Extracto
Anteriormente tres líneas de pez cebra transgénico de oncogenes con expresión inducible de
Xmrk
,
kras
o
Myc
en el hígado han sido generados y estas líneas transgénicas se desarrollan los tumores hepáticos por oncogenes adicto a la inducción química. En el presente estudio, se utilizaron enfoques transcriptómica comparativos para examinar la correlación de los tres tipos de cáncer de hígado transgénicos inducidos con cánceres de hígado humano. perfiles de ARN a partir de los tres tumores de pez cebra indicaron relativamente pequeñas superposiciones de genes desregulados significativamente y las vías biológicas. Sin embargo, las tres firmas tumorales transgénicas todos mostraron correlación significativa con carcinoma hepatocelular humano avanzado o muy avanzado (HCC). Curiosamente, la firma molecular de cada tumor en el hígado de pez cebra oncogén inducida correlacionada con sólo un pequeño subconjunto de las muestras de HCC humanos (24-29%) y no se conservaron hasta reguladas vías entre el pez cebra y se correlacionó subgrupo HCC humano. Los tres modelos de cáncer de hígado de pez cebra en conjunto representan casi la mitad (47,2%) de los HCC humanos, mientras que algunos HCC humanos mostraron correlación significativa con más de una firma definida por los tres tumores de pez cebra por oncogenes adicto. Por el contrario, desregulado comúnmente genes (21 y 16 hacia abajo) en los tres modelos de tumor de pez cebra en general mostraron desregulación accordant en la mayoría de los HCC humano, lo que sugiere que estos genes podrían estar desregulados más coherente en una amplia gama de los HCC humanos con diferentes mecanismos moleculares y así servir como marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas comunes. Por lo tanto, estos modelos de pez cebra transgénico con tumores inducidos por oncogenes bien definidos son herramientas valiosas para la clasificación molecular de los HCC humano y para la comprensión de los conductores moleculares en hepatocarcinogénesis en cada subgrupo humanos HCC
Visto:. Zheng W, Li Z , Nguyen AT, Li C, Emelyanov A, Gong Z (2014)
Xmrk
,
Kras
y
Myc
Modelos pez cebra transgénico cáncer de hígado Compartir Molecular firmas con subconjuntos de humana Carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 9 (3): e91179. doi: 10.1371 /journal.pone.0091179
Editor: Xiaolei Xu, de la Clínica Mayo, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Octubre, 2013; Aceptado: 9 Febrero 2014; Publicado: 14 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Investigación médica de Singapur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Zhiyuan Gong es actualmente un editor académico de PLoS ONE; esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Humano carcinoma hepatocelular (HCC) es conocido por ser una enfermedad muy heterogénea, especialmente en las fases intermedia y avanzada [1]. Debido a las etiologías diversas y complejas que contribuyen a la incidencia de CHC, diferentes mutaciones genéticas o vías moleculares alterados podrían ser responsables de hepatocarcinogénesis. Hasta ahora, varias vías cancerígenas se han identificado estar involucrado en el desarrollo y progresión de HCC, incluyendo el VEGFR, EGFR, y las vías de mTOR [2]. En un esfuerzo para descifrar el papel de las diferentes vías oncogénicas, se han establecido una serie de modelos de ratones transgénicos [3], [4] y el análisis de transcriptómica comparada han sido utilizados para identificar los mejores modelos de ratones transgénicos para los HCC humanos [4].
El pez cebra se ha reconocido cada vez más como un modelo experimental valioso para enfermedades humanas, en particular para los tipos de cáncer [5] incluyendo los cánceres de hígado [6] - [11]. Se ha demostrado que los tumores de pez cebra tenían sorprendentes similitudes con diagnóstico histológico de cáncer humano [12], [13]. Transcriptómica y análisis epigenéticos también han indicado las características conservadas del HCC pez cebra inducidos por carcinógenos con HCC humano [14] - [16]
Anteriormente hemos generado varios modelos de tumores de hígado por la expresión transgénica de tres oncogenes diferentes (
kras, Xmrk
o
Myc
) específicamente en el hígado de pez cebra y estos pez cebra transgénico normalmente producen tumores hepáticos con grados variables de gravedad, desde adenoma hepatocelular (CHC) a HCA [6] - [9]. Los tres oncogenes que se utilizó en el pez cebra, han demostrado estar involucrados en hepatocarcinogenesis.
