Extracto
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es uno de los mecanismos de resistencia adquirida a los inhibidores de el factor de crecimiento epidérmico receptor-quinasas de tirosina (EGFR-TKIs) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Los mecanismos precisos de la resistencia adquirida relacionada con el EMT a EGFR-TKI en NSCLC siguen sin estar claros. Hemos generado células HCC4006 erlotinib-resistentes (HCC4006ER) por la exposición crónica de
EGFR
células HCC4006 -mutant a concentraciones crecientes de erlotinib. células HCC4006ER adquirieron un fenotipo EMT y la activación de la vía de TGF-β /SMAD, mientras que carece tanto de T790M secundaria
EGFR
mutación y
MET
amplificación de genes. Empleamos la expresión de genes en microarrays HCC4006 y células HCC4006ER de entender mejor el mecanismo de la resistencia adquirida EGFR-TKI con EMT. En el ARNm,
ZEB1 (TCF8)
, un regulador conocido de la EMT, era & gt; 20 veces mayor en las células HCC4006ER que en HCC4006 células, y aumentaron también se detectó ZEB1 nivel de proteínas. Por otra parte, numerosos
ZEB1
genes de respuesta, como
CDH1 (E-cadherina)
,
ST14
, y
vimentina
, eran regulados coordinadamente junto con aumento de
ZEB1
en células HCC4006ER. También se identificó la sobreexpresión ZEB1 y un fenotipo EMT en varias células de NSCLC y muestras de NSCLC humanos con resistencia adquirida EGFR-TKI. ARN contra el
ZEB1
invierte el fenotipo EMT y, sobre todo, restaurado sensibilidad erlotinib en células HCC4006ER corto de interferencia. El nivel de micro-ARN-200c, que se puede regular negativamente ZEB1, se redujo significativamente en células HCC4006ER. Nuestros resultados sugieren que el aumento de
ZEB1
puede conducir resistencia adquirida relacionada con la EMT a EGFR-TKI en el CPNM. Se debe tratar de explorar la orientación
ZEB1
a resensitize tumores resistentes TKI
Visto:. Yoshida T, L canción, Bai Y, Kinose M, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 media la resistencia adquirida a la del factor de crecimiento del receptor tirosina quinasa Inhibidores epidérmico en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10.1371 /journal.pone.0147344
Editor: Pier Giorgio Petronini, Universidad de Parma, Italia
Recibido: 23 Marzo, 2015; Aceptado: 1 Enero de 2016; Publicado: 20 de enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Yoshida et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. El conjunto de datos de microarrays se presentó a la Expresión Génica Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE71587
Financiación:. El trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la espora Moffitt en el cáncer de pulmón (P50-CA119997), NCI 1R01 CA121182, y el Colorado cáncer de pulmón NCI SPORE-CA58187 (HD, PN, RMG). Este trabajo también ha sido apoyado en parte por la biología molecular y secuenciación núcleo, el núcleo de tejido, y la Microarray Core en el Lee Moffitt Center & amp H. Cáncer; Instituto de Investigación, un Centro Integral del Cáncer del NCI designado (P30-CA076292). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de la ventaja de los inhibidores de factor de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina cinasa (EGFR-TKI) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes con
EGFR
mutación [1], la resistencia adquirida a estas terapias es un problema clínico importante. Aunque el T790M secundaria
EGFR
mutación [2] y
MET
amplificación de genes [3] juntos pueden representar el 70% de esta resistencia, los mecanismos para el 30% restante son poco claras. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) se ha asociado negativamente con la sensibilidad de EGFR-TKI en NSCLC [4-7]. De acuerdo con estos resultados, estudios recientes informaron EMT como un posible mecanismo de resistencia adquirida EGFR-TKI en modelos de líneas celulares de cáncer [8,9]. Además, EMT se observó en un subconjunto de pacientes con NSCLC que desarrollaron EGFR-TKI resistencia [10,11]. Sin embargo, los mecanismos detallados de relacionados con el EMT adquirido resistencia a EGFR-TKI en NSCLC, así como las estrategias para su superación, siguen sin estar claros [8,9]. Varias vías de señalización, tales como FGFR [6,12], TGF-beta [8,9], y WNT [13], así como factores de transcripción, como el dedo de zinc caja E de unión a homeobox 1 (ZEB1) [ ,,,0],14], se han implicado en el proceso de EMT.
