Extracto
YAP es un componente clave de la vía de señalización de Hipona y juega un papel crítico en el desarrollo y progresión de múltiples tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario. Sin embargo, los efectos de YAP en el desarrollo del cáncer de ovario
in vivo
y sus efectores abajo siguen siendo inciertas. En este estudio se encontró que la expresión fuerte YAP se asoció con la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario pobres. En concreto, hemos demostrado por primera vez que los niveles de expresión alta de YAP se correlacionaron positivamente con la expresión de genes TEAD4, y su co-expresión fue un marcador pronóstico de supervivencia de los pobres cáncer de ovario. Hiperactivación de YAP mediante la mutación de sus cinco sitios de fosforilación inhibitoria (YAP-5SA) aumento de la proliferación de células de cáncer de ovario, la resistencia a fármacos quimioterapéuticos, la migración celular y el crecimiento independiente de anclaje. En cambio, la expresión de un mutante dominante negativo YAP invierte estos fenotipos en las células de cáncer de ovario tanto
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados sugieren que YAP produjo estos efectos mediante la promoción de una transición epitelio-mesenquimal. Por lo tanto, YAP promueve el crecimiento celular del cáncer ovárico y la tumorigénesis tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, alta YAP y expresión TEAD4 es un marcador pronóstico de la progresión del cáncer de ovario y un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer de ovario
Visto:. Xia Y, Chang T, Wang Y, Liu Y, Li W, Li M, et al. (2014) YAP Promueve la célula cáncer de ovario Tumorigénesis y es indicativo de un mal pronóstico del cáncer de ovario pacientes. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10.1371 /journal.pone.0091770
Editor: Hongmei Wang, del Instituto de Zoología de la Academia de Ciencias de China, China
Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: 14 Febrero 2014; Publicado: 12 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Xia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172473), el Programa Nacional de Investigación básica de China (2011CB944504, 2012CB944403) y básica Científica Financiación de la Investigación de la Universidad de Zhejiang (2011QN81001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epiteliales cánceres de ovario (COE) que suponen la mayoría de los tumores malignos de ovario en mujeres adultas y tienen el peor pronóstico entre los cánceres femeninos en base a sus tasas de supervivencia a 5 años. Estos pacientes a menudo se presentan con síntomas abdominales o pélvicas no específicos. Los tratamientos convencionales incluyen generalmente la cirugía, el platino y quimioterapias con taxol, y la terapia de radiación. Debido a la falta de síntomas específicos y métodos eficaces de detección, los pacientes a menudo son diagnosticados cuando en una etapa avanzada y su pronóstico es aún peor que con otros tipos de cáncer
.
La vía Hippo es una vía de transducción de señales recientemente descubierto. Los componentes de la base de la vía de Hipona, incluyendo MST1 /2, LATS, Guardar1, y YAP, están muy conservadas de la mosca de la fruta (
Drosophila
) a los mamíferos [1] - [6]. MST1 /2 activación da como resultado la fosforilación y la activación de sus sustratos directos LATS1 /2. Activado LATS1 /2, a su vez, fosforila e inhiben YAP y TAZ transcripción co-activador [7], [8]. YAP promueve la proliferación celular, inhibe la apoptosis celular, y también promueve una transición epidérmico-mesenquimal (EMT) [9] - [12]. YAP está estrechamente asociada con la tumorigénesis como una transcripción co-activador crítico en la vía Hippo.
varios factores de transcripción, incluyendo ErbB4, RUNX2, miembros de la familia Tead, y p73, se han encontrado para ser YAP diana aguas abajo genes [ ,,,0],13] - [16]. Debido a que carece de un dominio de unión a ADN, YAP une a la región C-terminal de TEAD con el fin de regular la transcripción y la traducción genes aguas abajo. Zhao
et al
identificados de la familia Tead factores de transcripción como los objetivos de YAP más potentes y miembros de la familia Tead eran importantes para la función promotora del crecimiento de YAP [14], [17] - [21].
estudios anteriores mostraron que YAP fue altamente expresado en tejidos de cáncer de ovario humano y que la actividad de alta YAP promovió la proliferación y supervivencia de las células cultivadas de cáncer de ovario [9], [22]. Sin embargo, el papel de YAP en el desarrollo del cáncer de ovario
in vivo
y la asociación de YAP /Tead supervivencia de los pacientes con cáncer de ovario no se han investigado a fondo.