KRAS
está mutado en ~ 7% de los cánceres de hígado en humanos [17], pero la señalización de Ras se activa de forma ubicua en HCC [18].
Xmrk
es una variante natural del EGFR en los peces del género
Xiphophorus gratis (platyfish y xifos) con autofosforilación constitutiva y la activación de señales aguas abajo [19]. Activación de la señal EGFR se correlaciona con mal pronóstico de los pacientes con HCC [20].
MYC
comúnmente se amplificó en muchos tipos de cáncer incluyendo HCC y más alto nivel de expresión de MYC está asociado con más avanzado estado de HCC [21]. Hemos demostrado que la sobreexpresión de
kras
y
Xmrk
en el hígado de pez cebra podría inducir HCC [7] - [9], mientras que la sobreexpresión de
Myc
inducida sobre todo HCA [ ,,,0],6]. analiza
transcriptómica comparativo de modelos animales y muestras clínicas humanas proporcionan una poderosa herramienta para la identificación de las vías moleculares conservados y los genes de biomarcadores para el diagnóstico y la terapia [15], [22]. Nuestros modelos de pez cebra transgénico de oncogenes existentes han definido sobre regulación de oncogén conductor y esto puede proporcionar una herramienta valiosa para identificar las fuerzas motrices moleculares en carcinogénesis humana mediante análisis comparativos de transcriptómica. Por lo tanto, en este estudio, hemos empleado la tecnología de secuenciación de ARN para comparar los perfiles transcriptomic de los tres tumores de hígado oncogén inducida en el pez cebra transgénico. Por análisis comparativos con transcriptomes de hígado humano a partir de hígados cirróticos a HCC muy avanzada, se encontró que todos ellos mostraron una correlación fuerte molecular con los HCC humanos avanzados o muy avanzadas. Sin embargo, existen muy distintas vías biológicas desregulados en base a los genes desregulados en los tres modelos transgénicos de oncogenes. Curiosamente, cada modelo de tumor de hígado de pez cebra correlacionado con un subconjunto de los HCC humano y cada subconjunto tiene algunas características moleculares distintas. Hemos demostrado que los modelos de pez cebra transgénico con la actividad del conductor-gen bien definida deben ser valiosos para la clasificación de los HCC humano y para la comprensión de los mecanismos moleculares detrás de cada subtipo de HCC.
Materiales y Métodos
Tratamiento y la inducción de cáncer de hígado en los modelos de tres pez cebra transgénico
el pez cebra se mantuvieron siguiendo el protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Nacional de Singapur (Protocolo 079/07). La generación de
Xmrk
y
Myc
pez cebra transgénico se ha descrito anteriormente y se les denomina como
A (Xmrk)
[9] y
A (Myc)
[6], respectivamente, en las publicaciones anteriores. Las dos líneas transgénicas fueron construidos mediante el uso de un sistema transgénico inducible por tetraciclina y de la expresión de oncogenes fueron inducidos por la doxiciclina. El
kras
V12
línea transgénica utilizada en el presente estudio fue recientemente generado mediante el uso de un sistema inducible por mifepristona [7] en combinación con un sistema Cre-loxP (sin publicar). Para el
Xmrk
y
Myc
líneas transgénicas, los peces transgénicos y sus hermanos no transgénicos fueron tratados con 60 mg /ml de doxiciclina (Sigma, EE.UU.) a partir de 3,5 MPF (mes después de la fecundación) durante 6 semanas. Todos los
Xmrk
peces desarrollado HCC y todos
Myc
peces desarrollaron HCA. En total, para cada línea transgénica, una muestra de tumor (peces transgénicos tratados con doxiciclina) y tres muestras de control (hermanos no transgénicos tratados de forma similar con doxiciclina, hermanos transgénicos sin tratamiento doxiciclina, y sus hermanos no transgénicos sin tratamiento doxiciclina) se recogieron para secuenciación de RNA. En todos los casos, las muestras de hígado utilizados para la secuenciación de ARN se agruparon de cuatro a cinco pez macho. Para el
kras
V12
peces transgénicos, los peces transgénicos de un mes de edad fueron tratados con 1 mM mifepristona (Sigma, EE.UU.) durante 36 horas para inducir la recombinación mediada por Cre para la activación de
kras
V12
la expresión del transgen en el hígado. El
kras
V12
activado peces transgénicos a continuación, se dejaron crecer durante seis meses para desarrollar muestras de HCC HCC y se recogieron para la secuenciación del ARN. Tres tumores en el hígado de los peces transgénicos inducida y tres hígados normales de peces transgénicos no inducidos se agruparon por separado como muestras de tumores y de control. Todas las muestras utilizadas eran de peces machos y se utilizaron dos conjuntos de réplicas biológicas.
