Extracto
Wnt5a es una de la llamada Wnt no canónica ligandos que no actúan a través de β-catenina. En el desarrollo normal, Wnt5a se secreta y dirige la migración de las células diana a lo largo de gradientes de concentración. El efecto de Wnt5a en las células diana está regulado por muchos factores, incluyendo el nivel de expresión de los inhibidores y receptores. señalización desregulada Wnt5a facilita la invasión de múltiples tipos de tumores en el tejido adyacente. Sin embargo, la expresión y distribución de Wnt5a en el carcinoma cutáneo de células escamosas (SCC) y el carcinoma de células basales (BCC), así como el efecto de Wnt5a en la migración de queratinocitos no se ha estudiado en detalle hasta la fecha. Estamos aquí informe que Wnt5a es upregulated en SCC y BCC y localizado en el borde de ataque de los tumores, así como los fibroblastos asociados a tumores. La agrupación Wnt5a disparado de su receptor Fzd3 proporciona evidencia de gradientes de concentración Wnt5a se proyectan en el tumor. Los ensayos in vitro de migración muestran que Wnt5a gradientes de concentración determinar su efecto sobre la migración keratinoctye: Si bien la migración quimiotáctica es inhibida por Wnt5a presentes en concentraciones homogéneas, que se mejora en presencia de un gradiente de Wnt5a. De perfiles de expresión de la vía Wnt muestra que la regulación al alza de Wnt5a en SCC está acoplado a la represión de la señalización de Wnt canónica. Esto es confirmado por inmunohistoquímica que muestra la falta de β-catenina nuclear, así como la acumulación de ausente AXIN2. Dado que ambos tipos de señalización Wnt acto mutuamente antogonistically en múltiples niveles, la represión concurrente de señalización Wnt canónica sugiere hiper-activa la transducción de señales Wnt5a. De manera significativa, esta combinación de la desregulación de genes no se observa en la psoriasis enfermedad inflamatoria de la piel hiperproliferativas benignas. En conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que la señalización Wnt5a contribuye a la invasión de los tejidos por el cáncer de piel no melanoma
Visto:. Pourreyron C, L Reilly, Proby C, Panteleyev A, C Fleming, McLean K, et al. (2012) Wnt5a se expresa fuertemente en el borde delantero de cáncer de piel no melanoma, formación de gradientes activos, mientras canónica de Wnt de señalización es reprimida. PLoS ONE 7 (2): e31827. doi: 10.1371 /journal.pone.0031827
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Octubre, 2011; Aceptado: January 12, 2012; Publicado: 22 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Pourreyron et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Cancer Research UK (C. Pourreyron, APS). C. Pourreyron fue financiado por Debra Internacional (Asociación de Investigación de la epidermolisis bullosa distrófica) y el Consejo Europeo de Investigación (CEI) (APS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Sin alas de tipo (Wnt) ligandos son moléculas de señalización importante en el desarrollo. ligandos Wnt se clasifican como "canónicos" o "no canónico" [1]. Canonical Wnts, ejemplificada por Wnt3a, se unen a los receptores de tipo Fzd, así como co-receptores LRP5 /6, seguido por el reclutamiento de un complejo de proteína heteromérica incluyendo Dishevelled, Axin, y GSK3 al complejo receptor. Esto conduce a la fosforilación de LRP5 /6, la liberación y la translocación nuclear de β-catenina, que culminó en la inducción de genes diana. Por el contrario, no canónica Wnts, incluyendo Wnt5a, se unen a receptores Fzd en combinación con co-receptores alternativos, incluyendo ROR1 /2 o Ryk, provocando cambios β-catenina-independiente, tales como la activación de PKC y reordenamientos del citoesqueleto [2]. Es importante destacar que, al unirse a receptores comunes Fzd, Wnt actúan como antagonistas competitivos canónicos y no canónicos en los receptores compartidos [3].