En este estudio muestran que YAP continua la activación induce un aumento proliferación de células de cáncer de ovario, la resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino celular, pérdida de inhibición por contacto, el aumento de la migración celular y el crecimiento independiente de anclaje tanto
in vitro
y
in vivo
. De acuerdo con estos resultados, también se encontró que la expresión de alto YAP se asoció con la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario pobres. Además, miembros de la familia Tead también se expresaron en tejidos de cáncer de ovario. Curiosamente, la expresión YAP se correlacionó positivamente con la expresión TEAD4 y su co-expresión está estrechamente asociada con la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario pobres. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que YAP es un oncogén clave cáncer de ovario y que YAP /TEAD4 co-expresión puede ser un predictor de mal pronóstico para el cáncer de ovario humano.
Materiales y Métodos
xenoinjertos de ratones desnudos y
en Vivo
tratamientos
los ratones desnudos se obtuvieron del Centro de Animales experimentales de la Universidad de Zhejiang.
los ratones fueron tratados de acuerdo con la Guía del NIH para el cuidado y uso de Animales de laboratorio, aprobado por el comité de ética de la Universidad de Zhejiang. Los animales fueron alojados en una habitación con temperatura controlada, con ciclos de luz-oscuridad adecuados, alimentados con una dieta regular, y se mantuvieron bajo el cuidado de la Unidad de Animales de Laboratorio de la Universidad de Zhejiang, China. Los ratones trasplantados con células de cáncer de ovario se examinined diaria, y se sacrificaron mediante inhalación de CO2 método antes de ser sacrificado. Para examinar los efectos de la actividad sobre los tumores YAP
in vivo
, líneas celulares estables que expresaban YAP-5SA o negativo dominante YAP se cultivaron y se usaron para inducir tumores mediante la implantación de 2 × 10
6 células en 100 l de PBS por vía subcutánea en los flancos abdominales rectos de 4-6 semanas de edad ratones desnudos femeninos. Para determinar si YAP tiene efecto sobre la quimio-resistencia, las células A2780CP YAP-5SA-? C y las células de control (2 × 10
6 células por ratón en cada grupo) se inocularon por separado (s.c.) en ratones desnudos. Después de tumores crecieron a aproximadamente 5 mm de diámetro, 3,5 mg /peso corporal (kg) /día de CDDP se administró (i.p.) a los ratones desnudos una vez a la semana durante 4 semanas. tamaños tumorales (ambos anchos longitudinales y transversales) se midieron con un calibrador.
array de tejidos y análisis IHC
Fijado en formol y se obtuvo matriz de tejido de cáncer de ovario en parafina procedentes de Estados Unidos Biomax, Inc . (Rockville, MD). El microarray de tejido fue teñido inmunohistoquímicamente para YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 fosforilada-YAP (# 4911S, Señalización Celular), TEAD1 (5178-1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, vida útil Biosciences), TEAD3 (LS -C30406, vida útil Biosciences), y TEAD4 (ab97460, Abcam). Además, 45 muestras de cáncer de ovario humano para el seguimiento del paciente son del Departamento de Patología, Hospital Xijing de la Cuarta Universidad Médica Militar. El uso de muestras de cáncer de ovario y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Xijing, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
Todo el marcador final de cada muestra (negativo o positivo) se obtuvieron de forma independiente por dos patólogos y se evaluó mediante la adición de las puntuaciones de la intensidad y extensión de la tinción. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (negativo), 1 (débil), o 2 (fuerte). El grado de tinción se obtuvo sobre la base del porcentaje de células tumorales positivas: 0 (negativo), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), y 3 (61% -100%). Cada caso fue finalmente considera negativa si el resultado final fue de 0 (negativo) o 1 (débil positivo) y positiva si el resultado final fue de 2 a 3 (+) o de 4 a 5 (positivo fuerte).
Cell líneas
Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se adquirieron originalmente de la ATCC. Todos los medios de cultivo de células eran de Invitrogen. SKOV-3 células fueron cultivadas en medio 5A de McCoy con 10% de FBS. células A2780 se cultivaron en medio DMEM de alta glucosa suplementado con 10% de FBS y una solución de penicilina-estreptomicina al 1%. células OVCAR3 se cultivaron en medio DMEM con 0,01 mg /ml de insulina y 15% de FBS. células OVCAR8 se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de FBS. Todas las líneas celulares fueron cultivadas con 10 unidades /ml de penicilina y 10 ng /ml de estreptomicina. Las líneas celulares estables se cultivaron en medio de cultivo y se seleccionaron utilizando diferentes concentraciones de puromicina.
proliferación de las células de ensayo
Para cada condición se ha descrito anteriormente, las células se cultivaron en pocillos por triplicado en placas de 96 pocillos a 2000 células /bien. El crecimiento celular se determinó midiendo la absorbancia con un lector de placas (Bio-Rad) después del cultivo durante 24 horas. Tres experimentos independientes se realizaron para cada tratamiento.
