fueron contados bajo un microscopio de disección. Para H & amp; E de la tinción, el pulmón y tumor primario de vehículo y los ratones tratados con sWRE fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra, se procesan, embebidos en parafina, y se seccionaron en espesor 5μm. secciones representativas del tumor de control del vehículo, sWRE-tratados y los ratones tratados con una witaferina se procesaron para H & amp; E tinción
xenoinjerto de ratón de cáncer de mama modelo
Se realizaron todos los estudios del ratón de acuerdo con. nuestro protocolo Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad Emory Institucional aprobado. Ocho semanas de edad de sexo femenino sin timo de ratón desnudo Foxn1nu se adquirieron de Harlan y alojado en las instalaciones de modelos Winship de cáncer en animales. Los ratones fueron mantenidos en grupos de cinco por jaula y se alimentaron con dieta de control AIN76A y agua ad libitum. Los ratones se dividieron al azar en 7 grupos con 10 ratones en cada grupo y 10
se inyectaron 6 MDA-MB-231 células en PBS por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de cada ratón. Una semana después de la inyección, los ratones se trataron con vehículo (etanol 9%), vehículo que contiene sWRE en 1, 4, y 8 mg /kg por alimentación forzada oral, o por vía intraperitoneal inyectados con witaferina A disuelto en 10% DMSO, 20% Cremophor-EL y 50% de PBS a 1, 4, y 8 mg /kg 3 veces a la semana durante 4 semanas. El volumen del tumor se registró antes de sonda. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas de tratamiento y nódulos pulmonares metastásicos fueron contados bajo un microscopio de disección. Para H & amp; E tinción, el pulmón y tumores de vehículo y los ratones tratados con sWRE fueron fijadas en formalina al 10% tamponada neutra, procesa, se incluyeron en parafina y se seccionaron a 5μm de espesor. secciones representativas del tumor de control y ratones tratados con sWRE se procesaron para H & amp;. E tinción
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando GraphPad Prism para Windows (versión 5). Utilizó un modelo lineal se realizó para comparar la media de los nódulos pulmonares entre los grupos experimentales. Linear modelo de efectos mixtos se utilizó para comparar los volúmenes tumorales medios entre los grupos. Los valores de p. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
WRE Normalización, solubilidad, y la citotoxicidad
WRE polvo se solubilizan en H
2O o etanol al 90% ( EtOH) a diferentes concentraciones para determinar las condiciones óptimas para estandarizar WRE (sWRE) a la molécula pequeña puro witaferina A. la concentración de witaferina a en cada formulación sWRE se midió por HPLC (Figura 1A) y la tasa de recuperación de witaferina a después de solubulization era calculado para cada muestra (Figura 1B). El contenido de witaferina A en comparación con otros withanólidos utilizando HPLC se muestra en la Tabla 1. Cuando sWRE a 250 mg /ml se disolvió en agua, la witaferina una tasa de recuperación fue del 4%. El porcentaje de recuperación mayor de witaferina A en agua era 16%, observada a una concentración de partida de 10 mg /ml sWRE. En contraste, cuando se disolvió en polvo WRE en el 90% EtOH la witaferina una tasa de recuperación varió desde 80 hasta 92%. Estos resultados muestran que volver a la solubilización de sWRE en 90% EtOH es claramente superior a la de H
2O. Para estimar la estabilidad a largo plazo de la solución WRE de valores en EtOH al 90%, el análisis por HPLC se realizó en WRE después de 6 y 12 meses de almacenamiento a -80 ° C. Los resultados muestran que aproximadamente el 90% de la inicial witaferina A se puede detectar después de 6 meses, y alrededor de 80% después de 12 meses (Figura 1C, D).
sWRE polvo se disolvió en diferentes disolventes y la concentración ( a) y la tasa de recuperación (B) de witaferina a en sWRE se midió por HPLC. La estabilidad de witaferina A en sWRE (90% de EtOH solución madre) con el tiempo se muestra en un gráfico de barras con el absoluto (C) y relativo (D) witaferina Una concentración.
Withanólidos
Concentración (mg /ml)
Porcentaje (%)
witaferina A5.8879.03Withanoside V0.3564.7812-Deoxywithastramonolide1.0614.25Withanolide A0.1361.83Withanolne0.01370.18Total Withanolides7.44100.00Table 1. withanólidos en WRE por HPLC.
