Extracto
Antecedentes
Aproximadamente el 60-80% de los pacientes con avanzado de cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) mueren dentro de los cinco años después del diagnóstico. quimioterapia basada en cisplatino es el tratamiento paliativo más comúnmente utilizado para estos pacientes. Para evaluar el valor pronóstico de la ligada al X inhibidor de la apoptosis nivel (XIAP) como un biomarcador potencial en estos pacientes, se determinó la relación entre la expresión de XIAP y la respuesta de estos pacientes cisplatino y su pronóstico.
Metodología /Principales hallazgos
Sesenta pacientes con CECC avanzados fueron reclutados en este estudio. La expresión de XIAP se examinó antes y después de la quimioterapia y se correlacionó con la respuesta a la quimioterapia, los parámetros clinicopathology y los resultados clínicos de los pacientes. Se encontró que XIAP se expresó en 17 (20,83%) de las 60 muestras CECC avanzados y la expresión se asoció significativamente con la resistencia a cisplatino (P = 0,036) y los pobres resultados clínicos (p = 0,025). inducida por la quimioterapia XIAP expresión basada en cisplatino en esas muestras post-quimioterapia (p = 0,011), se asocia más con peor evolución clínica (p = 0,029). El análisis multivariado demostró que sólo el consumo de alcohol, metástasis en los ganglios linfáticos y el nivel de XIAP se asociaron de forma independiente con el pronóstico de los pacientes con CECC avanzados. La inhibición de la expresión de XIAP con siRNA en células HNSCC sobreexpresa XIAP notablemente aumentado su sensibilidad al tratamiento con cisplatino a casi una diferencia de 3 veces.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión de XIAP juega un papel importante en el curso de la enfermedad y cisplatino resistencia de HNSCC avanzada. XIAP es un predictor valiosa de cisplatino-respuesta y el pronóstico para los pacientes con cáncer de cabeza y cuello. Down-regulación de XIAP podría ser una terapia adyuvante prometedor para aquellos pacientes de HNSCC avanzada
Visto:. Yang X-H, Feng Z-E, Yan M, Hanada S, Zuo H, Yang C-Z, et al. (2012) XIAP es un predictor de respuesta a la quimioterapia basada en cisplatino y pronóstico de los pacientes con cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10.1371 /journal.pone.0031601
Editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 1 de septiembre de 2011; Aceptado 10 de enero de 2012; Publicado: 5 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 30.772.433), el Proyecto de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (Grant No. 07QA14038), y Shanghai Líder Disciplina Proyecto Académico (Proyecto Nº S30206). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo y es la neoplasia más común en Asia Central [1]. Aunque CECC en estadio temprano tienen altas tasas de curación, hasta el 50% de los pacientes presentan enfermedad avanzada [2]. Entre estos pacientes etapa HNSCC avanzadas, 60-80% morirá dentro de los 5 años después del diagnóstico [3]. Actualmente, la quimioterapia basada en cisplatino es el tratamiento paliativo más comúnmente utilizado para estos pacientes. Sin embargo, en la clínica sólo un número limitado de pacientes se benefician de la quimioterapia basada en cisplatino; otros pacientes son resistentes a esta terapia y algunos morirán debido a la toxicidad relacionada con el tratamiento [4]. Por lo tanto, es esencial para buscar predictores o biomarcadores potenciales que pueden ayudar a identificar a los pacientes que pueden beneficiarse de la quimioterapia basada en cisplatino.
Los inhibidores de proteínas de apoptosis (IAP) representan un conjunto de moduladores endógenos potentes de la apoptosis en células de mamífero, que constan de ocho miembros: XIAP, cIAP1, cIAP2, survivina, NIAP, Bruce, ML-IAP y la ILP-2 [5]. Estas proteínas median múltiples funciones biológicas que incluyen la unión a y la inhibición de las caspasas, la regulación de la progresión del ciclo celular y la modulación mediada por el receptor de transducción de señales [6]. Entre ellos, X-ligada inhibidor de la apoptosis (XIAP) es uno de los más potente inhibidor de caspasas y apoptosis. XIAP puede unirse directamente a e inhibir tanto el iniciador y efectoras caspasas e inhibir tanto mitocondrial dependiente y -independiente vías de apoptosis [7], [8], [9]. Hallazgos recientes han demostrado
in vitro
, XIAP puede causar resistencia entre las células tumorales cuando se expone a una variedad de estímulos apoptóticos, incluyendo la quimioterapia [10], [11]. Sin embargo, no se sabe si el nivel de expresión de XIAP se podría utilizar para predecir la respuesta de cisplatino HNSCC avanzada. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio fue investigar la expresión de XIAP en HNSCC avanzada y su relación con la respuesta de cisplatino y el pronóstico de estos pacientes.