En el desarrollo, la secreción de todos los ligandos Wnt, incluyendo Wnt5a se somete a control temporal y espacial precisa con lo cual se consiguen los gradientes de concentración [4]. Estos gradientes movimiento morfogenético directa de las células diana, así como la disposición de la polarización asimétrica de las células epiteliales [5]. Por lo tanto, Wnt5a dirige esencialmente migración de las células en el tejido circundante, por ejemplo en el desarrollo de extremidades. Uno de los elementos clave para determinar el efecto de Wnt en las células diana es la presencia de proteínas inhibidoras secretadas. Estos incluyen la familia Dickkopf (DKK), que se unen específicamente LRP5 /6, por lo que sirve como inhibidores específicos de Wnt canónica. Otros inhibidores incluyen Wif y las proteínas relacionadas Frizzled secretadas (SFRP) que se unen los dos tipos de ligandos Wnt, así como los receptores Fzd, inhibiendo de este modo tanto canónica y canónica Wnts [6]. La distribución espacial de la SFRP, Fzd, DKK, y Wnt está orquestada minuciosamente en el desarrollo (por ejemplo, [7], creando corredores de difusión de la actividad de Wnt.
No es sorprendente dado su papel como regulador de la migración celular en el tejido adyacente , la activación no regulada de Wnt5a se ha asociado con la invasividad y en varios tipos de tumores, incluyendo melanoma [8], [9], cáncer de mama [10], cáncer gástrico [11], cáncer de páncreas [12], y osteosarcoma [13] . invasión tumoral relacionada con Wnt5a-también puede estar mediada por las células asociadas a tumores. Así, las células de cáncer de mama inducen la expresión Wnt5a en los macrófagos infiltrantes de tumor, causando la síntesis de metaloproteinasas de la matriz (MMP) 7 [10].
Wnt5a se pueden unir varios receptores frizzled, incluyendo FZD2, Fzd5, Fzd3, FZD4. de éstos, hemos demostrado previamente que Fzd5 y Fzd3 se expresan en el tejido de los padres, tanto para el carcinoma de células escamosas (SCC), la epidermis, y el carcinoma de células basales (BCC ), el folículo piloso, respectivamente [14]. Estas isoformas del receptor Fzd también se han demostrado mediar la motilidad direccional Wnt5a inducida en el melanoma [15], así como la migración invasiva en el cáncer de mama [16]. Es importante destacar que, Fzd3 recientemente se ha demostrado que se acumulan en agregados focales polarizados cuando las células se exponen a un gradiente de Wnt5a in vitro [15]. Mientras gradientes Wnt5a no pueden ser detectados directamente en el tejido primario, este descubrimiento abre la posibilidad de la utilización de la distribución intracelular de Fzd3 como indicador de gradientes Wnt5a funcionales que actúan sobre las células
in vitro
.
no melanoma cáncer de piel, que comprende BCC y SCC es el cáncer más común y humana sigue aumentando en incidencia con más de 100.000 casos diagnosticados cada año en el Reino Unido. Aunque sólo SCC hace metástasis en individuos inmunocompetentes, los CE son altamente invasora local, haciéndolos fácilmente modelos naturales disponibles para estudiar la invasión de tejidos. La expresión de receptores afines Wnt5a y no se ha estudiado en el nivel de proteína en estos tumores y existen pocos datos sobre el efecto de la migración direccional Wnt5a en las células SCC o queratinocitos in vitro.
A continuación se presenta la distribución de Wnt5a y los receptores Fzd5 y Fzd3 en SCC y BCC. Utilizamos Fzd3 de localización para identificar los gradientes Wnt5a operativos en la piel de adultos, así como en SCC /BCC. Proporcionamos una prueba más funcional que los gradientes Wnt5a mejorar la motilidad de los queratinocitos dirigidos. De perfiles de expresión muestra que invasiva SCC, en contraste con la hiperproliferación de los queratinocitos inflamatoria benigna, está marcada por la regulación por incremento concomitante de no canónica y la represión de la señalización de Wnt canónica. Nuestros datos permiten la formulación de un modelo de trabajo de cómo Wnt5a puede actuar para mejorar la motilidad e invasividad de estos tumores.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Antes de la biopsia, los pacientes dieron su consentimiento por escrito para el almacenamiento y análisis de muestras de biopsia. Almacenamiento y uso de todos los tejidos incluidos en el trabajo que aquí se presenta se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Investigación Médica Tayside Ética B (ref REC. Nr. 07 /S1402 /90).
