Extracto
WNT5A, un miembro de la familia WNT de glicoproteínas secretadas lípidos modificados, es un regulador crítico de una serie de procesos de desarrollo, incluyendo las extremidades la formación, la morfogénesis pulmonar, el alargamiento intestinal y el desarrollo de la glándula mamaria. WNT5A expresión alterada se ha asociado con un número de cánceres. Curiosamente, en ciertos tipos de cáncer, tales como neoplasias hematológicas y carcinoma colorrectal, WNT5A es inactivada y ejerce una función supresora del tumor, mientras que en otros tipos de cáncer, tales como el melanoma y el carcinoma gástrico, WNT5A se sobreexpresa y promueve la progresión tumoral. El mecanismo por el cual logra WNT5A las actividades diferenciadas en el cáncer es poco conocida. Aquí, nos proporcionan la prueba de que el
WNT5A
gen produce dos isoformas de la proteína, WNT5A-larga (WNT5A-L) y Wnt5A-corta (Wnt5A-S). la secuenciación amino-terminal y un anticuerpo específico WNT5A-L demuestran que las isoformas maduros y secretadas son distintos, con WNT5A-L que lleva un adicional de 18 aminoácidos N-terminales. El análisis bioquímico indica que ambas proteínas purificadas son similares con respecto a su actividad de señalización Wnt /β-catenina estabilidad, hidrofobicidad y. No obstante, la modulación de estos dos
Wnt5a
isoformas, ya sea a través de la expresión ectópica o desmontables, demuestra que ejercen actividades distintas en líneas celulares de cáncer: mientras que WNT5A-L inhibe la proliferación de líneas celulares de tumor, WNT5A-S promueve su crecimiento . Finalmente, mostramos que la expresión de estas dos isoformas Wnt5a se altera de mama y carcinomas del cuello uterino, así como en los tumores de neuroblastoma más agresivos. En estos tipos de cáncer, WNT5A-L es con frecuencia el regulado, mientras que Wnt5A-S se encontraron sobreexpresa en una fracción significativa de los tumores. En conjunto, nuestro estudio proporciona evidencia de que las actividades distintas de WNT5A en el cáncer se pueden atribuir a la producción de dos
WNT5A
isoformas.
Visto: Bauer M, J Bénard, Gaasterland T, Willert K, Cappellen D (2013)
WNT5A
codifica dos isoformas con funciones distintas en los cánceres. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10.1371 /journal.pone.0080526
Editor: Cara Gottardi, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de julio de 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: 18 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Bauer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (DC), el Instituto Nacional del cáncer (JB), la Société Française des cánceres de l'Enfant (JB), la Red de cáncer (DC y MB) y el tejido conectivo Europea por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM, RB1-01406, KW). MB fue galardonado con becas del Ministerio de la Enseñanza Superior y de la Investigación y de CIRM (TG2-01154). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El
WNT5A
gen codifica uno de los 19 miembros de la familia ligando Wnt. A través de la unión a FZD (Frizzled) [1], ROR1 /2 (receptor de tirosina quinasa huérfanos receptores) [2,3] o RYK (similar al receptor de la tirosina quinasa) [4] y receptores LRP5 /6 (receptor de lipoproteína de baja densidad relacionados con la PI proteína) co-receptores [5,6], proteínas Wnt modulan la vía de señalización Wnt /β-catenina canónica, así como una serie de vías no canónica β-catenina-independiente [7,8]. vías de Wnt juegan un papel importante durante la embriogénesis y adultos tejidos homeostasis por la regulación del crecimiento celular, la proliferación, la supervivencia, la adhesión y la migración. Las alteraciones en la señalización de Wnt están frecuentemente asociados con la oncogénesis [7-9]. En particular, la expresión aberrante de ciertos WNTs, inactivación de las mutaciones de los supresores de APC y tumorales AXIN y la activación de mutaciones oncogénicas de β-catenina (CTNNB1) han sido demostrado que contribuyen a la transformación celular a través de la desregulación de los genes, como
c-MYC
y
CCND1 gratis (ciclina D1). silenciamiento epigenético de genes que codifican antagonistas de Wnt, como el señuelo solubles receptores SFRP (secretada proteína relacionada con Frizzled) o coronas danesas, también conduce a la desregulación de la vía y se ha observado en varios tipos de cáncer [7]. Un amplio estudio reciente de los cánceres colorrectales se encontró que más del 94% de los cánceres de llevar a mutaciones en uno o más componentes de señalización Wnt [10].