Resultados
nivel de expresión de XIAP se asocia con un pobre el resultado clínico de los pacientes HNSCC avanzada
XIAP fue localizada principalmente en el citoplasma de las células tumorales (Figura 1), con una tasa positiva muy variable de 1% -85%. Núcleo tinción se observó ocasionalmente en algunas muestras post-quimioterapia. Los pacientes cuyos tumores expresan altos niveles de XIAP generalmente tenían un peor pronóstico que aquellos pacientes cuyos tumores se expresa bajos niveles de XIAP en el tejido canceroso de pre-quimioterapia (supervivencia global
P
= 0,025, prueba de Log Rank, Figura 2). tasa de expresión XIAP no se correlacionó con el estadio TNM, el grado patológico, el tabaquismo y la historia alcohol de estos pacientes con HNSCC avanzada (Tabla 1). En el análisis multivariante, la metástasis de los ganglios linfáticos, el consumo de alcohol y la expresión de XIAP (pre-quimioterapia) fueron factores de riesgo independientes para el pronóstico de los pacientes (Tabla 2)
A:. Control negativo con PBS en lugar del primer anticuerpo; B: baja expresión de XIAP (el porcentaje de tasa positiva & lt; 25%); C:. Alta expresión de XIAP (el porcentaje de tasa positiva & gt; 25%) guía empresas
R: En general la tasa de supervivencia de las puntuaciones de XIAP. Los pacientes cuyos tumores expresan altos niveles de XIAP generalmente tenían un peor pronóstico que aquellos pacientes cuyos tumores expresaron niveles bajos de XIAP en tejido de cáncer de pre-quimioterapia; B: tasa de supervivencia global por chemoresponse. Los pacientes cuyos tumores eran sensibles a la quimioterapia por lo general tenían un mejor pronóstico que aquellos pacientes cuyo tumor era resistente a la quimioterapia; C: XIAP decenas de muestras post-quimioterapia. los niveles de XIAP en muestras post-quimioterapia también se relacionaron significativamente con las tasas de supervivencia global de los pacientes.
nivel de expresión de XIAP se asoció con la respuesta a la quimioterapia de pacientes con CECC avanzada
Todos estos pacientes HNSCC avanzada había terminado un ciclo de quimioterapia. Entre ellos, 34 casos fueron la respuesta completa (RC) y la respuesta parcial (RP) a la quimioterapia y 26 casos fueron enfermedad progresiva (PD) y enfermedad estable (SD). Los pacientes cuyos tumores expresan altos niveles de XIAP fueron significativamente más resistentes a la quimioterapia con cisplatino y generalmente tuvieron respuestas de quimioterapia más pobres (
P
= 0,005, Tabla 1). XIAP niveles de expresión se incrementaron en gran medida en los tejidos HNSCC post-quimioterapia en comparación con las muestras de pre-quimioterapia (
P = 0,011
, Tabla 3). los niveles de XIAP en muestras post-quimioterapia también se relacionaron significativamente con las tasas de supervivencia global de estos pacientes (
P = 0,029
) (Figura 2), aunque en el análisis multivariante, que no era un factor independiente en relación con los pacientes 'resultados.
inhibición de la expresión de XIAP sensibilizado líneas celulares CECC a tratamiento con cisplatino
para investigar la relación casual de expresión XIAP y la respuesta a los fármacos de los pacientes, hemos utilizado siRNA para inhibir la expresión de XIAP en línea celular HNSCC CAL27 y WSU-HN13. Tres siRNAs fueron diseñados para inhibir la expresión de XIAP en células CAL27 y WSU-HN13, y entre ellos, el grupo de tratamiento siRNA1 obtuvieron reducción near70% de la expresión de ARNm de XIAP en células (Figura 3). En comparación con el grupo de control negativo, el valor IC50 de cisplatino en el grupo siRNA1 se redujo de 0,51 g /ml a 0,20 g /ml (
P
= 0,05, Figura 4) en CAL27 y de 4,32 a 1,82 g /ml en WSU -HN13.
la inhibición de la eficacia siRNA-1, siRNA-2 y siRNA-3 en la expresión de ARNm de XIAP se examinó en células CAL27 (superior) y de células WSU-HN13 (Baja) con PCR en tiempo real . grupo de tratamiento XIAP siRNA1 obtuvo cerca de 70% de reducción de la expresión de ARNm de XIAP en células.