Identificación de las listas de genes de la firma en cada cáncer de hígado modelo de pez cebra
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU. ) y se trató con DNasa I para eliminar la contaminación de ADN genómico. 3 'de ARN-SAGE (análisis en serie de la expresión génica) secuenciación se realizó en plataforma sólida ABI por Misión Biotech (Taiwan) según el protocolo del fabricante y 10-23 million lee se genera a partir de cada toma de muestras (Tabla S1). Brevemente, el ARNm se purificó utilizando Dynabeads Oligo (dT) Ecop (Invitrogen) y se sometió a síntesis de ADNc. Resultante de ADNc se digirió con NlaIII y EcoP15I para dar lugar a una etiqueta de 27 nucleótidos de ADNc entre los dos adaptadores de secuenciación. Las etiquetas fueron asignadas a la NCBI RefSeq (secuencia de referencia) base de datos de ARNm para el pez cebra con un criterio de lo que permite un máximo de 2 nucleótidos desajustes. Todos los datos de RNA-Seq se presentaron a la Expresión Génica Omnibus base de datos con los siguientes números de acceso: GSE53342 para
Xmrk
y
Myc
datos y GSE53630 de
KRAS
datos. el recuento de etiquetas para cada transcripción se normalizaron a TPM (transcripciones por millón) para facilitar la comparación entre las diferentes muestras. Los genes regulados diferencialmente en el
Myc CD - y
Xmrk CD - cánceres de hígado inducidos se identificaron utilizando una muestra de t-test como se describe anteriormente [23], y los genes expresados diferencialmente en el
kras
cáncer de hígado inducida se identificó utilizando la prueba t de Student de dos colas.
para facilitar implicaciones funcionales del transcriptoma pez cebra, todos los genes de pez cebra fueron asignadas a los genes humanos anotados con el fin de utilizar el software en línea existente desarrollado en los genes humanos. Por lo tanto, la cartografía de homología humana de Unigene grupos de pez cebra fueron recuperados del Instituto del Genoma de Singapur pez cebra anotación de base de datos (http://123.136.65.67/). Para Unigene grupos mapeadas por más de un entradas de transcripción, la más alta TPM se utiliza para representar el nivel de expresión del grupo Unigene. Algunos Unigene grupos de pez cebra fueron asignadas a Unigene grupos más de un humano, que generalmente provenían de la misma familia de genes. Para eliminar la redundancia y no causar un prejuicio en los análisis funcionales, sólo se ha seleccionado el primer grupo Unigene humano en la lista para representar los Unigene grupos de pez cebra. Las listas de genes de pez cebra significativamente hasta regulados que fueron mapeados con homólogos humanos y utilizados para analyese comparativa con los datos de HCC humanos se muestran en la Tabla S2.