las muestras tumorales
SCC aquí estudiados fueron extirpados de pacientes inmunocompetentes de la cabeza (n = 7) o las manos /piernas (n = 4), en cada caso con signos de daño solar que rodean y se clasifica como bien diferenciado (n = 8), o moderadamente /pobremente diferenciado (n = 3). BCC (n = 9) fueron todos de la cabeza, a excepción de un BCC extirpados de la mano
La inmunohistoquímica
Los anticuerpos utilizados fueron anti Wnt5a (R & amp;.. D, orden nr AF645, última 1:400 dilución, el anticuerpo alternativa (mostrada en la figura S1:.. Abcam, clon 3D10, orden nr Ab86720, utilizado a una dilución 1:10000), anti-rizado 3 (Insight Biotech, ordenó a través Acris Los anticuerpos, Alemania, orden nr. SP4568P, 1:200), anti-frizzled 5 (Cambridge Bioscience, ARP41245_P050, 1:800), β-catenina (Millipore, 05-665). La inmunohistoquímica se llevó a cabo exactamente como se describe [14] usando muestras incluidas en parafina obtenidas a partir de el banco de tejidos Tayside.
la expresión estable de Wnt5a y cultivo de células
Establecimiento de células HaCat Wnt5a-transfectadas de forma estable.
se obtuvieron células HaCat como se describe anteriormente [17]. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo antes de la transfección lipofectamina con cualquiera constructo pcDNA3 WNT5A-HA (humano de longitud completa Wnt5a recombinante con etiqueta HA C-terminal) o una pcDNA3 vector vacío. Las células fueron transfectadas con 1 g de ADN de plásmido formando complejo con 8 l Lipofectamine 2000 reactivo de transfección y se incubaron con complejo de transfección durante 4 horas. Se eliminó el sobrenadante y se añadió DMEM + 10% de FCS que contienen 800 mg /ml de G418 a cada pocillo. Las células se observaron en el transcurso de dos semanas, con cambios de medio cada 2-3 días. Una vez que las colonias empezaron a aparecer, las células se tripsinizaron y se transfirieron a 25 cm frascos de cultivo
2 células. Los cultivos se mantuvieron en DMEM que contenía 10% de FCS (no inactivado por calor) con 800 g /ml G418. Continúa la expresión Wnt5a se verificó mediante Western blot utilizando anti-Wnt5a (R & amp; D, AF645, la dilución 1:1000).
Transwell ensayo de migración
Un sistema Transwell que incorpora una membrana de filtro de policarbonato con un diámetro de 6,5 mm y el tamaño de poro de 8 mm (Corning, Sigma-Aldrich, Poole, UK) se utilizó para evaluar la tasa de migración de células. las células tratadas con mitomicina C (1 × 10
5) se suspendieron en 100 l de BSA al 0,1% DMEM con o sin humano /ratón Wnt5a recombinante (0,1 mg /ml) (amplificador de I + D; D, Abingdon, Reino Unido, orden nr. 645-WN) y se sembraron en la cámara superior del inserto Transwell. La cámara inferior se llenó con 600 l de DMEM suplementado con 5% de FBS. La migración de células HaCaT-pcDNA en presencia de un gradiente de concentración Wnt5a se realizó como sigue. Wnt5a células que sobreexpresan o pcDNA HaCat fueron sembradas en 24 w /placas de 48 h antes de añadir el Transwell inserta hasta alcanzar la confluencia. Inmediatamente antes de la adición de los insertos Transwell que contienen células HaCat-pcDNA (en 0,1% de BSA que contiene DMEM) a los medios en los pocillos se sustituyen por fresco 5% FBS DMEM para eliminar cualquier Wnt5a pre-secretada. Las placas se dejaron durante 18 horas a 37 ° C. Posteriormente, las células en los filtros se tiñeron con 1% de bórax y 1% de azul de metileno. Las células no migratorios en la superficie superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón y las células que migraron a la superficie inferior del filtro se lisaron con una solución de 1% de SDS y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 630 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
migración de Scratch herida ensayo
Las células se cultivaron hasta la confluencia en una placa de 6 pocillos en medio HaCaT. Dos horas antes de la herida, las células se trataron con mitomicina C (10 mg /ml) para prevenir la proliferación. Una herida se hizo mediante la aplicación de una punta de pipeta de plástico 200 l a través del centro de la capa celular. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron en DMEM suplementado con 10% o el 1% de FCS.
perfiles de expresión
El 2 conjunto de datos de matriz procesada transformación logarítmica se obtuvo a partir de [18]), los datos de la inversa del log2 calculados, y los factores de cambio entre el SCC y el control de la piel expuesta al sol calculados para cada caso (n = 12). Media de los factores de cambio y pruebas t se calcula tal y como se describe [19]. análisis de la psoriasis perfil de expresión se llevó a cabo como se describe [19].