XIAP siRNA-1 inhibe eficazmente la expresión de proteína XIAP en células WSU-HN13 CAL27 y (superior) y la disminución de el valor cisplatino IC50 de 0,51 mg /ml a 0,20 mg /ml en CAL27 y de 4,32 a 1,82 g /ml en WSU-HN13 (inferior).
Discusión
cisplatino basado quimioterapia neoadyuvante, cirugía y terapia de radiación que se utiliza debe ser considerado como el régimen estándar para los pacientes CECC avanzados de alto riesgo; Sin embargo, los efectos terapéuticos de la terapia neoadyuvante no son concluyentes debido a muchos ensayos aleatorios no mostrar una ventaja de supervivencia con el uso de la quimioterapia neoadyuvante [12], [13]. Aunque la administración indiscriminada de direcciones de quimioterapia neoadyuvante ningún beneficio para los pacientes resultados (tasa de supervivencia a cinco años fue 38.33% en nuestro estudio), encontramos aquellos pacientes que lograron una respuesta clínica tenía un pronóstico más favorable (p = 0,001, test log-rank ), que es coherente con algunos informes anteriores [12], [13]. Desde este punto de vista, la evaluación de cómo elegir selectivamente los pacientes que se beneficiarían positivamente de la quimioterapia neoadyuvante fue el factor decisivo para el éxito del tratamiento [4].
En este estudio, hemos encontrado una fuerte relación entre el nivel de expresión XIAP y la respuesta clínica y el pronóstico de los pacientes con HNSCC avanzada. XIAP baja expresión se correlaciona estrechamente con la respuesta a la quimioterapia y pronóstico favorable, mientras que la expresión de alto XIAP puede predecir el fracaso de la quimioterapia y los pobres resultados. Los resultados son coherentes con los informes anteriores que muestran que la baja regulación de XIAP sensibiliza a las células cancerosas a los fármacos terapéuticos en el cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de páncreas [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Es importante el descubrimiento de que la quimioterapia basada en cisplatino inducida en gran medida la expresión de XIAP en HNSCC avanzada. El nivel de XIAP mayor en las muestras post-quimioterapia también se asocia con un peor pronóstico de los pacientes. Nuestros resultados muestran que la expresión de XIAP es una causa principal del fracaso del tratamiento y la expresión de XIAP inducida por la quimioterapia dirigida a un mal pronóstico de los pacientes resistentes a los fármacos. pacientes negativos XIAP pre-seleccionados pueden beneficiarse del tratamiento neoadyuvante basada en cisplatino. Nuestros
in vitro
datos propuestos, además, un valor potencial de inhibir la expresión de XIAP para mejorar la eficacia de la quimioterapia.
Hay que señalar que, contrariamente a la mayoría de los estudios, se observó una asociación positiva entre el consumo de alcohol y la supervivencia global de los pacientes HNSCC avanzados en este estudio. Interesante, un resultado similar se ha publicado recientemente, que propuso las diferencias de nuestros datos y la tradición cultural podría ser causada por diferentes hábitos de consumo: los pacientes HNSCC avanzadas de China menudo bebía licor con una muy alta concentración de alcohol (generalmente & gt; 50%) , mientras que los occidentales suelen consumir bebidas con mucho menor concentración de alcohol. Tales altas concentraciones de alcohol pueden estimular la mucosa oral y destruir el equilibrio de bacterias, que influye en el curso de la enfermedad de HNSCCC avanzada [21]. No podemos excluir la posibilidad de tamaño limitado de la muestra y /u otros factores que pueden haber contribuido a esta observación.
