Extracto
Antecedentes
El aumento de expresión de la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una de las principales características del cáncer gástrico (CG), que es una causa principal de muerte en el mundo, especialmente en Asia y América del Sur. A pesar de que la vía de señalización /β-catenina vía ha estado involucrado en la activación transcripcional del gen COX2, el mecanismo preciso modulación de esta respuesta es aún desconocido.
Metodología /Principales conclusiones
Aquí hemos realizado un estudio la regulación transcripcional del gen COX2 en líneas celulares de GC y se evaluó si este fenómeno es modulada por la señalización /β-catenina Wnt. Examinamos primero la expresión de COX2 mRNA en células de GC y se encontró que hay un patrón de expresión diferencial coherente con los altos niveles de β-catenina nuclear-localizada. El tratamiento farmacológico con litio o ácido valproico y la inducción molecular con Wnt3a mejorado significativamente la expresión de ARNm de la COX-2 purificada canónica de la dosis y tiempo-dependiente. eliminación de serie de un fragmento de 1,6 kbp promotor COX2 y experimentos GAIN- o pérdida de la función nos permitió identificar una región sensible mínima de Wnt /β-catenina que consta de 0,8 kbp del promotor COX2 (pCOX2-0.8), que mostraron respuesta máxima en ensayos de gen reportero-. La actividad de esta región promotora pCOX2-0.8 fue confirmado por ensayos de unión de mutagénesis y ADN-proteína de localización dirigida.
Conclusiones /Importancia
Llegamos a la conclusión de que el promotor mínimo pCOX2-0.8 contiene una nuevo factor funcional de células T /factor de potenciador linfoide (TCF /LEF) elemento -response (TBE sitio II; -689 /-684) que responde directamente a la señalización de Wnt /β-catenina mejorada y que puede ser importante para la aparición /progresión de GC
Visto:. Nuñez M, S Bravo, Cruzat M, M Montecino, de Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenina Mejora de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) la actividad transcripcional en células de cáncer gástrico. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Noviembre, 2010; Aceptado: 11 de marzo de 2011; Publicado: 6 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Núñez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CTI-cáncer, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) el número de concesión PBCT-6 por parte del gobierno chileno (MM y la EVI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es una enfermedad multifactorial, caracterizado por neoplasias malignas altamente en la mucosa gástrica, y representa la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo con la más alta prevalencia en Asia y América del Sur [1], [ ,,,0],2], [3]. factores de riesgo asociados a la contaminación incluyen la dieta, el consumo de tabaco, la obesidad y
Helicobacter pylori
infección [4]. Varias mutaciones en los genes supresores de tumores, incluyendo P53, poliposis adenomatosa coli (APC), E-cadherina y RUNX3 [3], [5], así como en oncogenes como K-ras, HER2 y β-catenina [3], [6], [7], se han documentado en GC. Además, sobre la expresión de varios genes ha sido documentado, incluyendo WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], y la ciclooxigenasa 2 enzima (COX2), que cataliza el paso crucial en la producción de la prostaglandina E2, un mediador clave de la inflamación articular [10], [11].
se ha observado que la expresión del gen COX2 es significativamente mayor en tejidos de adenocarcinoma gástrico humano, cuando se compara con muestras de la mucosa gástrica pareados carente de células de cáncer [10 ]. Tal aumento de la expresión se ha propuesto para afectar a la intensidad de la invasión, el tamaño, metástasis en los ganglios linfáticos, desarrollo tumoral y mal pronóstico [4], [12], [13]. En este sentido, las grandes cantidades de datos describen la actividad quimio-preventivo y contra el cáncer de fármacos no esteroides anti-inflamatorios (NSAID), incluyendo inhibidores de COX2 selectivos como posibles tratamientos para GC [10], [11], [14].