el EMT permite a las células epiteliales de obtener un fenotipo mesenquimal asociado con aumento de la migración (para revisiones [15-20]). Es un mecanismo esencial para la plasticidad durante el desarrollo y la reparación de tejidos. Está implicado en la curación de heridas, fibrosis, y biología de células madre y contribuye a la progresión de las enfermedades-como la fibrosis de órganos y cáncer. EMT se activa en las células cancerosas y participa en la invasión, metástasis, propiedades madre similar, y resistencia a las terapias antineoplásicas convencionales [15,21,22]. EMT es inducida por TGF, otros factores de crecimiento, y la hipoxia e implica factores de transcripción como caracol, Twist, ZEB1 /ZEB2, y E12 /E47 para modificar la maquinaria transcripcional, la alteración de la traducción y la estabilidad de la proteína, la expresión de ARN no codificantes, y splicing alternativo [16,23,24]. características clásicas de la EMT son la pérdida de adhesión célula-célula y la reprogramación del citoesqueleto. Bajo E-cadherina y alta vimentina y N-cadherina expresiones son marcadores de EMT clásicos. El promotor de la E-cadherina, los asociados de la LSD1 histona desmetilasa con el caracol, el factor de transcripción implicado en los primeros pasos de la inducción de la EMT, lo que sugiere modificaciones epigenéticas durante la EMT [25,26]. De hecho, H3K27 acetilación se redujo en EMT ZEB1 inducida en células de cáncer de pulmón [27]. Recientemente, las características moleculares asociados a la EMT se definieron por un enfoque integrador en el adenocarcinoma de pulmón y apuntaban a una asociación entre el citoesqueleto y proteínas de unión a la actina, el fenotipo EMT y propiedades invasivas [28]. Curiosamente, EMT es la terapéutica clínica transitorios y reversibles, y novedosas dirigidas a EMT están en desarrollo [29].
establecieron células HCC4006ER (erlotinib) resistente como modelo de resistencia adquirida relacionada con la EMT a EGFR-TKI por la exposición crónica de células de NSCLC sensibles HCC4006 que contiene un
EGFR
mutación (exón 19; L747-A750del INSP) a concentraciones crecientes de erlotinib. Examinamos los cambios globales en la expresión génica para identificar moléculas y las vías que podrían contribuir a la relacionada con la EMT-adquirido resistencia EGFR-TKI en el CPNM. Además, el nivel de expresión de micro-ARN-200c (miR-200c) se examinó sobre la base de los informes que el miR-200c regula negativamente ZEB1 y el proceso de EMT [30-32].
Materiales y Métodos
Reactivos
LBH589, erlotinib, BIBW2992, WZ4002, BEZ235, y AZD6244 se compraron a Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, salinomicina, y IWP2 se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). CNTO328 fue proporcionado por Centocor, Inc. (Horsham, PA). CL-387.785 se adquirió de AXXORA (San Diego, CA). Las soluciones madre de estos reactivos en 100% de DMSO se diluyeron directamente en los medios de comunicación a las concentraciones indicadas. TGF-β1 humano se adquirió de amp I +;.; D Systems (Minneapolis, MN)
Cultivo de células
células
HCC4006, H1975 y H358 se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection). la identidad de las células se verificó por análisis de STR (ACGT, Inc., Wheeling, IL), y se confirmaron las células para ser micoplasma negativo por PlasmoTest Mycoplasma detección (InvivoGen, San Diego, CA). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C y 5% de CO
2 células
Generación de EGFR-TKI-resistente.
HCC4006ER células (erlotinib resistente) fueron generados por la exposición de las células HCC4006 que contiene un
EGFR
mutación (exón 19; L747-A750del INSP) para aumentar gradualmente la concentración de erlotinib, a partir de las 3 nM , Por 3 meses. Después de la adaptación inicial, la concentración de erlotinib se aumentó gradualmente hasta 4 mM. células H1975 BIBW-R y H1975 WZ-R fueron generados por la exposición de las células H1975 que contiene un
EGFR
mutación (exón 21; L858R y el exón 20; T790M) para aumentar gradualmente las concentraciones de BIBW2992 (EGFR-TKI irreversibles afatinib ) o WZ4002 (T790M selectiva EGFR-TKI), a partir de las 3 nM, durante 3 meses. Después de la adaptación inicial, el BIBW2992 o concentración WZ4002 se aumentó gradualmente hasta 3 mM o 15 mM, respectivamente. clones de células individuales de estas células se obtuvieron mediante siembra a muy baja densidad.