Este estudio fue un estudio retrospectivo de casos y controles y tenía algunas limitaciones. En el presente estudio, se optó por IHC para evaluar la expresión de XIAP en lugar de algunos métodos cuantitativos primarios, debido a la falta de disponibilidad de tejidos de biopsias frescas. Aunque IHC es un método semi-cuantitativo, ahora es el protocolo rentable más sencilla y más utilizada en el trabajo clínico [22]. Además, la tasa de expresión de XIAP alta en las muestras antes de la quimioterapia fue sólo 20,83%, mientras que la tasa de respuesta a la quimioterapia (CR + PR) de los pacientes fue de 43,34%. Es más que probable que muchos factores pueden contribuir a la respuesta general de la droga en el CECC avanzada; XIAP expresión puede ser sólo uno de los muchos factores que intervienen.
Los resultados de este estudio tienen implicaciones clínicas potencialmente importantes. En primer lugar, nuestro estudio mostró, por primera vez que la expresión de XIAP se asocia con respuesta a la quimioterapia y puede usarse como un biomarcador para predecir los resultados clínicos de los pacientes HNSCC avanzadas, en particular a aquellos que han tenido tratamiento quimioterapéutico basado en cisplatino. En segundo lugar, la expresión de XIAP puede ser un biomarcador útil para seleccionar los pacientes que tienen la mayor probabilidad de beneficiarse de la quimioterapia neoadyuvante basada en cisplatino. Por último, la relación causal entre el nivel de expresión de XIAP y la respuesta a la quimioterapia indican que la baja regulación de XIAP podría ser una prometedora terapia adyuvante para pacientes con CECC avanzados.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital de la IX Asamblea Popular, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine y llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki. No se obtuvo el consentimiento informado (escrito o verbal) para el uso de muestras de tejido retrospectivos de los pacientes dentro de este estudio, muchos de los cuales habían fallecido, ya que el Comité de Ética, que renunció a la necesidad del consentimiento, no ha considerado necesario. Todas las muestras fueron anónimas.
Cell Cultura y
línea celular humana CECC CAL27, que era resistente al tratamiento con cisplatino, se obtuvo de la Colección Americana de células de tejido (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en DMEM (Gibco, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina. línea celular de WSU-HN13 [23] estaba dotado de la Universidad de la Facultad de Odontología de Maryland (Baltimore, MD, EE.UU.) y cultivadas en DMEM (Gibco, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), glutamina al 1%, y 1 % de penicilina-estreptomicina
pacientes y muestras de tumor
Sesenta pacientes con CECC avanzada. (estadio clínico III /Iva;.. UICC /AJCC 7 ed, 2010) fueron reclutados en este estudio. Todos los pacientes han aceptado la quimioterapia neoadyuvante basada en cisplatino seguida de resección radical del tumor en dos o tres semanas de completar la quimioterapia en el Departamento de Cirugía Oral y Maxilofacial, Hospital de la IX Asamblea Popular, Universidad Shanghai Jiao Tong de enero de 1999 a diciembre de 2004.
La respuesta clínica de la quimioterapia se evaluó no menos de 2 semanas después de la quimioterapia los pacientes completaron de acuerdo con los criterios de respuesta de evaluación en tumores sólidos (RECIST) [24]. A CR se definió como la desaparición completa de todas las lesiones medibles, sin la aparición de nuevas lesiones. Un PR se definió como una reducción en las lesiones medibles bidimensionalmente por al menos 50 por ciento de la suma de los productos de sus diámetros perpendiculares más grandes y una ausencia de progresión en otras lesiones, sin la aparición de nuevas lesiones. [9] SD se definió como una reducción en el volumen del tumor de menos de 50 por ciento o un aumento en el volumen de una o más lesiones medibles de menos de 25 por ciento, sin la aparición de nuevas lesiones. PD se definió como un aumento en el tamaño de al menos una lesión medible bidimensionalmente por al menos 25 por ciento y la aparición de nuevas lesiones. la información clínico-patológicas de los pacientes se presentan en la Tabla 4. Todos los pacientes fueron tratados con operaciones curativas estándar con margen de resección negativo. Todos los pacientes recibieron radioterapia postoperatoria dentro de los dos y seis semanas de completar la cirugía. La dosis total para el área del tumor primario y el cuello de ganglios positivos fue 6000cGy y para el tumor primario y el cuello de ganglios negativos era de 5000 cGy.