Entre los componentes de la señalización de Wnt implicados en la oncogénesis, WNT5A es particularmente interesante: actúa tanto como una oncoproteína y un supresor de tumores. En melanomas y carcinomas gástricas y pancreáticas,
WNT5A
es recurrente sobreexpresada y ejerce una función pro-oncogénica mediante la promoción de la proliferación y /o la invasión y metástasis [11-16]. Por el contrario,
Wnt5a
ratones heterocigotos están predispuestos a desarrollar el linfoma de células B a través de la pérdida de la función Wnt5a, y
WNT5A
inactivación de genes somáticos por deleciones o hipermetilación es frecuente en la leucemia humana, linfoma y carcinoma colorrectal [17-20]. Además, WNT5A inhibe la proliferación de células de leucemia, linfoma y carcinoma colorrectal, demostrando su función supresora del tumor en estos tipos de cáncer [17,19,20]. Finalmente, nosotros y otros han demostrado que
WNT5A
expresión es el regulado en los carcinomas de mama humanos y desempeña un papel supresor de tumores mediante la inhibición de la proliferación y /o metástasis [21-24]. Las diferencias en el repertorio de receptores de WNT, y por tanto en las vías de señalización activadas por WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], podrían explicar estas actividades opuestas de WNT5A en el cáncer. Aquí, hemos explorado un mecanismo alternativo por el cual WNT5A podría ejercer las actividades diferenciadas, a saber, a través de la expresión y producción de isoformas Wnt5A distintas. Específicamente, se encontró que un amino-terminal truncado exposiciones WNT5A isoforma tumor-la promoción de actividades, mientras que la proteína WNT5A de longitud completa exhibe actividades de tumor supresor.
Resultados
El
WNT5A
gen codifica dos isoformas de la proteína
Para determinar si
WNT5A
codifica varias isoformas de la proteína, se analizaron las secuencias depositada en bases de datos y buscaron posibles alternativas transcripciones. Encontramos el
WNT5A
gen produce al menos 3 posibles
Wnt5A
alternativa transcripciones de inicio de la transcripción sitios. Una transcripción se inicia en el exón 1 [19,20,28] y se prevé para codificar un precursor de la proteína 380 amino-ácido WNT5A, de aquí en adelante referido como WNT5A-L (Long) (Figuras 1A, B; Figuras S1A y S1B). Las otras dos transcripciones inician 718 y 578 nucleótidos aguas arriba del exón 2, en un 1β exón alternativo (Figura 1a; Figuras S1A y S1B). Ambos transcritos 1ß-iniciado exón se prevé para codificar un ácido 365 o 360 amino (dependiendo del uso de codón de inicio en la posición 16 o 21 con relación al codón de inicio de WNT5A-L) de la proteína precursora, referidos como Wnt5a-S (Short), y carecen de los primeros 15 aminoácidos o 20 N-terminal en comparación con el precursor WNT5A-L ([29]; las figuras 1A, B; Figuras S1A y S1B).
A. Estructura de la alternativa transcripciones humana
WNT5A
gen y. cajas numeradas indican los exones, con las regiones 5 'y 3' no traducidas (UTR) en las regiones de codificación de color gris y en negro. nt: nucleótidos, kb: kilobases. Azules y rojos flechas y líneas de puntos indican respectivamente las posiciones de los diferentes sitios de iniciación de la transcripción en el exón 1 y el exón 1β y empalme del exón 1 y transcripciones 1ß-iniciado exón. Estrellas azules y rojas indican los codones de iniciación de la traducción de las isoformas WNT5A-L y S-WNT5A localizados en el exón 1 y el exón 2, respectivamente. Flechas azules y rojas rayo indican la posición de las secuencias diana de
WNT5A-L
y
Wnt5A-S
específica de ARN corto de interferencia (siRNA). B. alineación de secuencias de aminoácidos múltiple de la N-terminal de las proteínas precursoras WNT5A. El M azul denota el más probable codón de inicio de WNT5A-L, mientras que la Sra rojo denotan los más probable es que los codones de inicio de WNT5A-S. Las flechas grises indican las posiciones de los sitios de escisión del péptido señal para ambas isoformas como se predijo por SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Azul y flechas rojas indican la posición de los primeros amino-ácidos de la madura WNT5A-L y proteínas WNT5A-S, observadas respectivamente, y por lo tanto la posición del sitio de escisión del péptido señal observada para cada isoforma. C. Detección de isoformas Wnt5a purificados. Panel izquierdo: Inmuno-blot para WNT5A demuestra que ambas isoformas son de similar peso molecular (
≈43kDa). Panel derecho: Coomassie gel teñido muestra que las preparaciones purificadas Wnt5A son puro con proteínas contaminantes en gran medida indetectables. D. Un anticuerpo anti-ratón Wnt5a detecta ambas isoformas (panel izquierdo), mientras que un anti-conejo WNT5A-L anticuerpo específico (panel derecho) detecta la WNT5A-L, pero no la WNT5A-S isoforma.