Western Blot análisis
Los extractos celulares que contienen 30 g de proteína se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore Corp., Bedford, MA ). Después de sondeo con anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos anti-conejo unido a la peroxidasa de rábano picante (Tecnologías de Señalización Celular, Danvers, MA) y después se lavó. Los anticuerpos unidos se visualizaron usando un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham). Los anticuerpos primarios fueron: YAP (# 4912), S127 fosforilada-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), escindidos de la caspasa-3 (# 9664), β-actina (# AC40), E-cadherina (# 3195) , Slug (# 3195), y el caracol (# 3895) a partir de Señalización celular. A (5178-1) de anticuerpos TEAD1 era de Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) y TEAD3 (LS-C30406) anticuerpos eran de Vida útil Biosciences. Un anticuerpo TEAD4 (ab97460) fue de Abcam.
colonia plana y ensayos de formación de colonias en agar blando
Las células se sembraron en pocillos por triplicado en placas de 6 pocillos durante 14 días para un ensayo de formación de colonias plana . Para un ensayo de agar blando, 2.000 células se sembraron en medio completo más 0,6% de agar en pocillos por triplicado en placas de 6 pocillos. El medio se reemplazó cada 48 horas y se contaron las colonias visibles por microscopía de luz después de 21 días.
ensayo de Scratch
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron en un medio libre de suero para bloquear la proliferación . Después de 12 horas, las células se rascaron el uso de una punta de pipeta de 200 l. Entonces, las imágenes de 10 arañazos por línea celular fueron adquiridas a 0 h, 12 h, y 24 h.
Apoptosis ensayo
Las células se cultivaron en medio con diferentes concentraciones de cisplatino durante 48 horas. A continuación, las células se recogieron con un kit de detección de apoptosis (BD Biosciences, 559.763) por citometría de flujo y para el análisis de Western blot.
in vitro
y
in vivo
modelo metastásico y bioluminiscente de imágenes
a (tamaño de poro de 8 micras, Corning, EE.UU.) de 24 pocillos transwell placa se utiliza para determinar la migración y la capacidad invasiva de cada línea celular. Para los ensayos de migración transwell, 5 × 10
4 células fueron sembradas en la cámara superior que se alinea con una membrana no revestida. Las cámaras inferiores fueron añadidos en el medio de cultivo de 500 ul con 20% de SFB. Se determinaron los valores medios de ensayos por triplicado para cada condición experimental.
En
in vivo
ensayos de metástasis, las células estables HO8910 PM-YAP △ C se infectaron con un plásmido reportero lusiferase y se inyectan en el venas caudales de mujeres ratones nulos de 4 semanas. Después de dos semanas, los animales fueron imágenes semanalmente por la máquina de formación de imágenes de los animales utilizando un dispositivo acoplado de carga intensificada (CCD) sistema de cámaras. Para
in vivo
imágenes de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron usando una mezcla de 1-2% de isofluorano /aire y se inyectaron con una dosis única (ip) de 100 mg /kg se detectó de luciferina (Promega, WI) y la bioluminiscencia con un sistema IVIS Imaging 100 (Xenogen).
Además de la bioluminiscencia de imágenes, los ratones fueron ejecutados a los 60 días después de la inyección de células de cáncer de ovario para la investigación de las metástasis de órganos después de la inoculación.
el análisis estadístico
En los 45 sujetos con los datos inmunohistoquímicos y de resultado completos, 5 años de supervivencia específica de la enfermedad se estimó mediante el método de Kaplan-Meier y se compararon entre los grupos utilizando las pruebas de log-rank. Análisis de correlación se completó mediante la prueba de Chi-cuadrado. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los resultados de cada variable medida con los resultados del control. P-valores de & lt; 0,05 se consideró significativo. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SPSS (versión 11.0).