Resultados
Wnt5a se expresa fuertemente en el cáncer de piel no melanoma
Se estudió la expresión Wnt5a en un panel de SCC (n = 11) y BCC (n = 9), extirpados de individuos inmunocompetentes, por inmunohistoquímica. Con el fin de permitir una evaluación semicuantitativa se utilizó la expresión previamente caracterizado de Wnt5a en la capa basal de la epidermis o [14] como la calibración interna. Como se muestra en la figura 1, Wnt5a se expresa fuertemente en tanto SCC y BCC con respecto a su nivel de expresión en la capa basal de la epidermis (marcado con la flecha negro) en las mismas secciones (fig. 1a, c). fibroblastos asociados a tumores, así como células endoteliales también tiñen fuertemente positivas para Wnt5a (fig. 1b, d, flechas rojas y azules, respectivamente). Aunque Wnt5a tinción fue detectable a lo largo de los tumores (ejemplo mostrado en la fig. 1a), fue más intensa en el borde delantero de la mayoría de los tumores (fig. 1E). Estos resultados fueron consistentes entre todas las muestras tumorales estudiadas (tabla 1) y por debajo y fueron reproducibles utilizando un anticuerpo alternativa para IHC (figuras S4, S5).
La inmunohistoquímica de Wnt5a de SCC (a, b), o BCC (c, d), que se muestra a 40 × (a, c), o 200 × (b, d) la ampliación. (E) Tres tumores SCC, que se muestran en el aumento de 10x, lo que ilustra fuerte Wnt5a - tinción en el borde del tumor. Las figuras que se muestran son representativos de SCC (n = 12), y BCC (n = 9), respectivamente. Las puntas de flecha indican las siguientes estructuras: negro - capa basal de la epidermis, tumores blanco-, las células endoteliales asociados a tumores red-, fibroblastos Blue-, verde - folículo piloso
distribución polarizada de Focal. Fzd3 en el cáncer de piel no melanoma de piel e indica gradientes Wnt5a
gradientes de concentración
Wnt5a no pueden ser detectados directamente in vivo. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que, al detectar un gradiente de concentración Wnt5a, las células diana responden liando el receptor Fzd3 Wnt5a en agregados focales in vitro [15]. Por lo tanto, los agregados Fzd3 se pueden utilizar como marcador indirecto para identificar las células expuestas a una gradientes Wnt5a en el tejido primario mediante inmunohistoquímica. De hecho, encontramos que Fzd3 exhibió una distribución focal sorprendentemente polarizado tanto en los queratinocitos epidérmicos, así como en los folículos pilosos (Fig. S1), lo que sugiere que los gradientes Wnt5a son operativos no sólo en el desarrollo, pero también en la piel diferenciado adulto. A continuación, se investigó la distribución Fzd3 en las secciones del tumor. Al igual que con Wnt5a, se utilizó la intensidad de la tinción de Fzd3 en la epidermis en cada sección para evaluar semicuantitativamente el nivel relativo de expresión (fig. 2a, negro vs. flechas blancas). Como se muestra en la figura 2, Fzd3 se encontró en una distribución zonal, de modo que Fzd3-negativo áreas tumorales alternan con Fzd3-positiva áreas (fig. 2b, e) dentro de los tumores, mientras que los bordes invasivos no mancha positiva (fig. 2d ). fibroblastos de tumores infiltrantes y células endoteliales fueron negativos para Fzd3. En esas células tumorales que expresaban Fzd3, Fzd3 exhibió unas pronunciadas agregados intracelulares focales polarizadas, lo que sugiere la existencia de gradientes Wnt5a. Sin embargo, en contraste con la epidermis normal, Fzd3-agregados se no alineados a lo largo de planos recogniseable, indicativo de gradientes Wnt5a desorganizado. Este patrón general de expresión Fzd3 era bastante comparables entre todos los tumores estudiados (tabla 1).