E. Triton X-114
separación de fases demuestra que tanto WNT5A isoformas de partición a la fase hidrófoba /orgánico. proteínas Wnt5a se detectaron por análisis de inmuno-blot con un anticuerpo anti-Wnt5a. F. La incubación de las isoformas Wnt5A purificada a 37 ° C durante los tiempos indicados indica que su
en
in vitro
estabilidad es similar. Wnt5A proteínas se detectaron como en E y intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
La estructura general exón-intrón del ser humano
WNT5A
gen está altamente conservada en otros vertebrados, incluidos ratón, pollo y pez cebra (Figura S2A). El
WNT5A
gen se divide en 5 exones conservados. La longitud, la secuencia y los sitios de empalme en los codones a través de los exones 2 - 5 están muy conservadas. La región no traducida del exón 1 se separaron más, pero el sitio de empalme se conserva. Esta disposición exón-intrón también se conserva en el
WNT5B
genes estrechamente relacionados, como anotada en los genomas de mamíferos. Curiosamente, el 1β exón alternativo, que se inserta en el primer intrón, también está presente en estos vertebrados. En ratones, el exón 1β se detecta en las transcripciones Wnt5a alternativos y comparte homología significativa con la secuencia humana. En un alineamiento de pares, el elemento que abarca la región reguladora aguas arriba y el exón 1 β son el 95% conserva entre los humanos y de ratón (Figura S2 B). En las aves (pollo y pinzón cebra), este exón alternativo no se ha anotado, pero la presencia de una secuencia altamente conservada con un donante de corte y empalme en el extremo 3 'indica que este 1β exón está presente. El alineamiento de pares entre el pollo y el pinzón cebra de este elemento muestra la conservación del 96%. Además, dos secuencias cortas dentro de estos elementos son altamente conservados entre los mamíferos (ratón y humano) y aves (pollo y pinzón cebra) (Figura 2B). Fish (pez cebra y espinoso) también contienen un elemento altamente conservadas dentro de esta región. Aunque este elemento no se ha anotado como un exón en cualquier base de datos, la conservación elevada (74%) sugiere la presencia de un exón adicional en el pescado (Figura 2B). En conjunto, el alto grado de conservación de la secuencia genómica observada sugiere que las transcripciones alternativas Wnt5a, similares a los descritos aquí, están presentes en varias especies de vertebrados. Finalmente, la alineación de los aminoácidos amino terminal de humanos, de ratón y Wnt5a pollo espectáculos que se inician M21 codón (posición relativa al codón de inicio de WNT5A-L) se conserva por completo (Figura 1B), lo que sugiere que Wnt5a-S se inicia en esta posición.