control transcripcional del gen COX2 depende de la maquinaria molecular que interactúan con el promotor de COX2, que parece estar controlada a través de la actividad de diversas vías de señalización [15], [16], [17]. De hecho, se estableció inicialmente que CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) y NF-kB (-233 /-214) secuencias de consenso en el promotor COX2 eran necesarios para la expresión de la gen [16]. estudios funcionales posteriores en el promotor COX2 identificaron una serie de elementos reguladores que participan en la transcripción del gen, incluyendo AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPb [18], [19], [20] y las proteínas perteneciente al factor de células T /factor de potenciador linfoide (TCF /LEF) la familia de factores de transcripción, que son cruciales para la señal de Wnt /β-catenina transducción [21].
la vía de señalización de Wnt /β-catenina es ampliamente reconocido como jugando un papel importante en la enfermedad humana, en particular en la aparición y desarrollo del cáncer [22], [23], [24]. Curiosamente, los últimos experimentos en células GC derivados han mostrado una relación entre la expresión de COX2 y la inhibición de la glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK3) enzima [25], que es un componente clave Wnt que fosforila β-catenina y promueve su degradación posterior a través proteasoma [26]. La relación entre Wnt /β-catenina y la expresión de COX2 en diferentes modelos celulares de cáncer se apoya además en los siguientes estudios. En primer lugar, se ha observado en el epitelio mamario que juegan Wnt /β-catenina un efecto indirecto sobre COX2 transcripción, lo que podría estar mediado por la regulación de un factor PEA3 intermediario [27]. En segundo lugar, y en contraste con un modo indirecto de acción, Araki y cols. [21] informó de que en las células de cáncer de colon no es una inducción de la expresión de COX2 a través de un mecanismo de β-catenina /TCF dependiente, y caracterizado parcialmente un sitio consenso de TCF /LEF unión (TBE: core CTTTG) colocado 1.079 pb cadena arriba del inicio de la transcripción el sitio en el promotor de la COX2. En tercer lugar, se observó que en pacientes con cáncer de colon y líneas celulares derivadas existe una asociación entre la sobreexpresión de las proteínas de la vía Wnt-asociado LEF-1 y Pontin52 /TIP49a y sobre regulación de COX2 expresión [28]. Por último, el uso de condrocitos, se ha demostrado que LEF-1, junto con β-catenina, la expresión de COX2 regulado por la unión directa del complejo LEF-1 /β-catenina a la región 3'UTR del locus genómico COX2 [29] . Por lo tanto, en la actualidad no hay una idea clara acerca de si la señalización de Wnt está implicada en la expresión del gen COX2, o como su papel en la aparición de GC /progresión. Aquí hemos tratado de entender si existe una regulación directa de la expresión del gen COX2 través de la señalización /β-catenina vía e identificar elementos reguladores de Wnt /β-catenina en la región promotora del gen COX2 que puede regular al alza COX2 transcripción en células de GC.
Materiales y Métodos
células y condiciones de cultivo
líneas celulares humanas MKN45 (Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación, Japón), N87, snu1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 y HEK293 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) se utilizaron en este estudio. células MKN45, N87, snu1 y KATOIII se cultivaron en medio RPMI (Gibco); AGS en medio F12K (Hyclone); WI38 en EMEM (Gibco); y HEK293 en DMEM (Gibco). Los medios de cultivo se suplementó con 10% de FBS (Gibco) (AGS con 20%) y 1% de penicilina /estreptomicina. Líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2 y saturado de humedad.
Plásmidos y mutagénesis dirigida al sitio
El SuperTOPFlash-luciferasa y la renilla- PRL-TK plásmidos de luciferasa [30], la β-catenina activa constitutiva (S33Y) [31] y los dominantes negativos plásmidos de expresión ΔTCF4 [32] se han descrito anteriormente. COX2 quimérico fragmentos de promotor de luciferasa se generaron por PCR a partir de ADN genómico humano usando cebadores específicos que contienen sitios de restricción y posteriormente insertarse en el vector pGL3-Basic (Promega). Las mutaciones en el sitio de TBE-II (-689 /-684) del promotor de COX2 se generaron utilizando cebadores pCOX-0,8-TBEMUT con el kit mutagesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). Las construcciones fueron verificadas a través de la secuenciación directa (ABI-3130 analizador genético, Applied Biosystems). secuencias de los cebadores se describen en la Tabla S1.