Resultados
YAP es aumentada significativamente en tejidos de cáncer de ovario humano y la expresión de alto YAP predice mal pronóstico del paciente
Para investigar si YAP se upregulated en el cáncer de ovario humano, YAP total y fosforilada (pyap) se detectaron mediante inmunohistoquímica (IHC) y se evaluaron las diapositivas basada en los niveles de tinción YAP citoplasmáticas y nucleares. Estas secciones IHC se clasificaron como tinción ya sea negativa, baja o alta. Como control, 10 secciones de tejido de ovario normales se tiñeron inmunohistoquímicamente con YAP. Sin embargo, la expresión YAP no se detectó en estas secciones (Figura 1A)
A:. Resultados de inmunohistoquímica para la expresión YAP y pyap en los tejidos de ovario humano normal y cuatro subtipos de tejido de cáncer de ovario. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina. Se muestran aumentos en 40 × 100 × y. Barra de escala = 100 M para todos los paneles. B: análisis de Kaplan-Meier para las asociaciones entre la expresión YAP, la localización y la fosforilación y la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario. P-valores son de log-rank pruebas.
YAP expresión y localización subcelular variado para los diferentes tipos de tumores (Figura 1A). Se observaron niveles elevados de YAP nucleares de 22,64% de las 106 muestras de tumor de ovario analizadas, que incluían 9 metastásico muestras de cáncer de ovario, mientras que se observó en Pyap 11,88% de las muestras tumorales. De 24 muestras con fuertes señales de YAP IHC, 13 también fueron fuertemente positivas para Pyap. Entre los cuatro tipos principales de cáncer de ovario, YAP se expresa fuertemente en muestras cancinoma serosas y endometrioide (86.67%; N = 15).
Para determinar si las distribuciones de YAP y Pyap se asociaron con la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario, YAP y localización de expresión y niveles Pyap se evaluaron en 45 secciones patológicas de cáncer de ovario. Estos resultados se utilizaron para el análisis de Kaplan-Meier para estimar la supervivencia específica de la enfermedad. Tanto YAP citoplasmática (cYAP) y Pyap solas no se asociaron con un mal pronóstico para el cáncer de ovario humano. Sin embargo, cuando se tomaron en cuenta el total de los niveles de expresión YAP, éstos se asociaron significativamente con un mal pronóstico (Figura 1B). Estos resultados sugieren que los niveles de expresión alta de YAP en lugar de sus distribuciones subcelulares se asociaron con la supervivencia del paciente de cáncer de ovario.
YAP promueve la proliferación de células de cáncer de ovario y la tumorigénesis
Además de las muestras de cáncer de ovario humano, se también se determina la expresión endógena YAP en 11 líneas celulares de cáncer de ovario en cultivo. resultados de transferencia Western mostraron que YAP fue altamente expresado en la mayoría de estas líneas celulares, con la expresión más débil en las células A2780 y la más alta expresión en células OVCAR8 (Figura 2A). Por lo tanto, se usaron estas dos líneas celulares para los siguientes experimentos
A:. Resultados de transferencia Western para la expresión YAP endógeno en 11 líneas celulares de cáncer de ovario. B: Diagrama de los principales dominios estructurales y funcionales sitios de fosforilación en YAP humana (longitud total y C-terminal suprimido, YAP-? C, formas). C: resultados de Western blot para la expresión de la bandera de etiquetado YAP-5SA y YAP-5SA-? C en líneas celulares estables establecidas. D: Las curvas de crecimiento para células que expresan de forma estable sus células de control YAP-5SA (panel superior) y YAP-5SA-? C (panel inferior) y durante un periodo de cultivo de 7 días. E: Las imágenes y los resultados cuantitativos para los ensayos de formación de colonias de placa plana. Las células que expresaban YAP-5SA o YAP-5SA-? C y sus células de control se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 2 semanas. F: Las imágenes y los resultados cuantitativos de colonias crecidas en agar blando. Las células que expresaban YAP-5SA o YAP-5SA-? C y sus células de control se sembraron en agar blando durante 3 semanas. G: Las imágenes y los resultados cuantitativos de xenoinjertos desarrollados en ratones desnudos. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con YAP-5SA expresar y células de control. Cada punto es la media de 3 experimentos. Las barras de error representan S. D. 'S; n = 5. Las diferencias estadísticamente significativas en comparación con un control determinado por la prueba t de Student se indican mediante * (P & lt; 0,05) o ** (P & lt; 0,01) guía empresas
Para investigar un papel. de YAP en la proliferación celular y la metástasis del cáncer de ovario, generamos A2780 y líneas celulares estables que sobreexpresan OVCAR8 constitutivamente activa YAP (YAP con mutaciones en el sitio de cinco LATS1 /2 fosforilación; YAP-5SA) y negativo dominante YAP (YAP-5SA con un C- terminal de eliminación dominio de transactivación; YAP-5SA-? C; Figura 2B-C). curvas de crecimiento de la célula mostró que las células que expresan YAP-5SA tenían una mayor actividad proliferativa de los controles (Figura 2D, panel superior). Por el contrario, YAP-5SA-? C células que expresan OVCAR8 tuvo una tasa de disminución de la proliferación en relación con las células control (Figura 2D, panel inferior).