Tanto las proteínas Wnt5A bloquean la activación de Wnt3a-β-catenina /actividad transcripcional impulsada por el TCF en células HEK 293 (TOP-luciferasa, A.) y MDA-MB-231 (TOP-GFP reportero, B.). Las células fueron tratadas con Wnt3a purificado y una concentración creciente de WNT5A durante 24 horas (A) o 48 horas (B). C. Tras la transfección, las dos isoformas Wnt5a interfiere con endógeno (MDA-MB-231, panel izquierdo) y WNT1 inducida (HeLa, panel derecho) β-catenina /TCF transcripción impulsada en MDA-MB-231 (panel izquierdo) y células HeLa (panel derecho). Las células fueron transfectadas con vectores de control, Wnt5a-L o de expresión WNT5A-S solo, o junto con un vector de expresión y se ensayaron para WNT1 /reportero de la actividad β-catenina-TCF impulsado TOP-luciferasa. Un vector de expresión que codifica una forma dominante negativa de TCF4 (ΔNTCF4) se utilizó para interferir con la actividad de reportero endógeno en células MDA-MB-231. D. Ambas isoformas Wnt5A promueven la fosforilación DVL. las células L (panel izquierdo) y células C2C12 (panel derecho) fueron tratados con isoformas Wnt5A (10 NM, 2 horas) y lisados de células enteras fueron inmuno-borró con los anticuerpos indicados. Ambas isoformas Wnt5a, así como Wnt3a (10 nM, 2 horas), condujo a un cambio de la movilidad de las proteínas DVL1 y Dvl2, lo que sugiere que las proteínas Dvl son post-traduccionalmente modificados por fosforilación en respuesta tanto canónica (Wnt3a) y no canónica Wnt (WNT5A) de señalización. Sólo Wnt3a induce la acumulación de la proteína β-catenina. Nota: ß-catenina acumulación en respuesta a Wnt3a en las células C2C12 no es detectable en estos lisados de células enteras porque estas células contienen grandes cantidades de membrana /unión adherente asociado β-catenina
Como es el caso. para las proteínas más secretadas, precursores de Wnt se escinden en el extremo amino para eliminar la secuencia señal produciendo de ese modo el polipéptido maduro. Un péptido señal algoritmo de predicción de escisión (
SignalP 4.1 CD - http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) predice que ambos precursores Wnt5A producen proteínas de cualquiera de 343 aminoácidos (empezar con QVVIEA ... ) o 338 aminoácidos (comenzar con ANSWWS ...). Este último sitio de escisión predicho tiene la puntuación más alta de escisión (Y-puntuación de 0,625 para Wnt5A-S [iniciará a M21] y 0,246 para WNT5A-L). Sin embargo, la secuenciación amino-terminal de ratón indicó que Wnt5a escisión de la secuencia señal se produjo a una posición de 24 residuos aguas abajo del sitio predicho [3]. Además, puesto que la 15 diferencia de aminoácidos en la secuencia N-terminal de WNT5A-L y precursores WNT5A-S puede influir en la posición de escisión del péptido señal, se determinó experimentalmente la identidad de los extremos amino de las proteínas maduras.
Para identificar la posición de la escisión del péptido señal y el primer aminoácido de las proteínas maduras, purificamos ambas isoformas Wnt5A. El uso de un sistema de expresión de CHO desarrollado previamente [30], overexpressed independientemente cada isoforma WNT5A y les purificó a partir del medio acondicionado (CM), de acuerdo con protocolos publicados [3,31]. Ambas isoformas Wnt5a se secretan en el CM a niveles iguales (datos no mostrados), y se purificaron hasta casi homogeneidad (~ 95% puro, como se evaluó por tinción con Coomassie, la Figura 1C). secuenciación amino-terminal mostró la proteína WNT5A-L purificado para iniciar un aminoácido aguas abajo del sitio de escisión del péptido señal predicho, generando así una proteína de 337 aminoácidos a partir de la secuencia de NSWWS ... (Figura 1B; Figura S1B y S1C). La proteína WNT5A-S secretada carecía de un ácido adicional amino-terminal 18 amino para generar una proteína de 319 aminoácidos que comienza con la secuencia de IIGAQ ... (Figura 1B; Figura S1B y S1C). Por lo tanto, las dos isoformas generan proteínas con secuencias terminales amino distintos. El WNT5A-S amino terminal coincide con la de ratón Wnt5a, que anteriormente fue identificado por la secuenciación de péptidos amino-terminal [3]. Curiosamente, el algoritmo de división del péptido señal no predijo esta posición como un sitio probable de la secuencia señal de escisión para cualquiera WNT5A-L o WNT5A-S (Y-puntuación de 0,16 para WNT5A-S y 0,113 para WNT5A-L).