Semicuantitativo y en tiempo real RT-PCR
ARN total fue extraído en condiciones libres de ARNasa utilizando Trizol (Invitrogen) y 2 g de ARN transcrito fue inversa con 200 U de transcriptasa inversa Superscript II (RT) (Invitrogen) usando 500 ng de cebadores Oligo (dT). Determinación experimental de COX2, c-myc y los niveles de ARNm de CCND1 se realizó de acuerdo con [33]. Brevemente, los ADNc fueron sometidos a PCR en tiempo real en un sistema iQ iCycler (Bio-Rad Laboratories). Cada volumen de reacción de 25 l contenía 1 unidad de Taq ADN polimerasa Platinum (Invitrogen), tampón 1X de reacción (Tris-HCl 20 mM pH 8,4, y KCl 50 mM), MgCl 1,5 mM
2, 2,5 mg de BSA, 0,01% de glicerol , 200 mM de dNTPs, solución de verde SYBR 0,3X y 0,4 M de cebadores específicos (véase el cuadro S1). Las condiciones de PCR se establecieron de la siguiente manera: 90 segundos a 94 ° C y luego 30 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 62 ° C y 30 segundos a 72 ° C. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y los resultados obtenidos para cada gen se normalizaron a los obtenidos en paralelo con β-actina. Se controló la calidad de productos de ARN y PCR largo de los experimentos por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio.
La inducción de la vía de señalización /β-catenina Wnt
señalización Wnt era inducida farmacológicamente en MKN45 células sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos a 80-90% de confluencia (es decir, 1, 2, 4 y 8 h de incubación) ya sea con mM de LiCl (Sigma) o 5-10 mM de ácido valproico 10-20 (VA; Sigma) como se describe anteriormente [34], [35]. A continuación, se recogieron las células para la extracción de mRNA y la determinación real de tiempo-PCR como se describe anteriormente. Del mismo modo, se estimularon células MKN45 durante 2 horas con 200 y 400 ng /ml de proteína de Wnt3a purificado. Purificación de Wnt3a se llevó a cabo como se describe [36].
actividad transcripcional del promotor de COX2
actividad del promotor de COX2 se midió en el 80-90% de confluencia MKN45, AGS, WI38 y HEK293 Las células se siembran en placas de cultivo de 6 así. Brevemente, las células fueron co-transfectadas utilizando Fugene (Roche) para 24 con el pCOX2-luciferasa o los reporteros pSuperTOPFlash y, o bien constitutiva β-catenina activa (S33Y) [31] o el dominante negativo ΔTCF4 [32] constructos. El plásmido de luciferasa de Renilla pRL-TK se utilizó como control interno. actividades de renilla luciferasa de luciérnaga y se determinaron utilizando el ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega) en un instrumento lector de multiplaca Victor-3 (Perkin Elmer), como se describe anteriormente [30]. las actividades relativas de luciferasa se expresaron dividiendo la actividad luciferasa de luciérnaga con la actividad de luciferasa de Renilla para cada muestra (N = 3, cada uno por triplicado).
se realizaron inmunoprecipitación (CHIP) ensayos de la cromatina
estudios de chip en MKN45 células como se ha descrito anteriormente [37]. La fracción de β-catenina nuclear con destino ya sea a TBE en otros países I, II, III o IV en el promotor de la COX-2 humana se inmunoprecipitó con anticuerpos anti β-catenina (Santa Cruz) y evaluada por tiempo real-PCR usando primers específicos (Tabla S1) . Además, la fracción de la ARN polimerasa II (Pol-II) y las histonas acetiladas H3 y H4 (H3ac y H4ac) unido o bien a la región de TBE-II (-793 /-594) o de la región proximal (-118 /+ 62 ) del promotor de la COX-2 se evaluó de manera similar (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac y H4ac, Upstate). Como control positivo se utilizó el sitio de TBE c-myc [38]. La especificidad del anticuerpo se ensayó con IgG de conejo normal-(Santa Cruz).
ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
EMSA se realizó utilizando oligonucleótidos que contenían la secuencia de consenso TBE-II de tipo salvaje COX2 (ver Tabla S1) o previamente reportados secuencias TBE mutantes [39]. En resumen, de tipo salvaje y mutadas oligonucleótidos
32 P-etiquetados se incubaron en tampón con extractos nucleares de células MKN-45 de unión durante 30 minutos a 30 ° C. Posteriormente, los complejos ADN-proteína se separaron a partir de oligonucleótidos libres sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5%. Después de la electroforesis, el gel se secó y se expuso a una película durante 1 día. La visualización de las bandas radiactivas se analizaron por autorradiografía. Especificidad de unión se comprobó mediante la incubación de los complejos ADN-proteína en presencia de un exceso de no marcado de tipo salvaje o mutado oligonucleótidos [21], [39].
El análisis estadístico
Cada experimento se repitió al menos tres veces con tres repeticiones. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar. Múltiples comparaciones de grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía utilizando el software STATISTICA 9.0.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
COX2 expresión se correlaciona con los niveles de β-catenina nuclear en células GC
, se determinaron inicialmente la expresión niveles de COX2 mRNA en GC humano líneas celulares MKN45, N87, snu1, SNU16, KATOIII y AGS [40], [41], [42], así como WI38 de fibroblastos utilizados aquí como una línea celular de control [43], examinando ya sea que se correlacionaron con la señalización /β-catenina vía. Como se muestra en la Figura 1, fuertes niveles de expresión de COX2 se observaron tan pronto como a 26 ciclos de amplificación PCR en líneas de células metastásicas MKN45, SNU16 y KATOIII, y también en la línea celular AGS que se deriva de un tumor primario. Este resultado está de acuerdo con los niveles de expresión de COX2 detectado previamente en MKN45, KATOIII y las células AGS [44], [45], [46]. En contraste, los niveles de ARNm de COX2 o bien eran muy bajos en WI38 de fibroblastos o indetectable en N87 y células snu1 (Figura 1A), lo que sugiere que este patrón de expresión diferencial no está relacionado con las etapas metastásico o el nivel de la transformación celular. Sorprendentemente, los niveles de β-catenina nuclear estaban estrechamente relacionados con la expresión de COX2, ya que se observaron altos niveles de la proteína en las células MKN45, AGS, SNU16 y KATOIII, en comparación con N87, snu1 y WI38 células (Figura 1B), lo que implica un papel para Wnt señalización en la expresión de COX2 mRNA en células de GC.
(a) COX2 expresión mRNA en el control (WI38) y GC líneas celulares (MKN45, AGS, snu1, SNU16, KATOIII y N87). ARN total fue extraído a partir de células cultivadas y RT-PCR semicuantitativa se utilizó para determinar los niveles de ARN y COX2 beta-actina como control interno. Veintiséis ciclos fueron elegidos como un ciclo de PCR adecuado. (B) los niveles de nuclear de la proteína β-catenina en las mismas líneas de células, como se muestra en (A), se examinaron mediante análisis Western Blot utilizando extractos nucleares. El factor de transcripción generales TFIIB se utilizó como control interno.
aumento de la expresión de COX2 vía Wnt /β-catenina señalización
Con el fin de examinar si la cascada de Wnt está implicada en la COX2 de expresión, células MKN45 se estimularon farmacológicamente para diferentes períodos de tiempo (es decir, 1, 2, 4 y 8 h), ya sea con litio (LiCl) o ácido valproico (VA), ya que ambos fármacos han demostrado previamente para modular la señalización de Wnt a través de la inhibición de la actividad GSK3 y por lo tanto aumentar los niveles nucleares de β-catenina [34], [35]. Curiosamente, se observó una mejora marcada de la expresión de COX2 inducido por LiCl mM 10-20 o VA 5-10 mM, que comenzó poco después de la incubación con los compuestos y que alcanzó su punto máximo después de dos horas de tratamiento (Figura 2A). determinación en tiempo real de los niveles de COX2 mRNA en células MKN45 tratados de manera similar con LiCl o VA (2 h) indicó que COX2 fue significativamente hasta reguladas (Figura 2B) y que este efecto fue acompañado con el observado en Wnt /β-catenina genes diana c-myc [47] y la ciclina D1 [48]. A continuación, con el fin de descartar la posibilidad de que el fenómeno observado refleja los efectos no específicos de los fármacos que actúan sobre las proteínas que afectan a diferentes cascadas de señalización, se aplicó directamente una proteína Wnt3a purificado completamente funcional para MKN45 células (ver Métodos). Estos experimentos mostraron claramente que 200 a 400 ng /ml de expresión de ARNm de COX2 mejorado significativamente purificada Wnt3a después de cortos períodos de incubación (Figura 2), explicando parcialmente el rápido efecto de LiCl y VA y el apoyo a una correlación directa entre canónica de Wnt /β-catenina la activación y estimulación de la COX-2 transcripción en células de GC.