Estatuto de los
EGFR
y
KRAS mutaciones
ADN genómico total de los padres y las células resistentes se preparó utilizando el DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el manual del producto. secuenciación directa del ADN se utilizó para detectar
EGFR
y
KRAS
mutaciones descritas anteriormente [33]. También se aplicó el ensayo de PCR-invasor para buscar las poblaciones menores de células mutantes T790M, tal como se describe anteriormente [34].
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se determinó utilizando el CellTiter-Glo
® celular luminiscente de viabilidad de ensayo (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a 3x10
3 células por pocillo en la pared negro placas de 96 pocillos (Nunc, nº de catálogo 165305;. Rochester, NY) y se incubaron durante la noche en RPMI con FBS al 5%. Las células se expusieron a diluciones seriadas de inhibidores durante 72 horas. Cincuenta microlitros de la célula-Glo Titulación de reactivos se añadieron a cada pocillo, y la luminiscencia se registró usando un lector de placas Victor (PerkinElmer, Waltham, MA). Los resultados se convirtieron a porcentaje de viabilidad celular mediante la comparación tratado con culturas (100% viables) no tratados de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Índice de combinación (IC) en dosis de IC50 de tratamiento de combinación se calculó por software CompuSyn (http://www.combosyn.com/; ComboSyn, Paramus, NJ). CI & gt; 1, CI = 1, y CI. & Lt; 1 indican aditivos y sinérgicos efectos antagónicos, respectivamente [35]
RTK matriz
células
HCC4006 y HCC4006ER se incubaron en medio RPMI con 5 % de FBS durante 24 horas hasta ~ 80-90% de confluencia celular. los niveles de fosforilación de múltiples receptores tirosina quinasas (RTK), incluidos los del EGF, FGF, PDGF, la insulina, el VEGF, EPH, familias AXL, y MER (entre otros), fueron examinadas usando el kit de serie del Proteoma Profiler humano fosfo-RTK ( R & amp; D Systems) como se describe anteriormente [3] |
análisis de la expresión de proteínas
Las células fueron cultivadas a ~ 80-90% de confluencia antes de la cosecha y la lisis.. Se realizó análisis de transferencia Western en lisados de células enteras como se describe anteriormente [36]. Los extractos nucleares para la detección de factores de transcripción se prepararon como se describe anteriormente [37]; 25 g de proteína se prepararon para cada muestra. Los anticuerpos primarios a EGFR (# 2232), MET (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-Her3 (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-NFkB-p65 (# 3031) , pS465 /467 Smad2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-Erk (# 4377), y PARP (# 9542) se obtuvieron de Señalización celular (Beverly, MA). Los anticuerpos primarios a pY1068-EGFR (# 44-788G) se obtuvieron de Invitrogen. Los anticuerpos primarios a vimentina (BDB550513) se compraron de BD Biosciences (San Diego, CA). Los anticuerpos primarios a ZEB1 (sc25388), fibronectina (sc29011), Her3 (sc285), E-cadherina (sc8426), N-cadherina (sc7939), PTEN (sc7974), Caracol (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), y Lamin A /C (sc20681) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos primarios para beta-actina (SigmaA-1978) se adquirieron de Sigma-Aldrich. Peroxidasa de rábano conjugada de cabra anti-ratón (NXA931) y anti-conejo (NA934V) anticuerpos secundarios se obtuvieron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Establecimiento de células HCC4006ER con estable sobreexpresión Her3
Una proteína fluorescente (GFP) de plásmido retroviral verde fue proporcionado generosamente por el Dr. Florian Grebien y el Dr. Oliver Hantschel (Instituto CeMM, Viena, Austria). Subclonación de Her3 en el plásmido retroviral y el establecimiento de líneas celulares estables con sobreexpresión se realizaron como se ha descrito previamente [36,38]. En breve, humano Her3 cDNA se adquirió de Addgene (Cambridge, MA) y se amplificó por PCR usando el cebador directo 5'-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 'y el cebador 5' CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3 inversa '. El producto Her3 PCR se insertó en pENTR vector D-TOPO y después introduce en el vector pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW por Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix Kit (Invitrogen). Los retrovirus se empaquetaron en células HEK293 Phoenix a partir de ATCC (Manassas, VA) y se utilizaron para infectar células HCC4006ER. Dos semanas después de la infección, las células HCC4006ER GFP-positivas fueron ordenados por FACSVantage (BD Biosciences) en el Moffitt Citometría de Flujo Core.