para confirmar la composición de amino terminal distinto de ambas isoformas Wnt5a maduros, hemos generado un anticuerpo dirigido al ácido 18 amino WNT5A-L-específico (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). En inmuno-blots, el anticuerpo WNT5A-L-específica sólo reconoció WNT5A-L y no WNT5A-S (Figura 1D). Esto demuestra que el exón 1 y el exón 1β iniciada
Wnt5a
transcripciones producir proteínas Wnt5a distintos que difieren en sus extremos amino. El mecanismo por el que estos dos precursores se procesan diferencialmente para producir proteínas maduras distintas Actualmente no está claro, sin embargo, se especula que las diferencias en los extremos amino influyen en la elección de la maquinaria de procesamiento para escindir las proteínas en posiciones distintas. Se necesitan más estudios para abordar estas cuestiones.
proteínas Wnt son altamente hidrofóbica, una propiedad impartida por la unión covalente de al menos una molécula lipídica a un residuo conservado [31,32]. Esta modificación es importante para el procesamiento y la secreción de [32,33] apropiado. Además, como se revela por la estructura co-cristal de Wnt-Fzd, el resto lipídico es crítico para la unión al receptor [34]. Para determinar si las dos isoformas Wnt5a diferían en sus propiedades hidrófobas, y por lo tanto en sus modificaciones de lípidos, que utilizan la propiedad de separación de fases del detergente Triton X-114. Se observó ninguna diferencia entre las dos isoformas, ya que ambos se repartieron por igual a la fase orgánica (Figura 1E), lo que sugiere que ambas isoformas se modifican de manera similar. Para probar si las dos isoformas difieren en su estabilidad, se incubaron cada proteína a 37 ° C durante 60 horas. detección inmuno-blot indicó que ambas proteínas degradadas en proporciones iguales (Figura 1F). Por lo tanto, las dos isoformas Wnt5a comportan de manera similar con respecto a su
in vitro
la estabilidad y la hidrofobicidad. Es, sin embargo, es posible que cada isoforma tiene propiedades bioquímicas distintas en un
in vivo
ajuste, una posibilidad que no hemos abordado.
Efectos de WNT5A-L y S-Wnt5A isoformas de señalización vías
Varias vías de señalización Wnt se han descrito y propuesto. La vía más comúnmente estudiado y mejor establecida, a menudo referida como la vía Wnt canónica, implica β-catenina como un mediador central. Otras vías no canónicos, que actúan de forma independiente de β-catenina, son poco conocidos. Como mínimo, se cree que estas dos vías para compartir los siguientes componentes: ligandos Wnt, receptores FZD y transductores de señales Dishevelled (DVL). Aunque WNT5A se asocia predominantemente con la señalización de Wnt no canónica, también se ha encontrado para activar canónica de señalización β-catenina en ciertas condiciones [3]. Hemos investigado si las isoformas diferencialmente Wnt5A impactan en la vía de señalización /TCF β-catenina. Con este fin, hemos generado dos líneas celulares, HEK 293 y MDA-MB-231, que lleva un sistema reportero específico WNT /β-catenina. Este reportero sistema consiste en un elemento sensible WNT compuesto por 7 multimerizada sitios de unión TVC (denominado TOP de TCF óptima Promotor [35,36]), que regula la expresión de un gen indicador, ya sea para las células HEK 293 luciferasa (HEK293- TOP-luciferasa, la Figura 2A; Figura S3A) o GFP para las células MDA-MB-231 (MDA-MB-231-TOP-GFP, Figura 2B; Figura S3B). Estas células reportero se potentemente activados por Wnt3a (Figura 2A y B), una proteína WNT comúnmente utilizado para estimular la ruta de señalización canónica. En cambio, ni isoforma WNT5A activado o consistentemente modula la actividad basal de estas reporteros (Figura S3a y S3B), lo que indica que estos sistemas celulares no proporcionan el medio adecuado para conectar de señalización a la vía de β-catenina canónica WNT5A.
ensayos basados en células sensibles y robustas para la señalización de Wnt no canónica son escasos. Sin embargo, la señalización de Wnt no canónica ha demostrado antagonizar la señalización /β-catenina WNT, una actividad que puede ser ensayada mediante el sistema TOP-reporter [3]. Se encontró que ambas isoformas Wnt5a inhiben la activación reportero Wnt3a inducida de una manera dependiente de la dosis (Figura 2 A y B). Estos resultados muestran que, a pesar de la diferencia en sus extremos amino-terminales, ambas proteínas Wnt5A potentemente antagonizan la señalización /β-catenina vía. efectos inhibidores similares de WNT5A-L y Wnt5a-S isoformas en el reportero impulsado por la β-catenina WNT /se observó cuando las células fueron transfectadas con vectores de expresión (Figura 2C) en lugar de tratar con purificada WNT5A-L y proteínas WNT5A-S. Por lo tanto, en estos ensayos, las isoformas Wnt5a muestran actividades biológicas similares cuando se entrega como proteínas purificadas o genes transfectados.