(a) COX2 mRNA niveles de expresión en células MKN45 tratados por 1-8 h, ya sea con 10 a 20 mM de litio (LiCl) o 5-10 mm de ácido valproico (VA) fueron evaluados mediante RT-PCR. Como control interno, se determinaron los niveles de beta-actina. (B) Q-PCR para COX2, c-myc y la expresión mRNA CCND1 estimulado farmacológicamente con litio (LiCl) y valproato (VA) durante 2 h (panel superior). Panel inferior, Q-PCR para COX2 en MKN45 células estimuladas con Wnt3a purificado por 2 h. Q-PCR se expresaron como cantidad relativa (DRN) y los niveles de ARNm de beta-actina se utilizó como control interno. Cada figura corresponde a por lo menos 3 experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante la prueba de ANOVA (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
Identificación de nuevos sitios de TBE en el promotor del gen COX2
Los estudios previos indicaron. que un sitio TBE sensible Wnt /β-catenina (núcleo de consenso: CTTTG) se encuentra en -1079 /-1074 pb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción (TSS) del gen humano de la COX2 [21] (sitio IV; Figura 3A, ver también la Figura S1). Más análisis de la secuencia aguas arriba de 1.600 pb de la SAT [49] nos permitió identificar 3 nuevos sitios putativos TBE: -877 /-872 pb (sitio III; orientación de sentido), -689 /-684 pb y -318 /-313 pb (Sitios II y I, respectivamente, tanto en orientación antisentido) (Figura 3A), que no están conservados entre los genes de COX2 murinos (Figura S1) y humanos. Por lo tanto, clonado el segmento de 1600 pb a partir del promotor humano COX2 (pCOX2), incluyendo los cuatro sitios TBE, en el vector pGL3-basic fusionado al gen de la luciferasa que se utilizará posteriormente en ensayos de reportero (Figura 3A). Sorprendentemente, en paralelo transfección de 10 ng de este constructo en MKN-45 y las células HEK293 revelaron que pCOX2 muestra una superior (9 veces) basal actividad significativa promotor en células MKN45 (Figura 3B y C). La hipótesis de que esta mayor actividad promotora basal pCOX2 podría estar relacionado con el contenido elevado de β-catenina nuclear en esta línea celular GC (Figura 1B). Por lo tanto, las células MKN45 y HEK293 se co-transfectaron con pCOX2 en presencia de dosis más bajas de una proteína constitutiva activa β-catenina (S33Y) [31]. Como se observa en la Figura 3, la actividad pCOX2 fue de hecho mejora en ambos tipos de células, lo que sugiere que β-catenina puede unirse y luego activar TVC factores /LEF de transcripción en los sitios de TBE funcionales dentro del promotor pCOX2.