continuación, se investigó si la actividad YAP afectada la transformación celular y la migración en las células de cáncer de ovario usando un ensayo de formación de colonias de la placa. Estos resultados mostraron que constitutivamente activa YAP-5SA promovió la formación de clon, pero que dominante negativo YAP-5SA-? C suprimen la formación de clon (Figura 2E). Además, se utilizó un ensayo de agar suave para determinar el crecimiento independiente de anclaje, otro indicador de la tumorigenicidad. Como se muestra en la Figura 2F, la actividad YAP se correlacionó positivamente con la capacidad de formación de colonias de células de cáncer de ovario 'en agar blando.
YAP promueve la proliferación de células de cáncer de ovario y la tumorigénesis
in vivo
Los estudios anteriores no investigaron si YAP podría mejorar la tumorigénesis
in vivo
. Por lo tanto, se inyectaron subcutáneamente YAP-5SA y YAP-5SA-? C células que expresan, así como sus respectivas células de control, en ratones desnudos de 4 semanas de edad. Después de 3 semanas, los tumores derivados de células estables YAP-5SA fueron significativamente mayores que los de los controles (Figura 2G). Estos resultados fueron consistentes con nuestros
in vitro
ensayos.
YAP mejora la resistencia a líneas celulares de cáncer de ovario 'a cisplatino y taxol
El cisplatino y el taxol son los fármacos contra el cáncer primarias utilizado para la terapia del cáncer de ovario. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si la actividad YAP afectada sensibilidades células de cáncer de ovario 'a cisplatino y taxol. Como se muestra en la figura 3A, las células que expresan YAP-5SA eran más resistentes a ambos fármacos que eran células de control a diferentes dosis. En contraste, las células que expresan YAP-5SA-? C eran más susceptibles a los dos fármacos que eran células de control. Los marcadores de células apoptóticas escindidos PARP y caspasa 3 escindida se detectó en células de control A2780 después del tratamiento de cisplatino en una forma dependiente de la dosis (0 a 100 mM). Sin embargo, el aumento de expresión de estos marcadores de apoptosis eran menos significativos en tratados de manera similar células que expresan YAP-5SA (Figura 3B)
A:. Viabilidad de YAP-5SA y YAP-5SA-células que expresan? C después del tratamiento con Taxol o CDDP, tal como se evaluó mediante el ensayo de MTT. B: resultados de Western blot para los marcadores de apoptosis caspasa 3 y PARP escindida en YAP-5SA que expresan y control de las células después del tratamiento con las dosis indicadas de CDDP durante 48 h. C: Citometría de flujo resultados para la apoptosis de las células A2780CP con o sin YAP-5SA-? C transfección y después del tratamiento con diferentes dosis de CDDP para 48 h. D: resultados de Western blot para la caspasa 3 escindida y la PARP en YAP-5SA-? C expresar y control de las células después del tratamiento con las dosis indicadas de CDDP para 48 h. F-G: Las imágenes y los resultados cuantitativos de los
in vivo
capacidad tumorigénico de las células A2780CP con o sin expresión YAP-5SA-? C. Los ratones desnudos se inyectaron con CDDP través de una vena caudal una vez cada semana durante cuatro semanas después de xenoinjertos de tumor alcanzó 5 mm de diámetro. H: resultados de IHC para el marcador de proliferación Ki67 en las secciones de tejido tumor indicados. Barra de escala = 100 mM.
La citometría de flujo Los resultados mostraron que el cisplatino-resistentes ya se ha informado de ovario línea celular de cáncer (A2780CP) era de hecho resistentes al tratamiento con cisplatino a dosis bajas (10-40 m). Sin embargo, la expresión YAP-5SA-? C en estas células causó un aumento en la apoptosis celular después del tratamiento con cisplatino En todas las dosis probadas (Figura 3C-D). Por otra parte, las células que expresan A2780CP YAP-5SA-? C mostraron un aumento notable expresión de PARP escindida y la caspasa 3 que tenía control de las células después del tratamiento con cisplatino (Figura 3E).