Gene Conjunto de Análisis de enriquecimiento (GSEA)
GSEA se utilizó para establecer la relación entre los modelos de pez cebra transgénico y el cáncer de hígado humano [24]. GSEA es un método de cálculo que determina si un
priori
conjunto definido de genes muestra diferencias estadísticamente significativas, concordantes entre dos muestras biológicas; se calcula una puntuación de enriquecimiento mediante una estadística de suma en ejecución a través de una lista clasificada de conjunto de datos de expresión génica. homólogos humanos de los genes regulados significativamente arriba de los tejidos tumorales de pez cebra fueron utilizados como firmas de cáncer para cada modelo de pez cebra transgénico para la comparación con los datos de transcriptómica HCC humanos. Cada fenotipo elegido de los HCC humanos (ya sea una etapa HCC específico o una muestra HCC particular) se comparó con el resto de las muestras en el mismo conjunto de datos. Todos los genes en el fenotipo seleccionado se clasificaron por la prueba t para determinar las diferencias de expresión entre diferentes etapas de HCC o diferentes muestras de HCC. La puntuación de enriquecimiento de la firma cáncer de pez cebra transgénico predefinido se calculó utilizando una estadística funcionamiento de suma a través de los genes clasificados. La significación estadística de la puntuación de enriquecimiento se calculó mediante el uso de un procedimiento de prueba de permutación basada en fenotipo empírica. Un valor (tasa de falso descubrimiento) FDR fue proporcionada por la introducción de un ajuste de múltiples pruebas de hipótesis. transcriptome datos de cáncer de hígado humano fueron recuperados de la base de datos de expresión de genes de Omnibus (GEO). El conjunto de datos humano, incluyendo las diferentes etapas de los HCC utilizados en la comparación fue GSE6764 [25]. Los diez conjuntos de datos de HCC humanos utilizados para examinar la representación de firmas de genes del cáncer de hígado de pez cebra se resumen en la Tabla S3. anotación de información se recupera de FUENTE (http://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch). Para múltiples sondas que se pueden asignar a un grupo Unigene, se seleccionó la intensidad máxima de la señal para representar el nivel de expresión del grupo Unigene.
GSEA Pre-Análisis clasificado
GSEA opción de pre-clasificados se utilizó para analizar las vías desreguladas en cada modelo de pez cebra transgénico y subgrupos de los HCC humanos. En pocas palabras, todo el transcriptoma fue clasificado por logaritmo transformado p-valor (en base 10). Los genes regulados se les dio valores positivos, y las reguladas por los genes valores negativos. Se utilizaron las vías canónicas curada de la MSigDB (base de datos de firma molecular). El número de permutación usado fue 1000.
RT-qPCR validación
RNA total se transcribe inversamente usando el kit Superscript II de síntesis de ADNc (Invitrogen). RT-qPCR se realizó con los mismos conjuntos de ADNc utilizadas para la secuenciación SAGE usando el sistema I Master SYBR Green LightCycler 480 (Roche). Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado para cada muestra de ADNc y secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S4. los niveles de expresión de genes en cada control o muestra de hígado transgénico se normalizaron con el nivel de
β-actina mRNA
como el control interno. El registro
2 veces los cambios entre las muestras tumorales y de control se calcularon utilizando el método de CT según la fórmula: log
2 veces cambia = -ΔΔCT = - [(CT gen de interés-CT
β-actina
) muestra- transgénicos (CT gen de interés CT-β-actina) muestra de control]. De dos colas la prueba t heterocedástico se realizó utilizando los valores normalizados de TC (CT gen - CT β-actina) y los cambios con p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Identificación de los expresados diferencialmente. los genes en los tres modelos pez cebra transgénico cáncer de hígado
las tres líneas transgénicas de oncogenes (
Xmrk, Myc
y
kras
V12
) fueron inducidos a desarrollar tumores hepáticos ( Figura S1) y estas muestras de tumores fueron sometidos a secuenciación de RNA-SAGE. Por un criterio de selección de pliegue cambio & gt; 1,5; valor de P & lt; 0,05 y TPM & gt; 10 (en cualquiera de las muestras tumorales de control o), los genes expresados diferencialmente fueron seleccionados de las tres series de tumores. Había 2.892, 797 y 494 genes regulados y 169, 902 y 676 genes regulados en el
Xmrk CD -,
kras CD - y
Myc CD - inducido cáncer de hígado de pez cebra, respectivamente (Figura 1A, B). genes desregulados de los tres modelos transgénicos mostraron relativamente pequeños solapamientos, lo que indica que los tres oncogenes regulados conjuntos bastante distintas de genes. Esto es consistente con el informe de que el tipo de cáncer morfológicamente uniforme con frecuencia se clasifican en diferentes subgrupos en base a sus distintos patrones de expresión de genes [26]. Curiosamente, había 21 arriba-regulados y 16 genes regulados encuentran comúnmente en los tres modelos de tumores (Figura 1A, B, Tabla 1).