(A) dibujo esquemático que representa el contexto genómico de ca. 1,6 kbp del sitio de inicio de transcripción (TSS) del promotor de la COX-2 humana, incluyendo la ubicación de los reguladores de la transcripción conocidos (cajas blancas) y la posición de los tres elementos de la novela TCF /LEF vinculantes (TBE: núcleo CTTTG; cajas negras) determina
in silico
. (B & amp; C) ensayos de reportero de genes en MKN45 (B) y las células HEK293 (C) co-transfectaron con 10 ng de pCOX2 y concentraciones crecientes de una proteína constitutivamente activa β-catenina (S33Y) (panel izquierdo). Las células se co-transfectaron con 1 ng de PRL-SV40 Renilla como control interno. La actividad del promotor se normalizó como la relación entre la luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla unidades. RLU: unidades relativas de luciferasa. Cada figura corresponde a por lo menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante la prueba de ANOVA (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01). niveles nuclear de la proteína β-catenina se examinaron en mismas líneas celulares a través de análisis de transferencia de Western (panel derecho). El factor de transcripción generales TFIIB se utilizó como control interno.
Contribución de los sitios TBE a la actividad promotora de la COX2 en células GC
Para diseccionar la contribución de Wnt /β-catenina TBE sensible se generaron sitios de la actividad transcripcional de los COX2 promotor cuatro deleciones construcciones pCOX2: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 pb); pCOX-0.8 (-741 /+ 35 pb); pCOX-0.65 (-582 /+ 35 pb); y pCOX-0,4 (-371 /+ 35 pb) (Figura 4A). Estas construcciones se ensayaron posteriormente para determinar su actividad a través de las transfecciones transitorias en células MKN45 y AGS, utilizando los fibroblastos WI38 como una línea celular control. En concordancia con los niveles de expresión endógenos COX2 en estas líneas celulares GC (Figura 1A), deleciones pCOX2 retenidos diferentes niveles de actividad en MKN45 y las células AGS (Figura 4B y C). En contraste, no se detectó actividad promotora en WI38 de fibroblastos (Figura 4D), incluso cuando las dosis de transfección en estas células se aumentaron 8 veces (es decir, de 50 a 400 ng) (Figura S2). Es importante destacar que, y de acuerdo con los informes anteriores [50], las células WI38 expresaron de manera eficiente un constructo de luciferasa-informador que contiene el promotor del gen p21 (Figura S2), lo que indica que en estas células de control de la maquinaria molecular responsable de la inducción de COX2 transcripción no está activo . Otros experimentos revelaron que la transfección en MKN45 y las células AGS con el constructo pCOX2-0.8, que tiene 859 pb eliminado del 1,6 Kb reportero pCOX2 (Figura 4A), dieron como resultado un aumento significativo en la actividad del promotor en comparación con el reportero pCOX2-1.2 (Figura 4A-C). Como no se observaron diferencias significativas entre el 1,6 Kb pCOX2 y construcciones pCOX2-1.2 (Figura S3), no hacer análisis adicionales con la construcción más grande. Es importante destacar que, pCOX2-0.8 representaba el fragmento del promotor mínimo que presenta la máxima actividad basal, ya que además la supresión de cualquiera 159 o 370 pb desde el extremo 5 ', como es el caso con el pCOX2-0.65 o construcciones pCOX2-0.4, respectivamente , disminuyó más de 2 veces los niveles de actividad basal pCOX2. Estos resultados indican que la región comprendida entre 0,8 y 0,65 Kbp aguas arriba del TSS del gen COX2, y que incluye un elemento de respuesta novela TBE (TBE Sitio II; -689 /-684), puede ser un componente clave durante la regulación de el nivel basal de la expresión génica en células de COX2 GC.