señalización de Wnt, canónica y no canónica, conduce a la hiperfosforilación de proteínas Dvl, moléculas que actúan inmediatamente aguas abajo de los receptores de FZD señalización. Esta modificación post-traduccional de las proteínas Dvl puede ser detectado fácilmente por un cambio de movilidad electroforética [37-39]. Se encontró que el tratamiento de las dos líneas celulares (células L de ratón y la línea celular C2C12 mioblastos de ratón), ya sea con isoforma WNT5A, así como Wnt3a, induce un cambio de la movilidad de las proteínas Dvl, como se detecta por inmunotransferencia para DVL1 y Dvl2 (Figura 2D). Sin embargo, de acuerdo con las distintas actividades de Wnt3a e isoformas Wnt5a en la señalización de Wnt /β-catenina (figuras 2a, 2b; Figura S3A, S3B), solamente Wnt3a, pero no las isoformas Wnt5a, la acumulación inducida de la proteína β-catenina, como se evidencia en las células L. Esta acumulación de la proteína β-catenina no es evidente en células C2C12, que ya expresan altos niveles de β-catenina (Figura 2D). En conjunto, nuestros datos indican que las dos isoformas Wnt5a exhiben actividades biológicas idénticas en el establecido ensayos de señalización de Wnt basado en células.
Expresión de las isoformas Wnt5A en líneas celulares de cáncer y tejidos normales
Los estudios previos de expresión WNT5A no han discriminado entre las dos isoformas descritas aquí. Por lo tanto, medimos sus niveles de transcripción en líneas celulares de cáncer y en los tejidos normales mediante la realización de RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) con cebadores específicos isoforma (ver Tabla S1 y Figura S1). Este análisis mostró que la expresión de estas isoformas es muy variable entre las líneas celulares de cáncer individuales. Por ejemplo, mientras que MDA-MB-231 (derivado de un carcinoma de mama) y SH-SY5Y (derivada de un neuroblastoma) expresan predominantemente
WNT5A-L
, las células HeLa (derivadas de un carcinoma de cuello uterino) expresan predominantemente
WNT5A-S gratis (Figura 3A). Otras líneas de células, incluidas las células MCF-7 (derivado de un carcinoma de mama) o IMR-32 (derivada de un neuroblastoma) expresan niveles extremadamente bajos de cualquiera WNT5A isoforma (Figura S4A). Aunque menos cuantitativa, análisis de gel de punto final RT-PCR productos obtenidos a partir de líneas celulares representativas confirmó los datos de QRT-PCR (Figura S4A). A continuación analizaron los niveles de transcripción de las isoformas Wnt5A en tejidos adultos normales. Detectamos
WNT5A-L
expresión en casi todos los tejidos, excepto el tejido adiposo. Por el contrario, hemos detectado
Wnt5A-S
expresión sólo en la placenta, y, en menor medida, en la tráquea e intestino delgado (Figura S4B).
A. isoforma expresión WNT5A en tres líneas celulares de cáncer. los niveles de transcripción de
Wnt5A
isoformas se determinaron en MDA-MB-231 (carcinoma de mama), HeLa (carcinoma de cuello uterino), y SH-SY5Y (neuroblastoma) por QRT-PCR y normalizado por
EF1-α
ARNm (normalización por
GAPDH
ARNm y
18S rRNA
produjo resultados similares). Cociente de las medias (
Wnt5A
isoformas /
EF1-α) ± SEM a partir de mediciones independientes se muestran. B. Efectos de la expresión ectópica de WNT5A-L y Wnt5a-S isoformas sobre la proliferación. Las líneas celulares indicadas fueron transducidas con vectores de expresión que codifican WNT5A-L (línea azul), WNT5A-S (línea roja) o ninguna WNT (línea Negro) y el número de células se determinó a los 3 y 6 días. WNT5A-S aumenta mientras que WNT5A-L disminuye las tasas de proliferación. se muestran los datos (media ± SEM de determinaciones por triplicado) a partir de un experimento representativo. Cada experimento se realizó al menos tres veces independientes. C. Isoforma siRNAs específicos reducen la expresión de cada isoforma WNT5A. La eficiencia de WNT5A-L y WNT5A-S isoforma desmontables (KD) se evaluó en MDA-MB-231, HeLa y SH-SY5Y transfectadas con ARNsi de control y
WNT5A
siRNA-isoforma específica (KD).