La inmunohistoquímica realizada como en la figura 1 se realiza en SCC (a-d), o BCC (e-f) que se muestra a 40 × ( a), 100 × (b, d, e), o 400 × (c, f) la ampliación, respectivamente. Las flechas negras indican la intensidad de tinción de Fzd3 en la epidermis utilizados para evaluar la intensidad de la tinción en los tumores (indicado por flechas blancas). Las flechas rojas indican límites de los tumores, apuntando hacia el estroma.
expresión heterogénea de Fzd5 en el cáncer de piel no melanoma
Fzd5 es otro receptor Wnt5a reconocido. Ya que anteriormente encontrado que la expresión Fzd5 en epidermis adultos se limita a la capa granular de alta ([14] y la figura 3a, flecha negro), indicativa de un patrón de expresión regulado por la diferenciación, se estudió si la expresión Fzd5 en los cánceres refleja el estado de la diferenciación del tumor. En contraste con Fzd3, Fzd5 no exhibió distribución intracelular focal y fue variable entre los tumores individuales. Mientras que la mayoría de los tumores SCC exhibido moderada a fuerte expresión Fzd5 (fig. 3a, c), 3 de 11 tumores mostró débil a ausente tinción (fig. 3b, d). Es de destacar que estas variaciones no estaban relacionados con el estado de diferenciación tumoral. Sólo dos muestras BCC mostraron una fuerte expresión Fzd5 (fig 3 g.), Mientras que era bajo o indetectable en la mayoría (fig 3f, h;. Tabla 1). Al igual que con Fzd3, los tumores que expresaban Fzd5 exhibieron Fzd5-positivas regiones que alternan con regiones Fzd5-negativas (fig. 3a). Por el contrario, tumorales - células endoteliales asociada mostraron consistentemente fuerte expresión Fzd5 (fig 3c, h.). fibroblastos asociados a tumores eran débiles a moderadamente positivo para Fzd5 (fig. 3c, recuadro). Por lo tanto, mientras que la expresión Fzd5 es variable en células de cáncer de piel no melanoma, su nivel de expresión en el tumor de vasos es consistente con un papel de este receptor en la mediación de las vías inflamatorias Wnt5a-dependiente, de acuerdo con informes anteriores [20], [21].
la inmunohistoquímica de SCC (a-d), o BCC (e-h), en cada caso, que muestra un ejemplo de los tumores que exhiben alta (SCC: a, c; BCC: e, g) o bajo (SCC : b, d; BCC: f, h) la expresión Fzd5. intensidades de tinción en los tumores se pueden comparar directamente con las intensidades de tinción de Fzd5 en la capa granular de la epidermis (puntas de flecha negras). Los paneles a, b, e, f se muestran en 40 × y c, d, g, h a 200 × magnificación. El recuadro en la parte inferior derecha de (c) muestra un fibroblasto asociado al tumor. Las flechas rojas indican los vasos sanguíneos.
receptores Wnt5a y Fzd se expresan por subconjuntos de células tumorales
A continuación estudiamos la relación espacial de Wnt5a, Fzd3, y en Fzd5 tumor individual que no se superponen muestras. Con este fin, se determinó intensidad de la tinción de estas proteínas en secciones en serie de tumores individuales, respectivamente, ya que los anticuerpos adecuados para la co-inmunofluorescencia en muestras incluidas en parafina no estaban disponibles. Como se muestra en la figura 4, Wnt5a se expresa predominantemente en los márgenes tumorales en SCC (así como en el estroma asociado al tumor). Por el contrario, Fzd3 localiza en las células dentro de la masa tumoral, a veces formando nido-como tumorales-dominios Fzd3-positivas (panel medio, cabeza de flecha blanca) y, como se describe anteriormente, mostrando la distribución intracelular focalmente polarizada. Fzd5 exhibió la distribución intra-tumoral heterogénea, siendo localizada a las agrupaciones intra-tumorales (arriba), debilidad /difusamente en el borde (inferior), o de forma homogénea en toda (en el centro). disposiciones análogas que se observaron en el BCC, con Wnt5a estar más fuertemente expresado en el borde delantero, así como en el estroma asociado al tumor (Figura 5, paneles de la izquierda), mientras que Fzd3 mostró expresión polarizada dentro del tumor (figura 5, la parte superior central), o en Fzd3 positivo nidos (puntas de flecha blanca). Fzd5 era débil o ausente en la mayoría de los CBC (abajo a la derecha, véase el cuadro 1). Cuando se expresa, Fzd5 exhibió localización intra-tumor difuso (superior derecha), o en el borde del tumor (media derecha). Tomados en conjunto, los datos muestran que Wnt5a y sus receptores se expresan mediante subpoblaciones que no se superponen. La fuerte expresión de Wnt5a en el borde de ataque, así como en células del estroma que rodea tumorales, en relación con la expresión polarizada de Fzd3 dentro de la masa tumoral sugieren que los gradientes Wnt5a proyectan en el tumor para mejorar la motilidad en distintas subpoblaciones.