(a) representación esquemática de deleciones pCOX2. (B-D) ensayo de gen reportero en MKN45 (B), AGS (C) y líneas celulares WI38 (D) transfectadas transitoriamente con deleciones pCOX 50 ng (pCOX2-1.2; pCOX2-0.8; pCOX2-0.65 y pCOX2-0.4) y 50 ng de vector vacío. En todos los experimentos las células se transfectaron con 1 ng de PRL-SV40 Renilla como control interno. La actividad del promotor se normalizó como la relación entre la luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla unidades. RLU: unidades relativas de luciferasa. Cada figura corresponde a por lo menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante la prueba de ANOVA (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
Regulación al alza de pCOX2-0.8 vía Wnt /β-catenina señalización
A continuación examinó. el efecto de la señalización /β-catenina Wnt en la novela TBE sitio II. Estamos transfectadas MKN45 células con el constructo indicador pCOX2-0.8 y co-expresan la proteína activa constitutiva β-catenina S33Y observando que existía una diferencia significativa (2 veces) aumento de la actividad transcripcional de pCOX2-0.8. Este incremento mediada por β-catenina fue específico ya que el constructo pCOX2-0.4 no fue estimulado en esta β-catenina sobre-expresión de condición (Figura 5A y B). Para el control de Wnt /β-catenina de señalización en células MKN45 se utilizó el /β-catenina SuperTOPFLASH sensible (STF) reportero Wnt que transportaba 12 copias de un TBE en tándem [32], que se transfectó solo o en presencia de la codificación de plásmido para la proteína mutante S33Y β-catenina. Curiosamente, mientras que la co-expresión con la proteína β-catenina S33Y mutante en células MKN45 fue capaz de mejorar (1,9 veces) la actividad del reportero STF, se detectaron altos niveles de actividad STF basal en ausencia del mutante β-catenina (Figura 5C). Este resultado está de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores de altos niveles de endógeno β-catenina nuclear en este tipo celular (véase la Figura 1B), y confirma que este factor nuclear es funcional. Para confirmar aún más este hallazgo, hemos realizado experimentos idénticos en células HEK293 y resultados esencialmente similares obtenidos aunque en este caso se obtuvo una curva de dosis-respuesta clara cuando pCOX2-0.8 se transfectó en presencia de concentraciones crecientes de la constitutivamente activa β-catenina S33Y proteína (Figura S4). Además, se encontró que la actividad STF en células HEK293 fue muy sensible a los niveles de la exógena mutante β-catenina (Figura S4C).
ensayos de reportero de genes en células MKN45 transfectadas transitoriamente con 10 ng pCOX2-0.8 ( A) o pCOX2-0.4 (B), además de 5 a 10 ng de β-catenina S33Y y 10 ng de vector vacío como control. (C) SuperTOPFlash (STF; 10 ng) fue co-transfectadas con 10 ng de β-catenina S33Y como un control positivo para la actividad de señalización Wnt /β-catenina. (D) Efecto de un dominante negativo TCF-4 (ΔTCF) construir sobre la actividad de pCOX2-0.8. células MKN45 fueron transitoriamente co-transfectadas con 50 ng pCOX2-0.8 y 20-50 ng de ΔTCF. (E) Comparación entre la actividad de la pCOX2-0.8 de tipo salvaje y un constructo MpCOX2-0.8 mutante, que contiene residuos mutados en la TBE Sitio II en el promotor pCOX2-0.8 como fondo. Las células fueron transfectadas con concentraciones crecientes de pCOX2-0.8, MpCOX-08, o cantidades iguales de vector vacío como control. En todos los experimentos 1 ng de PRL-SV40 Renilla se transfectó como un control interno. La actividad del promotor se normalizó como la relación entre la luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla unidades. RLU: unidades relativas de luciferasa. Cada figura corresponde a por lo menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante la prueba de ANOVA (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
Para explorar aún más los efectos de la vía /β-catenina vía de la actividad de la pCOX2-0.8. llevamos a cabo experimentos de pérdida de función con un TCF4 dominante negativo (ΔTCF) construir, que codifica para un factor de transcripción que carece de 30 residuos a partir de su extremo amino terminal y que es incapaz de unirse β-catenina [32]. Se encontró que en células MKN45 ΔTCF expresión reduce los altos niveles de transcripción basal pCOX2-0.8 de una manera dependiente de la dosis (Figura 5D). Este resultado confirma el papel clave de TCF /LEF factores de transcripción entre los reguladores de la actividad de la secuencia promotora pCOX2-0.8, y también apoya la idea de que la TBE Sitio II (-689 /-684) está implicado en la respuesta a Wnt /señalización β-catenina.