WNT5A
isoformas niveles de transcripción se midieron por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y normalizado por
EF1-α
ARNm (normalización por
GAPDH
ARNm y
18S rRNA
produjo resultados similares). D. Efectos de la caída mediada por siRNA (KD) de WNT5A-L y S-Wnt5A isoformas sobre la proliferación. Las células fueron transfectadas con siRNAs específicos para WNT5A-L (línea azul) o WNT5A-S (línea roja) y el número de células se determinó a los 3 y 6 días. Un siRNA revueltos sirvió como control (línea de color negro). Co-transducción de células con un vector WNT5A-S expresión rescata el efecto de la siRNA Wnt5a-S-específica (línea discontinua roja). se muestran los datos (media ± SEM de determinaciones por triplicado) a partir de un experimento representativo. Cada experimento se realizó al menos tres veces independientes. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,005; ****
P Hotel & lt; 0.001. E. regulación diferencial de
AXIN2
y
CDK8
expresión por caída-isoforma específica de WNT5A. los niveles de transcripción de
AXIN2
y
CDK8
se determinó mediante análisis de RT-PCR cuantitativa (normalizado por
EF1-α
ARNm) en el control de la MDA-MB-231 (carcinoma de mama ), HeLa (carcinoma del cuello uterino) y SH-SY5Y (neuroblastoma) las células, y en respuesta a ARNsi mediada por knock-down (KD) de WNT5A-L o WNT5A-S. La media ± SEM de relaciones se muestran mediciones independientes.
WNT5A-S promueve y WNT5A-L suprime el crecimiento de líneas celulares de cáncer de
Para estudiar las funciones de las isoformas Wnt5A, manipulamos su expresión en varias líneas celulares, incluyendo MDA-MB-231, HeLa y SH-SY5Y, y se analizaron las consecuencias fenotípicas (Figura 3B-D; Figura S5). Dado que las actividades de señalización de WNT proteínas purificadas son de corta duración [30] y biológicos ensayos generalmente requieren largos periodos de estimulación, se utilizó la transfección de
WNT
genes en lugar de la aplicación de las proteínas purificadas. La expresión ectópica de WNT5A-L reduce sustancialmente el número de células en estas líneas celulares (Figura 3B). No se observó evidencia de un aumento de la muerte celular (datos no presentados), lo que indica que WNT5A-L actúa para inhibir la proliferación celular. Por el contrario, la expresión ectópica de WNT5A-S promovió la proliferación de las células SH-SY5Y (Figura 3B) MDA-MB-231, HeLa y
El uso de siRNAs isoforma específica (véase la figura S1; S2 Tabla)., Que expresión alterada de cada isoforma WNT5A (Figura 3C). Los siRNAs fueron capaces de desmontables específicamente sus objetivos de hasta 80%, determinada por qRT-PCR (Figura 3C). Es importante destacar que cada isoforma WNT5A se inhibió selectivamente por el siRNA correspondiente sin afectar los niveles de la otra isoforma. En consonancia con la proliferación de efectos WNT5A S-expresión ectópica, desmontables de promover WNT5A-S reduce el número de células (Figura 3D). Incluso en las células que expresan bajos niveles WNT5A-S, tales como MDA-MB-231 (Figura 3A), desmontables de la WNT5A-S isoforma producido un fuerte efecto inhibidor (Figura 3D). La inhibición de las células resultante de WNT5A-S siRNA fue rescatado en todas las líneas celulares probadas por co-transducción con un vector WNT5A-S desprovista de la secuencia diana siRNA (Figura 3D, KD WNT5A-S + rescate). Estos datos demuestran que el rescate de los efectos de esta siRNA se deben a Wnt5A-S knock-down en lugar de no específicos efectos fuera de la meta. Además, WNT5A-S knockdown aumento de muerte celular en las tres líneas celulares (Figura S5a) y la actividad de la caspasa inducida en MDA-MB-231 y HeLa (Figura S5B). Sin embargo, la reducción ≥3 veces en el número de células (Figura 3D) fue superior al aumento modesto observado en la muerte celular (Figura S5A), lo que sugiere que WNT5A-S knockdown proliferación principalmente deteriorada. Por el contrario, desmontables de WNT5A-L no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular (Figura 3D), la muerte celular o la actividad de caspasa en las líneas celulares 3 (Figura 3D; Figura S5A, B). Tomados en conjunto, estos experimentos demuestran que las isoformas Wnt5a expresadas endógenamente y ectópica ejercen efectos distintos en las líneas celulares de mama, cuello del útero y del tumor neuroblastoma, con WNT5A-S promover y WNT5A-L inhibir la proliferación celular. Dado que no se observan las actividades de señalización diferentes para WNT5A-L y WNT5A-S en Wnt /β-catenina y ensayos de fosforilación DVL (Figura 2), se especula que estos promotores del crecimiento y la inhibición de las actividades de WNT5A son independientes de la vía de señalización Wnt canónica .