Migración (arañazos) de ensayo y fotomicroscopia
HCC4006 y las células se sembraron HCC4006ER en placas de 6 cm y se incubaron durante la noche en medio RPMI con 10% de FBS para crear monocapas confluentes. Las monocapas de células se rasparon en una línea recta con una punta de pipeta 1000-l y se incubaron durante 12 horas adicionales. Apariencia de la celda fue visto con un microscopio invertido Olympus CKX41 (Olympus, Center Valley, PA) y se fotografió con una cámara Un Infinity Infinity con captura /Analizar el software (Lumenera Corp., Ottawa, ON).
TGF-β1 ELISA
HCC4006 o HCC4006ER células (5 x 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche en RPMI con 10% de SFB. El medio se reemplazó con RPMI libre de suero con o sin erlotinib (1 M) y se incubó durante 24 horas adicionales. Se recogieron los sobrenadantes de ELISA para TGF-β1 humano (R & amp; D Systems). Siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante
Los plásmidos y la transferencia de genes mediada por liposomas
El indicador de luciferasa p3TP-Lux contiene tres repeticiones del elemento de TPA-sensible fusionada a una porción del promotor de PAI-1 (proporcionado por J. Massagué, Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, NY). pSBE4-Luc contiene cuatro copias del elemento de unión a Smad (SBE). Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo como se describe anteriormente [12] con algunas modificaciones. Brevemente, el ADN plásmido (1,7 g de un plásmido indicador de luciferasa) se mezcló con 10 l de reactivo Fugene (Roche Diagnostic) y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a semiconfluente cultivos de células en placas de cultivo de tejidos de 60 mm. Cuatro horas después de la transfección, las células se trataron con 5 ng /ml de TGF-β, 1 erlotinib mu M, o ambos. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se determinó la cantidad de actividad enzimática de la luciferasa en extractos de células usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega Corporation). Veinte microlitros de extractos de células se añadieron a 100 l de reactivo de luciferasa y se midió la cantidad de luz producida mediante un Barthold luminómetro (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD). Se determinó la cantidad de proteína presente en los extractos de células usando el ensayo de Bio-Rad Bradford.
ARN aislamiento y purificación
Las células se incubaron en medio RPMI con 10% de FBS durante 48 horas a ~ 80-90% de confluencia celular. El ARN total se recogió a través de RNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo el manual del producto. Para asegurarse de ARNm de alta calidad para los microarrays de expresión génica, HCC4006 y el ARN total fue examinado por HCC4006ER Bioanalyzer en el núcleo de tejido Moffitt.
Gene microarrays de expresión y análisis de la bioinformática
Para cada línea celular, el total de ARN a partir de muestras por triplicado se preparó y se mezcla por igual. Las muestras de ARN (10 mg para cada línea celular; 500 ng /l) fueron analizados por el chip Affymetrix serie de genes de perfiles HG-U133 (Affymetrix, Santa Clara, CA) en el Moffitt Microarray Core. Los datos se normalizaron usando MAS5, y las diferencias de cambio de tapa se calcularon entre HCC4006ER y HCC4006 células (HCC4006ER /HCC4006). Un factor de cambio positivo indica una proporción mayor en las células HCC4006ER, mientras que un factor de cambio negativo indica una mayor expresión en células HCC4006. Los cambios en la expresión génica ± 1,5 veces se consideraron significativas [39]. Conjuntos de genes se analizaron por MetaCore (http://portal.genego.com; MetaCore, CA) [40]. datos de la red se integraron y se visualizaron por Cytoscape (http://cytoscape.org/) [41]. Nuestro conjunto de datos de microarrays se presentó a la Expresión Génica Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE71587.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR análisis
Después de aislamiento de ARN que el anterior, cuantitativa en tiempo real RT -PCR se realizó como se ha descrito previamente [14,42]. cebadores se informó anteriormente se utilizaron para ZEB1, caracoles, babosas, E-cadherina, EpCAM, ESRP1, ST14, vimentina, N-cadherina, y FGFR1 [14].
ZEB1 sobreexpresión en células H358
El gen se clonó en ZEB1 pcDNA5-FRT-a y se transfectó en células H358-FlpIn TRex seguido de la selección para la resistencia a 5 mg /ml blasticidin y 100 mg /ml de higromicina, como se describe anteriormente [14]. 6-myc-ZEB1 sobreexpresión fue inducida en células transfectadas de forma estable usando 10 ng /ml de doxiciclina durante 5 días.