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para evaluar la citotoxicidad, las líneas celulares de cáncer de mama fueron tratadas con concentraciones crecientes de witaferina WRE a-estandarizada (sWRE) durante 24 y 72 horas (Figura 2A, B). Entre las seis líneas celulares sometidas a prueba, cuatro (MDA-MB-468, HCC 1806, Hs587-T, y MDA-MB-231) son líneas celulares de cáncer de mama triple negativo [45]. Desde witaferina A es un agente de vimentina-focalización [30,34], la expresión de vimentina, junto con otros marcadores de EMT se evaluaron en las líneas celulares. Dos de las cuatro líneas celulares negativas triples, (Hs578-T y MDA-MB-231) fueron vimentina-positivas y todas las demás líneas celulares se vimentina-negativas. Estas líneas de células positivas vimentina también mostraron la inducción de la EMT, ya que muestran la pérdida de E-cadherina y fibronectina fueron positivos (Figura 2C). Curiosamente, se observó una sensibilidad diferente a sWRE en las seis líneas celulares, donde las dos líneas celulares más sensibles, Hs578-T y MDA-MB 231, eran vimentina-positivas con un IC 72 horas
50 de 0.5μM y 0.4μM respectivamente (Figura 2B). Las líneas de células vimentina-negativos tenían IC
50 años que van desde 1.2μM a 4.0μM. Para investigar esto, los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo en el control isogénica y vimentina siRNA agotan MDA-MB 231 células. En este caso, las células vimentina empobrecido muestran una disminución menor en sWRE citotoxicidad en comparación con células de control isogénicas (Figura 2D)
.
(A y B) Los gráficos de líneas que muestran el% de supervivencia de las líneas celulares de cáncer de mama seis tratados con el aumento concentraciones de sWRE para 24 (A) y 72 horas (B). (C) Transferencia Western que muestra los marcadores de EMT en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. líneas celulares de cáncer de mama triple negativo están indicados con un asterisco. (D) (izquierda) Western blot que muestra el agotamiento éxito vimentina siRNA (derecha) usando el ensayo Cytotoxciity sWRE en control isogénica y vimentina siRNA células agotadas.
sWRE inhibe la motilidad celular y la invasión del cáncer de mama, y se altera la vimentina morfología
Hemos demostrado previamente la witaferina A inhibe la motilidad de las células del cáncer de mama y metástasis [35]; Por lo tanto, hemos tratado de determinar si sWRE muestra la eficacia anti-invasivo. El efecto de sWRE sobre la motilidad celular de las células de cáncer de mama triple negativo (humano MDA-MB-231 y 4T1 de ratón) se ensayó usando un ensayo de herida de curación. WRE inhibe la motilidad celular de una manera dependiente de la dosis después de 24 horas de tratamiento a 0.5μM en ambas líneas celulares (Figura 3A, B). Un experimento expandido en dosis más bajas en 231 células MDA-MB muestra la inhibición de la motilidad celular en 0.25 M, así (Figura S1). a continuación, quisimos determinar cómo sWRE motilidad celular impactos cuando vimentina proteína está ausente. Este experimento se intentó por primera vez en células de carcinoma de mama MCF7 468 y MDA MB, ambos de los cuales no tienen la vimentina detectable por Western Blot; sin embargo, en estos casos, las células también eran no móviles por lo que el experimento no se pudo realizar (datos no mostrados). En lugar de ello, se utilizó la línea de células epiteliales de pulmón, BEAS-2B, que carece de vimentina (Figura S1-B) y muestra algunas motilidad. sWRE tenía un IC 24 hr anti-proliferativa
50 de 2.9μM y un 48 hr IC
50 de 1,9 mM (Figura S1-C). En un ensayo de heridas, dosis más bajas de sWRE (0,125 a 1 m) por debajo de la IC
50 tenían casi ningún impacto en la motilidad celular (Figura S1-D). No fue hasta que el tratamiento con 2 M sWRE que está cerca del IC 24 horas antiproliferativo
50, ¿verdad observar la inhibición apreciable de la motilidad (Figura S1-D).