(A) Diagrama de Venn de los genes regulados hasta en el tres de pez cebra modelos de HCC transgénicos. (B) del diagrama de Venn reguladas por los genes en los tres modelos de HCC transgénicas de pez cebra. (C) las vías desregulado en los tres tumores hepáticos transgénicos oncogenes. Hacia arriba y hacia abajo las vías reguladas en cada modelo de pez cebra transgénico HCC fueron analizados por análisis de pre-clasificados GSEA. Rojo y verde indican hacia arriba y hacia abajo-regulación, respectivamente, y el código de color basado en el FDR se muestra a la izquierda. Vías correlacionan con células grises no se detectaron con cualquier cambio. Las vías hasta reguladas fueron asignados en siete categorías distintivas del cáncer (excluyendo permitiendo la inmortalidad replicativa) según Hanahan y Weinberg [27] y hacia abajo-regulados vías se clasifican en función de diferentes aspectos del metabolismo del hígado (véase el cuadro S1 para más detalles).
distintas vías reguladas en los modelos de tumores de hígado de pez cebra tres
Pathway análisis utilizando GSEA mostró que los tres modelos de cáncer de hígado transgénicos tienen diferentes vías desreguladas (Figura 1C, el cuadro S5) . Ha sido ampliamente aceptado que hay ocho sellos distintivos de cáncer para la tumorigénesis de varios pasos y las complejidades de las neoplasias [27], [28]. Se encontró que las vías identificadas-GSEA caído en al menos siete sellos distintivos de cáncer (a excepción de que permite la inmortalidad replicativa).
Xmrk
principalmente hasta reguladas vías implicadas en la evasión de supresores del crecimiento y evitar la destrucción inmune, que incluyó la activación de ciclo celular, que promueven la transcripción del ARN, hasta la regulación del proteasoma y alterar las propiedades inmunológicas.
Kras
proporcionado las células del tumor con la capacidad de las señales proliferativas autosostenibles por hasta la regulación de EGFR, Raf-MEK-ERK, y GSK3 vías de señalización de mTOR PI3K-AKT. En concreto, sino que también alteró los caracteres adhesivas focales de células tumorales que podrían activar la invasión y la metástasis.
Myc
principalmente hasta reguladas traducción y la proteolisis para ayudar a las células tumorales para evadir los supresores de crecimiento, y también hasta regulada vía de VEGF, por tanto, potencialmente inducir la angiogénesis. Si bien no hubo una sola vía significativamente hasta reguladas en los tres modelos de tumores, hubo algunas vías hasta reguladas en dos modelos, como el proteasoma en el
Xmrk
y
Myc
modelos, y vía IGF1, vía mTOR, la biosíntesis de ARNt y adhesión focal en los
Xmrk
y
KRAS y modelos. Por el contrario, en las vías de la reprogramación del metabolismo energético en general se redujeron regulado en los tres modelos, aunque la baja regulación en el
Myc
modelo fue menos evidente que los otros dos modelos. Mientras tanto, muchas otras vías de señalización implicadas en la función normal del hígado tales como los factores de la sangre, el metabolismo de aminoácidos, la desintoxicación y el metabolismo de xenobióticos, metabolismo de los ácidos grasos y la síntesis de bilis fueron uniformemente regulados hacia abajo en los tres modelos de tumor. Sin embargo, una excepción fue la regulación hormonal que era al parecer hasta reguladas en los
KRAS
tumores.