Las secciones seriadas de tres muestras tumorales incluidas en parafina (SCC parte superior, media, fila inferior, respectivamente) fueron teñidas con Wnt5a, Fzd5, Fzd3, respectivamente, tal como se describe en Métodos, y se muestran a 200 × magnificación. asterisco rojo indica la tinción nuclear artificial, posiblemente debido a las condiciones de recuperación de antígeno. Las flechas rojas indican los límites de los tumores, apuntando hacia el estroma
La inmunohistoquímica de muestras cortadas en serie teñidas para Wnt5a, Fzd5, o Fzd3 como se ha indicado, la ampliación:. 100 × (fila superior), 200 × (media, filas inferiores).
Wnt5a gradientes de concentración mejoran la motilidad direccional de los queratinocitos
Los datos resumidos por encima de los gradientes de concentración Wnt5a sugeridas puede ser importante por su efecto sobre la motilidad celular. Para probar esta hipótesis funcionalmente, se utilizó queratinocitos humanos HaCaT como modelo. Nos células transfectadas establemente con un vector HaCat Wnt5a que expresan, o vector vacío de control (denominado HaCat pcDNA). La expresión de Wnt5a recombinante se verificó mediante Western-blot (Fig. 6A). En primer lugar, se evaluó dirigieron la migración celular en un ensayo Transwell de dos cámaras. Como se muestra en la figura 6B, cuando se añadió Wnt5a recombinante directamente a HaCat-pcDNA queratinocitos en la cámara superior, por lo tanto presente en una concentración homogénea alrededor de la migración de células, se inhibe la migración quimiotáctica hacia 5% de FCS presente en la parte inferior así. Del mismo modo, la migración quimiotáctica se redujo significativamente en células que sobreexpresan Wnt5a relación con las células no sobreexpresan (fig. 6C). Un resultado similar se obtuvo en un corto plazo (6 horas) ensayo de migración utilizando 5% de FCS o EGF como quimioatrayente (fig. S2A). Además, en los ensayos de cero, la migración de las células HaCat Wnt5a sobreexpresan en 10% de FCS DMEM (fig. 6D) hacia el borde cero fue muy reducida en comparación con células HaCaT-pcDNA (Resultados similares se encontraron cuando se utiliza 1% de FCS como quimioatrayente, fig. S2A). Por lo tanto, la migración de queratinocitos se inhibe cuando Wnt5a rodea las células a una concentración homogénea. Por el contrario, cuando se sembraron Wnt5a secretoras de células HaCat en la parte inferior de una cámara Transwell, estableciendo así un gradiente de concentración Wnt5a hacia arriba, la migración de la no Wnt5a sobreexpresan células HaCaT sembradas en la cámara superior hacia la fuente Wnt5a fue significativamente mayor (fig. 6e). Estos datos muestran que los queratinocitos humanos son inducidas a migrar hacia un Wnt5a-gradiente, pero que no disminuye la motilidad gradiente Wnt5a hacia otros quimioatrayentes.