(A y B) de la célula hiriendo ensayo en (a) MDA-MB-231 y (B) células 4T1 tratadas con concentraciones crecientes de sWRE durante 24 horas. (C y D) Gráfico de líneas que muestra la velocidad de la invasión celular a través de Matrigel incrustado en una cámara de Boyden en (C) MDA-MB-231 y (D) células 4T1 tratadas con concentraciones crecientes de sWRE. (E) Imagen confocal de inmunofluorescencia de vimentina (verde), actina (rojo), y DAPI (azul) en las células MDA-MB-231 tratadas con el control EtOH 9%, o 0.5μM 1.0μM sWRE.
La actividad anti-invasivo de sWRE se ensayó usando un ensayo de invasión de Matrigel en tiempo real en una cámara de Boyden. sWRE de nuevo fue capaz de inhibir significativamente la invasión de células en ambas líneas celulares en dosis tan bajas como 0.25μM en 4T1 y 0.5μM en MDA-MB-231 células (Figura 3C, D). Estos resultados muestran que sWRE inhibe la motilidad celular y es anti-invasiva en células de cáncer de mama triple negativo.
Desde witaferina A inhibe la vimentina [30,34], hemos explorado si sWRE tiene capacidad vimentina disruptores similar. inmunofluorescencia vimentina en el control de MDA-MB-231 células muestran que la vimentina está conectado en red por todo el citoplasma en forma de huso; sin embargo, tras el tratamiento sWRE (0.5μM y 1.0μM) durante 16 horas, las células no eran tan alargada y se abolió la red vimentina (Figura 3E). En lugar de ello, vimentina acumula como un haz perinuclear en la mayoría de las células, que es similar al efecto de la pura witaferina A [35]. Además, sWRE no disminuyó los niveles totales de proteína celular hasta 48 horas de tratamiento (Figura S2), lo que sugiere que esto no es debido a un defecto en la síntesis total de proteínas. Por lo tanto, en base a estas observaciones se concluye que sWRE también posee actividad inhibidora de vimentina en dosis bajas.
sWRE impide TGF-inducida EMT
Desde vimentina juega un papel clave en la EMT, queríamos probar si sWRE podría inhibir la motilidad EMT y EMT en cáncer de mama inducido. Para probar esto, hemos utilizado células MCF10A, donde el tratamiento con 4 ng /ml TGF hace que estas células someterse a EMT, según la evaluación de un aumento de la vimentina marcadores mesenychmal y fibronectina, y la pérdida del marcador epitelial, E-cadherina [8,9 ]. Estos datos muestran que sWRE inhibe la motilidad MCF10A en un ensayo de cicatrización de la herida con TGF (Figura 4C) a dosis similares a las utilizadas en 4T1 y las líneas MDA-MB-231cell (Figura 3). Estimó el impacto sWRE EMT, las células MCF10A se trataron con TGF en presencia de sWRE o witaferina A. TGF sola inducida por la proteína vimentina y fibronectina expresión y la disminución de los niveles de proteína E-cadherina que indican el éxito de la inducción de EMT. En contraste, el tratamiento con 500 nM 500 nM o sWRE witaferina A inhibió potentemente EMT inducida por TGF manteniendo vimentina y fibronectina en los niveles pre-inducción y el aumento de los niveles de E-cadherina (Figura 4A, B). Para determinar si esto ocurre en el nivel transcripcional, PCR en tiempo real de la transcripción vimentina se realizó y los resultados mostró que TGF aumentó mRNA vimentina como se esperaba, pero sWRE no afectó los niveles de vimentina de ARNm (Figura 4D), similar a la observada usando witaferina A [30]. Por lo tanto, los resultados muestran que sWRE no inhibe la expresión de vimentina en el ARNm, sino más bien en el nivel de proteínas.
(A) Western blot de vimentina en células estimuladas con MCF10A TGFß1 tratadas con concentraciones crecientes de sWRE. (B) Western blot de vimentina, fibronectina, y E-cadherina en TGFß1 estimula las células MCF10A tratados con 500 nM o sWRE witaferina A. (C) La migración celular en el ensayo de cicatrización de heridas con concentraciones crecientes de WRE. (D) en relación los niveles de mRNA vimentina detectados por PCR en tiempo real en las células MCF10A estimuladas con TGFß1 tratados con 500 nM o sWRE WFA. (E) imágenes de lapso de tiempo de células vivas de MCF10A 3D esferoides incrustados en Matrigel y se estimularon con TGFß1. Las células se trataron con control de EtOH 9%, o 100 nM o 500 nM sWRE.