Análisis Western Blot
La proteína total se lisaron en 2 tampón de lisis que contiene × 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% w /v de SDS, y 24,75% de glicerol. 40 g de proteínas se separaron usando 12% SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de PVDF. Después de la incubación durante la noche con anticuerpo monoclonal de ratón-anti-humano XIAP (BD, EE.UU.) en una dilución de 1:4000 y una hora de incubación con IRDye 800CW de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (LI-COR, EE.UU.), la señal se digitaliza y se analizó utilizando el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences, EE.UU.). β-actina (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se utilizó como control interno.
-PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). 1 g wasreverse total de ARN transcrito en cDNA utilizando oligo-dT cebador y PrimeScript II RTase (Takara, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó con Thermal Cycler dados real Time System (Takara, Japón). Los cebadores para la PCR fueron diseñados con la versión 3.0 del software Primer Express® (Applied Biosystems, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores de XIAP fueron: 5'-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 'y 5'-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3'. El primer secuencias de β-actina fueron: 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 'y 5'-GGGCCGGACTCGTCATACT-3', y el primer secuencias de GAPDH fueron: 5'-AATTGAGCCCGCAGCCTCCC 3 'y 5'-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3'. Todos los cebadores fueron separados por al menos un intrón en el ADN genómico correspondiente. análisis de la curva de disociación se incluyó en todas las reacciones de excluir la multiplicación inespecífica. La cantidad relativa del nivel de ARNm de XIAP se calculó sobre la base de los métodos ΔΔCT estándar [25]. Tanto β-actina y GAPDH fueron utilizados como control interno.
siRNA desmontables
Tres anti-XIAP siRNAs cada uno para las dos variantes de empalme de XIAP y un control negativo marcado con FAM siRNA (no secuencia diana), se sintetizaron mediante GenePharma (Shanghai, china). Las secuencias fueron: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT y control negativo: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
La inmunohistoquímica
pre y post-quimioterapia bloques de parafina de tejidos representativos se cortaron en secciones de 5 micras para la tinción inmunohistoquímica estándar (IHC ). Después de la recuperación de antígeno inducida por calor en tampón de ácido cítrico (pH 7,0) durante 20 min y el bloqueo en suero de cabra al 5% durante 30 min, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano XIAP (BD, EE.UU.) a una dilución de 1: 100 a 4 ° C durante la noche. La omisión del anticuerpo primario sirve como control negativo. El anticuerpo unido se detecta mediante un sistema de Super detección sensible de IHC (BioGenex, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones se visualizaron con (Sigma EE.UU.) solución de diaminobenzidina tetrahidrocloruro y de contraste con hematoxilina de Harris. El resultado de la tinción se determinó contando 1000 células tumorales en tres 100 × campos de ampliación por dos patólogos independientes y, además clasificada como baja expresión (el porcentaje de tasa positiva & lt; 25%) y alta expresión (el porcentaje de tasa positiva ≥25%) .
Drogas sensibilidad del ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 × 10
3 células /pocillo y se incubaron durante 24 horas más. 6 h después de la transfección con el control negativo o siRNA, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco containingone de diluciones en serie de DDP durante otras 72 h, incluyendo un control negativo sin DDP. A continuación, 20 l de colorante MTT estéril (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-di-feniltetrazolio, 5 mg disueltos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato; Sigma, EE.UU.) se añadió a la medio de cultivo a una concentración final de 0,5 mg /ml y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Posteriormente, los cristales de formazan se solubilizaron con 150 l de sulfóxido de dimetilo para 10 min. absorbancia de espectrometría a 490 nm se midió con un lector de microplacas. Cada experimento se realizó por triplicado.
Análisis estadístico
El paquete de software SPSS 17,0 se utilizó para el análisis estadístico. Las frecuencias se compararon con la prueba exacta de Fisher, 2 × prueba de contingencia, o pruebas no paramétricas, según proceda. Se valoran las curvas de supervivencia y el tiempo transcurrido hasta la progresión utilizando el método de Kaplan-Meier y los comparó utilizando una prueba de log-rank de dos caras. regresiones logísticas múltiples que utilizan un modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para determinar si las características moleculares de los tumores predecían de forma independiente la supervivencia en nuestra cohorte de pacientes con CECC avanzados. P & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
.