Finalmente, para abordar directamente la función de la TBE sitio II en Wnt regulación /β-catenina mediada del promotor de COX2, que introdujo por mutagénesis dirigida al sitio un cambio en 2 clave nucleótidos de la secuencia consenso del núcleo TBE sitio II (es decir pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Estos cambios se han demostrado previamente para suprimir la transcripción mediada por β-catenina Wnt /[39]. estudios de transfección transitoria revelaron que la mutación de la TBE Sitio II disminuyó significativamente (2-3 veces) la actividad basal de pCOX2-0.8 constructo en células MKN45 (Figura 5E) en comparación con la de tipo salvaje promotor pCOX2-0.8 constructo. Por otra parte, y de acuerdo con nuestros resultados anteriores, la mutación de este sitio TBE II casi completamente bloqueado β-catenina mediada por la mejora de la construcción pCOX2-0.8 (figura S4). En conjunto, estos resultados indican que el TBE Sitio II (-689 /-684) es un componente funcional en la regulación transcripcional del gen COX2.
β-catenina se une a la región promotora del gen COX2 que contiene el TBE Sitio II
Debido a una conformación transcripcionalmente activo de estructura de la cromatina se refleja en un nivel elevado de acetilación de histonas [51], se precipitó fragmentos de cromatina reticulados (tamaño medio de 300 a 500 pb) aislado de células MKN45 utilizando anticuerpos policlonales específicos para acetilado H3 y H4 histonas. Del mismo modo, se detectó la unión de la ARN polimerasa II (Pol II) como un parámetro que normalmente se asocian con la actividad transcripcional. Examinamos el enriquecimiento en nuestros precipitados de dos secuencias de promotor: la región promotora proximal (PP) (-118 /+ 62 de TSS) y la región distal (-793 /-594) del promotor de COX2 que contiene el sitio de consenso TBE II ( -689 /-684). En particular, la TBE Sitio II fue el blanco ya que los experimentos anteriores indicaron unión preferencial de β-catenina a esta región promotora (Figura S5). Como control positivo, se evaluó la unión en el sitio de TBE en el promotor del gen c-myc (-1447 /-1144 de TSS), que fue descrito previamente en las células de cáncer de colon [38].
acetilado histonas H3 y H4 y la enzima polimerasa II se encontró que se unen dentro de la región promotora proximal (Figura 6A), lo que indica que la estructura de la cromatina en todo el promotor de COX2 en células MKN45 está en una conformación abierta, por lo que de acuerdo con nuestros resultados previos que demuestran que el gen COX2 se transcribe activamente. En particular, la proteína β-catenina se inmunoprecipitó a partir MKN45 muestras en su mayoría en asociación con la región promotora que abarca la secuencia de TBE -684 /-689 en el gen COX2 (Figura 6B). Este factor fue casi indetectable en la región promotora proximal, lo que indica que endógeno β-catenina nuclear es reclutado principalmente a la TBE Sitio II en estas células GC. Como era de esperar, endógeno β-catenina se une de manera similar al sitio promotor TBE c-myc, en niveles que son comparables a los observados en el promotor del gen COX2 (Figura 6C).
(A-C) ensayos de chip en células MKN45 utilizando anticuerpos específicos para β-catenina (β-cat), polimerasa II (Pol), H3 y H4 acetilado histonas (H3ac; H4ac) y la inmunoglobulina G (IgG). La cuantificación se hizo por PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para el promotor proximal región (PP) (A), el TBE Sitio II (-689 /-684) en el promotor de COX2 humano (B) y un sitio de TBE dentro de la c-myc promotor, como un control positivo (C). ensayo (D) EMSA en extractos nucleares de células MKN45. DNA-proteína complejos formados mediante la incubación de extractos nucleares (N.E.) de las células MKN45 con sondas radiomarcadas que contienen el intacta y una mutado TBE Sitio II (carriles 3 y 5) se resolvieron en geles de poliacrilamida nativos al 5% y revelado por medio de autorradiografía. Para determinar la especificidad de la unión de un exceso de 50 veces de tipo salvaje no radiomarcado (línea 4) y mutante (6 y 7) se añadieron oligonucleótidos. Los carriles 1 y 2 corresponden a los de tipo salvaje y mutantes oligonucleótidos radiomarcados sin incubación con N. E. Estas pruebas son representativos de tres experimentos independientes.