Estos estudios fueron luego se trasladó en un modelo esferoide de la invasión para determinar si sWRE inhibe inducida por la invasión de EMT. En este modelo, TGF induce una potente invasión de la matriz extracelular Matrigel utilizando imágenes de células vivas para visualizar la invasión (Figura 4E, la película S1); sin embargo, tras el tratamiento con dosis tan bajas como 100 nM sWRE, invasión fue potentemente inhibida (Figura 4E, la película S2). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que sWRE puede inhibir la EMT y EMT inducida por la motilidad y la invasión.
sWRE toxicidad in vivo
Para estudiar la eficacia anti-metastática de sWRE
in vivo
, toxicidad sWRE se evaluó por primera vez en ratón BALB /c hembra normal. Los ratones recibieron o bien 4 o 8 mg /kg sWRE en 9% de EtOH y la ganancia media de peso corporal después de 35 días en los ratones tratados no fueron significativamente diferentes del grupo de control dado 9% de EtOH solo (Figura 5A). Después de cuatro semanas de tratamiento, la histología del corazón, pulmón, hígado, bazo y riñón se calificaron para la fibrosis, necrosis y la inflamación. datos histológicos no muestran ninguna diferencia significativa entre sWRE-grupos tratados y de control del vehículo (Figura 5B, C).
(A) Peso relativo corporal en ratones tratados con vehículo, o sWRE a 4 mg /kg y 8 mg /kg. (B) de clasificación histológica de la inflamación, fibrosis, y la necrosis en los órganos de ratones tratados con vehículo (9% EtOH) o sWRE a 8 mg /kg. (C) Imágenes representativas de H & amp; E manchadas secciones histológicas
sWRE anti-metastásico eficacia
Para determinar la eficacia anti-metastática de sWRE y compararlo con witaferina A en una. modelo de ratón, se utilizó el modelo de metástasis de carcinoma mamario de ratón 4T1. Este modelo se desarrolla lesiones metastásicas en el pulmón, el hígado y el bazo de 4-6 semanas después de la inyección de las células en la almohadilla de grasa mamaria. Los ratones fueron divididos al azar en 4 grupos con 10 ratones en cada grupo, y se le dio sWRE por sonda oral y witaferina A mediante inyección i.p. inyección en 1, 4, y 8 mg /kg 3 veces por semana durante 4 semanas. El intervalo de dosis fue seleccionada en base a la anterior experimento de toxicidad sWRE en el ratón BALB /c (Figura 5). En todas las dosis, el volumen de tumor primario se redujo después de 36 días de tratamiento con sWRE o witaferina A (Figura 6A, B). muestras brutas representativos de tumores primarios muestran que tanto sWRE y witaferina A los tumores tratados eran más pequeños (Figura 6C). Es importante destacar que, el número de nódulos pulmonares metastásicos disminuyó significativamente en ambos 4 y 8 mg /kg en grupos sWRE y witaferina A ratones tratados (Figura 6D, E, y ejemplos en la Figura 6G). H & amp;. E tinción confirmaron la presencia de lesiones micro-metastásico en el pulmón (Figura 6F)
(A y B) La media del volumen del tumor en los ratones tratados con 1, 4, 8 mg /kg de (A) sWRE o (B) witaferina a (WFA) (* p & lt; 0,05 en comparación con el control). (C) Imágenes representativas del tumor primario en sWRE o WFA ratones tratados. (D y E) Gráfico de barras que muestra el número medio de nódulos pulmonares metastásicos en (D) sWRE o ratones tratados con WFA (E) (* P & lt; 0,05 en comparación con el control). (F) un representante de H & amp; E tinción imágenes que muestran la histología de nódulos metastásicos en el pulmón de ratón; dos ejemplos muestran. (G) Imágenes representativas de nódulos metastásicos de pulmón (flechas negras) en los ratones tratados con el control del vehículo (9% EtOH) o sWRE o WFA a 8 mg /kg.
A fin de probar la eficacia anti-metastásico de sWRE, se realizó un experimento similar utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama metastásico humano células MDA-MB-231. Las células se inyectaron por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria de ratones desnudos atímicos hembra. Los ratones fueron administrados por sonda oral sWRE y witaferina A mediante inyección i.p. inyección a una concentración de 1, 4, y 8 mg /kg 3 veces a la semana durante 4 semanas. volumen del tumor primario fue inhibida por sWRE a las 4 y 8 mg /kg dosis.