A. La expresión de endógeno y Wnt5a recombinante en lisados de células enteras de transfectadas establemente Wnt5a sobreexpresan HaCat o células control (HaCat-pcDNA) verificó por transferencia de Western. sobreexpresan células HaCaT-pcDNA B. Non-Wnt5a se sembraron en la cámara superior de un Transwell en 0,1% de BSA DMEM en ausencia o presencia de Wnt5a recombinante a 1 mg /ml, como se indica en la figura. La cámara inferior se llenó con 600 l de DMEM que contiene FCS al 5% como quimioatrayente. Los resultados se expresan como porcentaje de células que migran cuando HaCat-pcDNA se sembraron en 0,1% de BSA DMEM solamente. Los resultados mostrados representan la media ± S. D. de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado, * p = 0.05. C. Comparación de la migración de células que sobreexpresan Wnt5a y control pcDNA. Las células suspendidas en 0,1% de BSA DMEM se sembraron en la cámara superior. La cámara inferior se llena con 600 l de DMEM que contiene FCS al 5% como quimioatrayente. La migración se evaluó a las 18 h usando un ensayo colorimétrico. Los resultados se expresan como porcentaje de células que migran HaCat-pcDNA. Los resultados mostrados representan la media ± S. D. de n = 4 experimento independiente, cada uno realizado por triplicado, *** p≤0.001. ensayo de Scratch herida D. realizó en las células tratadas con mitomicina-C. Durante la migración, HaCat-pcDNA (a, b, c), o células Wnt5a sobreexpresan (d, e, f) se mantuvieron en DMEM que contiene 10% de FCS. Se tomaron fotos justo después de la cero se hizo (0 horas) (A y D), así como 18 h (B y E) y 24 h más tarde (c y f). E. La migración de células de control HaCat-pcDNA en presencia de un gradiente de concentración Wnt5a. Wnt5a células que sobreexpresan o pcDNA HaCat se sembraron en los pocillos de fondo de las placas Transwell. Inmediatamente antes de la adición de los insertos que contienen células HaCaT-pcDNA en la cámara superior, los medios de comunicación en los pocillos de fondo fue reemplazado para eliminar Wnt5a pre-segregada. La migración se evaluó a las 18 h. Los resultados se expresan como porcentaje de células que migran HaCat-pcDNA. Los resultados mostrados representan la media ± S. D. de n = 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado, *** p≤0.001.
El aumento de expresión en Wnt5a cutánea SCC es acompañada por la represión de la señalización de Wnt canónica y la regulación a la baja de la señalización inhibidores
Desde vías canónicas y no canónicas transversal inhiben entre sí, el efecto de Wnt5a señalizadoras
in vitro
depende de la abundancia relativa de otros ligandos, moduladores, receptores y efectores aguas abajo en la señalización Wnt red. Para ello hemos realizado un análisis global de la expresión de los componentes de señalización Wnt-en el carcinoma de células escamosas invasivo primario cutáneo. Como se muestra en la Tabla 2, Wnt5a fue el más upregulated significativamente de todos los ligandos Wnt (cuatro veces, p = 8 × 10
-6), confirmando los datos independenly inmunohistoquímica. Por el contrario, el miembro de Wnt canónica más altamente expresado, Wnt3a, es significativamente baja regulado, aliviando así el antagonismo competitivo para Wnt5a a nivel del receptor. (Otro ligando Wnt canónica, Wnt8b, está regulada positivamente formalmente, pero parece ser expresadas en niveles mucho más bajos en total, Tabla 2). Entre los receptores de unión a frizzled Wnt5a-reconocidos, FZD2 y Fzd5 son upregulated, aunque a la significación estadística marginal (Tabla 3). Entre los antagonistas de Wnt extracelular SFRP1 está regulada positivamente, en consonancia con una mayor represión de la señalización de Wnt canónica (véase más adelante, la discusión). DKK2, específicos para los miembros canónica de Wnt, también se reprime, sino la expresión de la mucho mayor expresaron DKK1 no se altera. Por el contrario, los antagonistas dirigidos tanto canónica y no canónica de Wnt, con la SFRP2 y /3, así como la clave antagonista de la señalización intracelular AXIN2, están regulados a la baja todos significativamente. Estos cambios se resumen gráficamente en la fig. 7a. En conjunto, sugieren que la regulación al alza de Wnt5a en SCC invasivo es parte de un conjunto de cambios que actúan de forma sinérgica para impulsar no canónica, pero reprimir la señalización de Wnt canónica (véase más adelante, la discusión).