Correlación de los tres genes de pez cebra Firmas de tumores de hígado con diferentes etapas de los HCC humanos
los genes regulados, 2.892, 797 y 494 de
Xmrk
,
kras
y
Myc
tumores, respectivamente, fueron utilizados como los genes de firma para cada modelo. Estos genes regulados se convirtieron a 1.362, 490, y 146, respectivamente Unigenes humana con el fin de comparar con los datos disponibles de estudios de transcriptómica humanos. Por último, comparamos los conjuntos de genes de tres firmas con un conjunto de datos de transcriptómica humanos (GSE6764) de diferentes etapas de las condiciones de hígado humano: hígado cirrótico, nódulos bajo displásicas grado (LGDN), nódulos displásicos de alto grado (HGDN), y muy temprano, temprano , avanzado y muy avanzado HCC (veHCC, EHCC, AHCC y VAHCC), en el que las etapas de HCC patológicos han sido definidos por el tamaño del tumor, estado de diferenciación y el nivel de metástasis [25]. Los tres conjuntos de genes de la firma eran todos hasta reguladas conforme avanza la enfermedad, pero comenzaron a ser de hasta reguladas en diferentes etapas de la tumorigénesis (Figura 2). El
Xmrk
firma mostró una correlación positiva con los HCC partir de EHCC, y se correlacionó significativamente con AHCC y VAHCC. El
kras
firma correlacionó positivamente con AHCC y VAHCC, y que sólo se correlacionó significativamente con VAHCC. El
Myc
firma mostraron correlación significativa positiva con los HCC partir de EHCC, similar con nuestro resultado anterior utilizando un conjunto independiente de datos de RNA-seq de la misma línea transgénica [6]. Curiosamente, los 21 genes comunes hasta reguladas en los tres modelos de tumores también mostraron sobre regulación incluso desde una etapa muy temprana del CHC, lo que indica que estos genes están relacionados con todo el proceso neoplásico.
El gen en marcha regulada firmas de los tres tumores transgénicos (Xmrk, KRAS y Myc) y 21 genes comúnmente hasta reguladas (comunes) se utilizaron para la GSEA y Ness (enriquecimiento normalizado puntuaciones (eje y) se representan frente a las diferentes etapas de los HCC humanos (eje x .) NES aparece en la tabla y el asterisco indica significación estadística: FDR & lt; 0,25 Abreviaturas:. CL, hígados cirróticos; LGDN, nódulos bajo displásicas grado; HGDN, nódulos displásicos de alto grado; veHCC, muy temprano HCC; EHCC, HCC precoz; AHCC, CHC avanzado;. VAHCC, HCC muy avanzada
Representación de los tres genes de pez cebra Firmas de tumores hepáticos en muestras de HCC humanos
Teniendo en cuenta las vías distintivos alterados en los tres hígado de pez cebra modelos de tumores y el alto nivel de heterogeneidad en los pacientes con HCC humanos, hemos tratado de examinar el grado de representación de los tres modelos de cáncer de hígado de pez cebra en muestras de HCC humanos. Examinamos diez conjuntos de datos de microarrays HCC clínicos publicados, cada uno de los cuales incluían al menos 80 muestras clínicas. Los diez conjuntos de datos contienen un total de 1.272 muestras que abarcan diferentes grupos étnicos y los factores de riesgo (Tabla S2). Se encontró que el
Xmrk
,
kras
y
Myc
firmas de genes se correlacionaron significativamente con el 30.8%, 24.8% y 25.6% de todas las muestras clínicas, respectivamente. 47,2% de las muestras de HCC humanos tuvo correlación significativa con al menos una de las tres firmas de genes de pez cebra (Tabla 2, Figura S2). En diferentes conjuntos de datos de HCC humanos, los intervalos de porcentaje de 22,0% a 60,4%. Por otra parte, algunas de las muestras clínicas se correlacionaron con dos o incluso tres firmas de genes de pez cebra. Co-correlación de dos firmas de genes, es decir,
Xmrk
/
kras
,
kras
/
Myc
y
kras
/
Myc, España representó el 17,5%, 13,5% y 12,4% de las muestras de HCC humanos. 9,3% de las muestras humanos mostró co-correlación de todas las tres firmas de genes. Por lo tanto, parece que los tres modelos de tumores de hígado de pez cebra transgénico representan mecanismos moleculares de hepatocarcinogénesis en casi la mitad de los casos de HCC humanos y la otra mitad de HCC humano pueden deberse a mecanismos moleculares diferentes.