En un intento de identificar un mecanismo por el cual las isoformas Wnt5A ejercen efectos diferenciales sobre la proliferación, que exhibió la expresión de varios genes Wnt regula conocidos. Hemos encontrado que la expresión de dos genes,
AXIN2
y
CDK8
, ambos de los cuales han estado implicados en varios aspectos de la señalización de Wnt [7,40,41], fueron regulados diferencialmente por isoform- knockdown específico de WNT5A. Desmontables de WNT5A-L, pero no WNT5A-S, dio lugar a una disminución de la
AXIN2
expresión en 3 líneas celulares ensayadas (MDA-MB-231, HeLa y SH-SY5Y, Figura 3E). Por el contrario, desmontables de Wnt5a-S, pero no WNT5A-L, condujo a un aumento de la
CDK8
expresión en 2 de 3 líneas celulares (MDA-MB-231 y HeLa) y una disminución en SH- SY5Y (Figura 3E). Estos datos ofrece un enlace molecular de potencial entre los efectos diferenciales observados de isoformas Wnt5a sobre la regulación de la proliferación y el gen e indica que cada isoforma WNT5A incide sobre la expresión génica de una manera distinta. , Serán necesarios más estudios exhaustivos, como el análisis del transcriptoma para identificar y definir las vías que median estos efectos diferenciales.
El descenso de regulación de WNT5A-L y la sobreexpresión de la isoforma WNT5A-S en los cánceres
Para determinar si el pro- respectivas funciones y antiproliferativos de la WNT5A-S y L-WNT5A isoformas son relevantes para la oncogénesis, se analizaron sus niveles de expresión por QRT-PCR en muestras de tumores primarios de mama y carcinomas de cuello uterino y neuroblastomas. En comparación con los tejidos normales de mama,
WNT5A-L
se había reducido regulado ≥3 veces en 46% (14 de 30) de los carcinomas de mama (
P
= 0,04) (Figura 4A) .
WNT5A-S
era indetectable en el tejido mamario normal y se sobreexpresa en un pequeño subgrupo de cánceres de mama (4 de 30, 13%, n. S.) (Figura 4A). En el epitelio normal cuello uterino, tanto
WNT5A-L
y
Wnt5A-S
se expresaron,
WNT5A-L sobre ser la isoforma predominante (Figura 4B). En comparación con el cuello uterino normal,
WNT5A-L
se había reducido regulado ≥3 veces en el 53% (8 de 15) de los carcinomas de cuello uterino (
P = 0,047)
. Por el contrario,
WNT5A-S
fue hasta reguladas ≥4 veces en 40% (6 de 15) de estos tumores (
P = 0,045)
(Figura 4B). Neuroblastomas, cánceres pediátricos del sistema nervioso simpático, se pueden clasificar en los tumores de bajo y alto riesgo, con un 90% y un 30% de supervivencia, respectivamente. La mitad de la alta neuroblastomas de riesgo son fatales dentro de 2 años a partir del diagnóstico [42]. neuroblastomas de alto riesgo mostraron baja
WNT5A-L
expresión más frecuencia que los tumores de bajo riesgo (55% -22 de 40- frente a un 21% -8 de 37-,
P
= 0,004), por lo tanto lo que sugiere que WNT5A L-baja regulación se correlaciona con neuroblastoma de alto riesgo.