(a) de la historieta que ilustra las relaciones funcionales entre los componentes de señalización Wnt que figuran en las tablas 2 y 3. rojo: upregulated, verde: las reguladas. Las grandes líneas de puntos representan la proteína de unión. (B) la desregulación específica de SFRP1 y SFRP2 en SCC invasivo, pero no la psoriasis. Doblar-desregulación de las transcripciones de las placas de psoriasis se calculó como se describe anteriormente [19] y alineado con el conjunto de datos HAC se describe en las tablas 2 y 3. El código de colores y negrita configurados como en la tabla 2. "ns":. No significativa
inversa concurrente regulación transcripcional de Wnt5a y Wnt3a distingue de SCC no invasiva hiperproliferación benigna
La regulación positiva de la transcripción de la misma Wnt5a es poco probable que cause la invasividad, ya que es también fuertemente upregulated en la psoriasis, un trastorno hiperproliferativo, pero no invasivo [14]. Por lo tanto, hemos tratado de identificar factores adicionales que dan vuelta a la acción fisiológica Wnt5a en un promotor para la migración invasiva. Con este fin se compararon la expresión genética de los componentes de señalización Wnt en SCC con la psoriasis. En ambas condiciones, el estado patológico respectivo se compara con la piel control sano. El nivel relativo de expresión de genes, expresada como nivel de rango, se encontró una buena correlación entre las muestras de piel de control en ambos conjuntos de datos, respectivamente, lo que indica que la desregulación de los genes detectados en cualquiera de estas condiciones se produce respecto a un control similar (Fig. S3). La figura 7b muestra un mapa de calor desregulación código de colores de los componentes de señalización Wnt-enumerados en las tablas 2 y 3 para SCC frente a la psoriasis. En confirmación de nuestros resultados anteriores [14], y Wnt5a Fzd5 también están regulados por incremento en la psoriasis. Asimismo, la regulación a la baja de la DKK2 inhibidor de wnt canónica, CTNNBIP1 (ICAT), AXIN2, así como FRZB (sFRP3) es común a SCC y la psoriasis. Sin embargo, la represión de Wnt3 así como la desregulación de SFRP1 y SFRP2 sólo se encuentran en SCC cutáneo invasivo, pero no la psoriasis.
La falta de tinción de β-catenina nuclear y débil expresión de la proteína AXIN2 confirman las reguladas canónica Wnt de señalización en SCC y BCC
con el fin de obtener evidencia adicional independiente para el estado de activación de la vía canónica de Wnt de señalización se realizó inmunohistoquímica de β-actina, utilizando un anticuerpo específico para activado (Ser38 /Thr41 dephosphorylated) β - actina. Como se muestra en la figura 8, β-catenina nuclear era abundante en la capa granular de la epidermis, pero ausente de cualquiera de SCC o tumores BCC. Esto fue cierto para todos SCC (n = 12) y CCO (n = 7) muestras estudiadas. Además, nos aprovechamos de la matriz de depósito de tejido disponible públicamente disponible en la página web ProteinAtlas. Esta base de datos contiene datos de inmunohistoquímica que varían en calidad dependiendo de los reactivos utilizados. En el caso de β-catenina, el sitio contiene series teñidas con cuatro anticuerpos diferentes, tres de los cuales han sido validados ampliamente (ver Datos S1). imágenes IHC generados usando ya sea el mismo anticuerpo específico para β-catenina o la detección de anticuerpos β-catenina total de activado reveló la presencia de la membrana situada β-catenina pero la ausencia constante de β-catenina nuclear en 12/12 SCC y en 11 /BCC el uso de cuatro anticuerpos diferentes (fig. 9, Data S1). Por último, también minó los datos en ProteinAtlas disponibles para AXIN2. A pesar de que el nivel de la validación de este anticuerpo no es tan robusto como para los anticuerpos β-catenina, los datos disponibles sugieren fuertemente que AXIN2 falla a acumularse en cualquiera de SCC o BCC (figura S6). Por lo tanto, los datos del nivel de proteína son consistentes con la expresión de datos de perfiles, lo que sugiere la represión de la señalización de Wnt canónica.
Inmunohistoquímica de tres BCC (a-c) y SCC (d-f) muestras teñidas con un anticuerpo específico para activan ß-catenina. Nota fuerte β-catenina nuclear confinado a la capa granular de la epidermis en cada muestra, así como en un folículo piloso ampliada inmediatamente por debajo de las células SCC (inserción en d). Todas las muestras presentan a un aumento de 100x, inserción en 400 ×.
Las muestras fueron teñidas o bien con un anticuerpo específico para no fosforilados β-catenina activada (arriba) o pan-β-catenina (parte inferior) . Imágenes en (a) y (d) muestran la distribución de β-catenina observado con el anticuerpo correspondiente. Tenga en cuenta que la fuerte β-catenina nuclear se limita a la capa granular de la epidermis.
Discusión
Numerosos estudios han sugerido un papel en la invasión de Wnt5a cáncer (por ejemplo, [16], [22] -.. [25] No obstante, el papel de Wnt5a en el cáncer es controversial, algunos informes sugieren que Wnt5a puede actuar como supresor de tumores por antagonizar la señalización de Wnt canónica (revisado en [26]) por otra parte, tanto canónica y