además, demostró que los subconjuntos de los HCC humanos que mostraron una correlación positiva significativa con la misma firma gen también compartidos vías hasta reguladas similares (Figura 3, Tabla S6). Para este análisis, cada uno de los conjuntos de HCC humanos se separó en dos subgrupos: los que muestran una correlación significativa con una de las firmas de pez cebra, y el resto. genes expresados diferencialmente entre los dos grupos fueron identificados por la prueba t de dos colas, y los análisis se realizaron por vía de análisis pre-clasificados GSEA. Las vías fueron sometidos a la agrupación jerárquica por FDR valores logarítmicos transformados utilizando MeV [29], [30]. Como se muestra en la figura 3, las vías diferencialmente regulados en los HCC humanos que mostraron correlación significativa con una de las firmas de pez cebra tenían patrones distintos. El cluster vía A está formado por las vías hasta reguladas en todos los tres subgrupos, incluyendo proteasoma, la biosíntesis de ARNt y la fosforilación oxidativa. Ribosoma, la transcripción y la traducción, y el ciclo celular también fueron altamente hasta reguladas, lo que sugiere que las muestras de HCC humanos correlacionó significativamente con cualquiera de las firmas de pez cebra fueron probablemente más proliferativa que los que no se correlacionó de manera significativa. El cluster vía B contiene vías reguladas en la mayoría de los subgrupos asociados con
Xmrk
pero hasta reguladas en los subgrupos asociados con
kras
y
Myc
. Curiosamente, tesis vías fueron consistentes con las vías altamente abajo-regulada en el
Xmrk
inducida HCC pez cebra, incluyendo el metabolismo de la energía, el metabolismo de aminoácidos, metabolismo de ácidos grasos, la biosíntesis de ácidos biliares, la ruta del complemento, la biosíntesis de esteroides, y N-glicano biosíntesis. El cluster vía C es más hasta reguladas en los
kras
-asociado subgrupos HCC, incluyendo el metabolismo del glutamato y de la glucólisis. Se ha informado de que
Kras
podría aumentar la conversión de glucosa a glutamato, y esto era esencial para
Kras
tumorigenicidad mediada [31]. El cluster vía D fue en general hasta reguladas en el
Xmrk CD - y
kras
-correlated HCC humano, pero mostró un patrón desigual en los
Myc
-correlated los HCC humanos . Este cúmulo contenía muchos quinasa vías que fueron desregulados en el
Xmrk CD - y
kras
inducida por el cáncer de hígado de pez cebra, pero no cambió significativamente en el
Myc
inducida por el hígado del pez cebra cáncer. El cluster vía E era bastante heterogénea. El cluster vía F fue bien separada de todas las demás y que contenía las vías que fueron en su mayoría las reguladas en todos los subgrupos de HCC humanos asociados con las firmas de pez cebra, incluyendo el linaje de células hematopoyéticas, vía de citoquinas, la señalización de calcio, y la trayectoria de GPCR. Dado que la mayoría de estas vías hacia abajo regulados están implicados en la respuesta inflamatoria, es probable que los subgrupos de los HCC humanos no capturados por los tres modelos de pez cebra tienen estado inflamatorio más graves.
Las barras de color representan el logaritmo transformadas FDR valores. Hasta reguladas vías se dan valores positivos (rojo) y las vías-regulado por los valores negativos (verde). Pathways correlacionan con células grises no se detectan en los análisis de la vía. Vías, ya sea con FDR = 1 o no se detecta en más de cinco de las 30 combinaciones están pre-excluidos del análisis.
Los genes comúnmente regulados por abajo hacia arriba y en tumores de hígado de pez cebra son también consistentemente arriba y hacia abajo regulados en los HCC humanos
Mientras que las tres firmas de genes representan la sobre regulación de las vías distintas y en correlación con los diferentes subgrupos de los HCC humano, tratamos de investigar si el 21 comúnmente regulados hacia arriba y 16 genes comúnmente regulados hacia abajo en los tres modelos transgénicos serían regulados de manera similar en los HCC humanos. Entre los diez conjuntos de datos de HCC humanos hemos utilizado, hemos sido capaces de examinar dos conjuntos de datos que incluían tanto los HCC y sus tejidos no tumorales correspondientes (GSE14520 y GSE25097). Sin embargo, sólo GSE14520 podría compararse con los datos de pez cebra como la mayoría de los genes humanos homólogos a los genes de pez cebra comunes podrían ser identificados a partir de la plataforma de microarrays utilizados: 19 de los 21 genes regulados (excepto
FOXA3 Opiniones y
MRPS9
) y 12 de los 16 genes regulados (a excepción de
cyp2ad2
,
slco1d1
,
TDH
y
MIOX)
. GSE14520 conjunto de datos contiene 229 HCC primarios y los tejidos hepáticos no tumorales emparejado correspondientes [32], [33]. El
Xmrk
,
kras
y
Myc
firmas se correlacionaron significativamente con 30.5%, 20.0% y 20.5% de las muestras de HCC, y en total el 47,6% de la muestras de HCC mostraron importantes sobre regulación de al menos una de las firmas de cáncer de hígado de pez cebra (Tabla 2). Entre los 19 hasta los genes regulados, 16 de ellos fueron hasta reguladas en más de la mitad de los pacientes con HCC, y 9 de ellos eran de hasta regulado en más del 75% de los pacientes (Figura 4).