Para determinar si YAP confiere resistencia a los fármacos a las células de cáncer de ovario
in vivo
, se inyecta por vía subcutánea ratones desnudos con células A2780CP que expresan de forma estable YAP-5SA-? C y con las células control. En 1 semana después de las inyecciones de células, los ratones se trataron con cisplatino por inyección vano caudal cada tres días. tamaños de los tumores se midieron a 5 semanas después de las inyecciones de células de cáncer de ovario. En comparación con los controles, los tumores que se obtuvieron a partir de células que expresan YAP-5SA-? C eran más pequeñas en tamaño en comparación con las derivadas de las células de control (Figura 3F-G). marcador de proliferación celular Ki67 expresión fue más débil en YAP-5SA-? C expresando células que en las células control (Figura 3H).
YAP mejora la migración y el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de ovario
siguiente investigado los efectos de la actividad YAP en la migración de células de cáncer de ovario. En ambos ensayos de cero (Figura 4A) y transwell ensayos (Figura 4B), las células que expresan YAP-5SA migran más rápido, mientras que las células que expresan YAP-5SA-? C migran más lentamente que las células control.
A. Cicatrización de heridas ensayo para la migración de YAP-5SA y YAP-5SA-? C que expresan las células después del cultivo durante 12 y 24 horas. Barra de escala = 100 M para todos los paneles. B. ensayos Transwell para la migración de YAP-5SA y YAP-5SA-células que expresan? C. **, P & lt; 0,01. Los ensayos de formación de imágenes de bioluminiscencia C. muestran metástasis pulmonares de control y YAP-5SA-? C expresando células HO8910PM después de que fueron inyectadas en las venas caudales de ratones desnudos. D. HE y tinción IHC de los sitios de metástasis pulmonares que se muestran en C. E-F: Imágenes y resultados de los análisis estadísticos de la metástasis de hígado por la vena caudal inyectado células HO8910 PM. G: HE y YAP IHC resultados de sitios de metástasis hepáticas que se muestran en EH resultados Western blot para expresiones marcadores de EMT en cultivaron YAP-5SA y YAP-5SA-? C expresando células y
in vivo
xenoinjertos derivados de estas células
Además, se hizo
in vivo
experimentos para probar si era necesaria la actividad YAP para la metástasis del cáncer de ovario. Hemos establecido líneas celulares estables que expresan luciferasa usando células HO8910-PM, una línea de ovario humano de células de cáncer con una alta capacidad metastásica YAP-5SA-ΔC- y, y se inyectan estas células en ratones desnudos a través de sus venas caudal (5 × 10
6 células /ratón). A las dos semanas después de la inyección, los ratones se obtuvieron imágenes de metástasis usando un sistema de imagen animal. Como se muestra en la Figura 4C-D, los xenoinjertos derivados de las células YAP-5SA-? C-expresan eran más pequeñas que las derivadas de las células de control. resultados de IHC mostraron que los xenoinjertos fueron positivos para CA125 y YAP, que confirmó sus orígenes de las células de cáncer de ovario inyectados. Significativamente, se detectaron metástasis después de la inoculación en los hígados de los 10 ratones que fueron inyectados con células de control HO8910, pero sólo en 2 de 10 ratones inyectados con células YAP-5SA-? C-expresan (Figura 4E). Además, las células formadas muchos menos nódulos metastásicos (YAP-positivos) que las células de control en los hígados de ratones inyectados (Figura 4F-G) YAP-5SA-? C-expresión. Estos resultados sugieren que la disminución de la actividad ovárica YAP retraso células de cáncer de metástasis
in vivo
.