STMN1
fue hasta reguladas en el 96,9% de los HCC humanos del conjunto de datos, que es la más ubicua hasta reguladas.
STT3A
y
SRP14
fueron hasta reguladas en el 93,0% de los HCC humanos. Entre los 12 genes regulados hacia abajo, 11 de ellos se redujeron regulado en más de la mitad de los pacientes con HCC.
FBP1
se había reducido regulado en el 96,9% de los HCC humanos examinados. FBP1 es una enzima reguladora de la gluconeogénesis y funciona para antagonizar la glucólisis en el cáncer gástrico [34].
FBP1
es el regulado en la mayoría de los HCC humanos por metilación [35]. Restauración de expresión FBP1 en líneas celulares de HCC humanos crecimiento celular significativamente inhibido, lo que sugiere que podría funcionar como un supresor tumoral [35].
19 de los genes regulados y 12 de las reguladas por los genes fueron identificados en la plataforma de microarrays. El color rojo indica la regulación, y el color verde indica que la baja regulación.
Por último, la expresión de estos 19 arriba y 16 genes regulados también fue validado por RT-qPCR en todo tres tipos diferentes de tumores. Como se muestra en la figura S3, la mayoría de los genes en la mayoría de las pruebas (~ 90%) confirmó tendencia consistente de cambios en las muestras tumorales.
Discusión
Es bien sabido que los HCC humanos son muy heterogéneas; por lo tanto, las especies cruzadas estudios comparativos a nivel transcriptómica deben ser valiosa para identificar las vías conservadas y críticos en la carcinogénesis en especies de vertebrados. Aquí primero se determinó vías desreguladas de cada uno de los modelo de pez cebra transgénico oncogén. A pesar de que los tres modelos tumorales transgénicas tenían muy distintas vías biológicas desregulados, todos ellos correlacionados con los HCC avanzada o muy avanzada en comparación con los genes de las firmas de los HCC humanos. Por otra parte, también se encontró que cada uno de los modelo de pez cebra representan un subconjunto de los HCC humano. Desde nuestros líneas transgénicas de oncogenes han bien definido vías de conducción en la carcinogénesis, la información de la pez cebra transgénico debe ser valioso para comprender los principales mecanismos moleculares de cada subgrupo HCC, que es imperativo para el desarrollo de terapias más eficaces específicas para cada subgrupo. Curiosamente, nuestros tres modelos de pez cebra transgénico de oncogenes representan significativamente menos de la mitad de la HCC humano y hay una necesidad de desarrollar más y diferentes modelos de animales transgénicos de oncogenes para cubrir los HCC más humanos para una mayor comprensión de los mecanismos moleculares distintos en hepatocarcinogénesis, con especial atención a las vías inflamatorias.
en el presente estudio, también identificó una lista de genes desregulados comúnmente en los tumores hepáticos inducidos por diferentes señales oncogénicas fue identificado y sus cambios en expresivas muestras de HCC humanos fueron validados
in silico
(Tabla 1, Figura 4). Estos genes se podrían servir como potenciales dianas terapéuticas, ya que eran independientes de las vías oncogénicas individuales. Los genes regulados incluyen los de la traducción de proteínas y procesamiento (
eif5a2
,
ABCE1
,
rrp9
,
srp14
,
itm1 <