Un epitelio-mesenquimal transición (EMT) se piensa que es un proceso importante durante la adquisición de las propiedades requerido para la metástasis tumoral. Tanto en las células cultivadas de cáncer de ovario y en las aisladas de
in vivo
, YAP-5SA promovió la expresión del marcador de EMT Caracol y inhibió la expresión del marcador epitelial E-cadherina. Sin embargo, YAP-5SA-? C tenía los efectos opuestos (Figura 4H).
niveles de alta nuclear YAP y TAED4 están asociados con un pobre humano de ovario pronóstico del cáncer
YAP no tiene un enlace de DNA dominio. Funciona como una transcripción co-activador mediante la unión con los factores de transcripción de la familia TEAD (TEAD1-4). Sin embargo, no se ha investigado si Teads juegan ningún papel en el pronóstico del cáncer de ovario. Por lo tanto, se investigó TEAD1-4 expresión en muestras de cáncer de ovario humano. Las expresiones de los 4 subtipos de proteínas de la familia Tead se investigaron individualmente en una micromatriz de tejido de cáncer de ovario por IHC (Figura 5A). Los resultados del análisis de correlación mostraron que YAP y Pyap se correlacionaron positivamente con la expresión TEAD1-4, y fueron más estrechamente correlacionada con la expresión TEAD4 análisis de asociación (Figura 5B) .Un utilizando 45 muestras de pacientes de cáncer de ovario se hizo en el cual clasificamos las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier . Estos resultados mostraron que la expresión YAP se correlacionó positivamente con la expresión TEAD4 (Figura 5C, P = 0,0284).
A. IHC se traduce para la expresión Teads en tejidos de cáncer de ovario humano. Barra de escala = 100 mM. B. Las asociaciones entre las expresiones de YAP /Pyap y expresiones Tead en una matriz de tejido de cáncer de ovario. C. Las asociaciones entre las expresiones de YAP y TEAD4 en 45 muestras de cáncer de ovario clasificados según estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier. D. YAP y TEAD4 co-expresión se asocia con un mal pronóstico con cáncer de ovario humano. La expresión de alto Tead frente baja expresión TEAD4 (izquierda), la expresión de alto YAP combinada con una expresión de alto TEAD4 frente a otras categorías (centro), la expresión de alto YAP y la expresión de alto TEAD4 combinada con una alta β-catanin frente a otras categorías (derecha).
además, investigó si TEAD4 solo podría estar asociado con la supervivencia del paciente de cáncer de ovario. estimaciones y comparaciones de la supervivencia específica de la enfermedad de Kaplan-Meier mostraron que la intensidad de la tinción de alta TEAD4 se asoció con una pobre supervivencia de los pacientes (Figura 5D, panel izquierdo). La supervivencia de los pacientes con alta tanto YAP y la expresión de alto TEAD4 fue significativamente peor que la de las otras categorías (Figura 5D, el panel medio; P = 0,002). Además, la estimación de Kaplan-Meier para el combinado alto YAP /TEAD4 y la expresión de marcadores de EMT β-catanin también fue estadísticamente significativa (Figura 5D, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados indican que YAP y TEAD4 eran dos marcadores independientes significativos para la supervivencia de pacientes pobres y su evaluación combinada podría ser un fuerte predictor independiente de supervivencia específica de la enfermedad en los pacientes con cáncer de ovario.
Discusión
YAP se ha implicado como un posible oncogén con diferentes localizaciones subcelulares regulados por sus genes aguas arriba en la vía de Hippo. El aumento de expresión YAP y una localización nuclear se han observado en varios cánceres humanos, incluyendo el hígado, colon, ovario y cáncer de pulmón [23] - [30]. En el presente estudio, hemos demostrado que los niveles de proteína de YAP fueron altas en varias líneas celulares de cáncer de ovario. Más importante aún, YAP fue altamente expresado en las muestras de cáncer de ovario, pero no en el tejido de ovario normal, lo que sugiere que la expresión YAP estaba directamente relacionada con el desarrollo del cáncer de ovario o de progresión.
Estudios anteriores también sugirieron que YAP podría funcionar como un oncogén en el cáncer de ovario [31]. Sin embargo, ninguno de estos estudios investigaron las posibles asociaciones entre los niveles de expresión YAP /Tead y supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de alto YAP en los tumores de ovario se asoció con la supervivencia específica de la enfermedad más corta para los pacientes con cáncer de ovario, y que la expresión de bajo YAP en tumores de ovario se asocia con una supervivencia específica de la enfermedad ya para estos pacientes. Además, encontramos por primera vez que TEAD4, una pareja de unión directa de YAP, también estaba estrechamente asociado con la supervivencia del paciente. La co-expresión de YAP y TEAD4 en tejidos de cáncer de ovario fue aún más dramáticamente asocia con una baja supervivencia del paciente. Por lo tanto, alta YAP /niveles TEAD4 podría ser un predictor para determinar los niveles de malignidad del cáncer de ovario y para estimar el pronóstico de estos pacientes
.
cánceres ováricos epiteliales primarias generalmente se tratan con fármacos a base de platino, como el cisplatino, junto con taxol. Estos fármacos se administran por vía intravenosa o por vía intraperitoneal. señales anti-apoptóticos de apoptosis y son los dos aspectos de la célula de la diafonía entre las vías de supervivencia celular y la muerte celular que determinan el destino de las células en sus reacciones a las circunstancias exógenas. Para los tumores, la apoptosis inducida por fármacos se rige no sólo por la regulación positiva de factores apoptóticos o supresores de tumores, sino también por la modulación de factores de supervivencia celular. En el presente estudio, hemos demostrado que la regulación hacia abajo-arriba y de la actividad YAP podría modular la proliferación, la formación de colonias y capacidades de migración, y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos por líneas celulares de cáncer de ovario. Un mutante constitutivamente activa YAP aumenta la resistencia a la apoptosis inducida por fármacos por las células de cáncer de ovario, mientras dominante negativo YAP restaura la sensibilidad al fármaco en las células de cáncer de ovario resistentes al cisplatino.
Los mecanismos precisos por los cuales YAP mejora la resistencia a las drogas siguen sin estar claros . Varios estudios se centraron en la vía PI3K /Akt para la quimio-resistencia en los cánceres de ovario y mostraron que el cisplatino podría regular positivamente p53 e inducir la apoptosis en estas células de cáncer después de la expresión de AKT dominante negativo, lo que sugiere que la regulación al alza de p53 cisplatino mediada por la oposición de AKT. La vía PI3K /AKT también podría participar en la resistencia a fármacos mediada por YAP, ya que se ha demostrado claramente que YAP participó en la diafonía con las vías PI3K y AKT activación facilitado en otros tipos de células [32], [33]. Estudios anteriores también mostraron que la hiperactivación de la vía PI3K inició el desarrollo del cáncer de ovario en modelos de ratón. La interacción de estas dos vías que hay que investigar más en las células de cáncer de ovario
.
Se ha planteado la hipótesis de que las células cancerosas pierden sus características epiteliales y mesenquimales adquieren ciertas propiedades que promueven la invasión medio extracelular y metástasis a distancia en un EMT- procesos similares. marcadores epiteliales que son regulados hacia abajo durante esta transición incluyen E-cadherina, citoqueratinas, ZO-1 y otros. Se requieren hipopótamo componentes de la vía de señalización de la inhibición por contacto E-cadherina-dependiente de la proliferación. Derribo de Hipona componentes o sobreexpresión YAP señalización inhibe la proliferación celular causado por la disminución de la E-cadherina homophilic de unión en la superficie celular [34].
En nuestro estudio, encontramos que YAP podría mejorar la migración de células de cáncer de ovario líneas. También se encontró que la expresión de marcadores de EMT fue modulada por la actividad YAP en los tejidos tumorales de ratones desnudos y confirmamos que YAP mejorada de ovario metástasis de las células del cáncer de
in vivo
. Aunque la expresión YAP combinada con expresiones marcadores de EMT se asoció con el pronóstico del paciente, la E-cadherina y otra EMT genes por sí solos no fueron asociados con la supervivencia de los pacientes (datos no mostrados). Por lo tanto, la E-cadherina y otros genes EMT no eran predictores independientes de ovario predicción del riesgo de cáncer. Si YAP se tiene en cuenta, a continuación, los marcadores de EMT podría ser un predictor de riesgo de cáncer de ovario.
Estudios previos sugirieron que YAP fue un marcador pronóstico independiente para la supervivencia de los pobres con cáncer de ovario y otros carcinomas [9], [30 ]. Nuestro estudio también confirmó esto mediante el análisis de supervivencia. En nuestro conjunto de datos, YAP se asoció positivamente con el pronóstico del paciente, mientras que su distribución citoplasmática y Pyap no eran indicadores de supervivencia. Los pacientes con YAP expresión de alto nuclear (NYAP) y baja expresión citoplasmática YAP (cYAP) tenían una casi ocho veces mayor riesgo de muerte por esta enfermedad que otros pacientes. El patrón NYAP /cYAP podría reflejar la actividad YAP en un tumor: YAP tiene la transcripción que promueven la actividad sólo cuando está localizado en el núcleo y es presumiblemente transcripcionalmente inactiva cuando se retiene en el citoplasma y es fosforilados en S127 por LATS1 /2 <.