El análisis inmunohistoquímico de ZEB1
Se realizó la tinción inmunohistoquímica para ZEB1 como se describe anteriormente [14] . En pocas palabras, las rebanadas de tumores incluidas en parafina fueron desparafinados en Histoclear y rehidratada seguidos por la recuperación de antígenos en ebullición antígeno Solución de desenmascaramiento. Las muestras de tumores se habían recogido a partir de muestras resecado quirúrgicamente, como se informó anteriormente [10]). consentimientos informados escritos aprobados de la junta de revisión institucional para el uso de muestras de tejido tumoral se obtuvieron de todos los pacientes o de sus representantes legales (Junta Institucional de la Universidad de Salud Ocupacional y Ambiental, Japón revisión, el número IRB 08-05). se inhibieron peroxidasas endógenas (0,3% H
2O
2) y los tejidos se permeabilizaron con 0,5% Triton (20 minutos). Los portaobjetos se bloquearon con 3% de suero de BSA /5% de cabra, se incubaron durante 2 horas con el conejo primario anti-ZEB1 (01:50), y se lavaron extensivamente. Los portaobjetos se incubaron a continuación durante 1 hora con anticuerpos anti-conejo biotinilados, se lavaron, y se revelaron con Vectastain ABC, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Vector Laboratories, Inc.).
Cuantificación de miR-200c
ARN total fue extraído por TRIzol (Invitrogen). La transcripción inversa para maduro miR-200c y RNU6B se realizó con 20 ng de ARN total con el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa que incluye la MuLV transcriptasa inversa (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ensayo TaqMan MicroARN correspondiente se utilizó para cuantitativa en tiempo real PCR con el sistema GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Los datos se expresan como el porcentaje de RNU6B, 100x2
-ΔCt, donde Ct = Ct
miR-200c- Ct
RNU6B.
-transfección de ARN corto de interferencia
Pre-validado-ARN corto de interferencia (siRNA; Invitrogen, nº de catálogo HSS110549.) fueron utilizados para inhibir ZEB1 endógeno. En el blanco, más no director piscinas de control negativo se obtuvieron de Dharmacon (Lafayette, CO) y se utilizó como control negativo. La transfección se realizó con Lipofectamine RNAiMAX de Invitrogen usando el procedimiento de transfección inversa según lo recomendado por el fabricante.
Resultados
exposición a erlotinib crónica de células HCC4006 genera la resistencia de células autónomas estable a EGFR-TKI sin T790M o
MET
amplificación
Para generar clones de EGFR-TKI-resistentes de un
EGFR
-mutant línea celular de NSCLC, expusimos las células HCC4006 EGFR-TKI sensibles con
EGFR
mutación (exón 19; L747-A750del INSP) a concentraciones crecientes de erlotinib (hasta 4 M) durante 3 meses. HCC4006ER células se volvieron altamente resistentes tanto al erlotinib y lo irreversible de EGFR-TKI, CL387,785 (figura 1A). Esta resistencia se mantuvo estable, ya que no se invirtió mediante el cultivo de células HCC4006ER para un máximo de 6 meses en un medio libre de erlotinib (S1 figura). También establecimos 5 clones de células individuales de células HCC4006ER (HCC4006ER-S1 a -S5 células), que eran cada resistentes individualmente a erlotinib en el mismo grado que la población HCC4006ER mayor (S2A Fig). Por lo tanto, el fenotipo resistente era estable y células autónomas.
A, células HCC4006 y HCC4006ER fueron tratados durante 72 horas con concentraciones crecientes de erlotinib o CL387,785. Los datos generados por ensayo de viabilidad celular (CellTiter-Glo) se expresan como un porcentaje del valor para las células no tratadas. Las barras de error representan SEM de 3 experimentos independientes. se incubaron las células B, HCC4006 y HCC4006ER durante 24 horas a ~ 80-90% de confluencia celular. Se recogió el lisado de células enteras de cada línea celular y se sometió a Kit matriz de perfiles proteoma humano fosfo-RTK para examinar los niveles de fosforilación de múltiples RTK. Detectados fosfo-RTK en la matriz están rodeados. Las manchas en las cuatro esquinas de la matriz RTK son controles positivos. células C, HCC4006 y HCC4006ER se incubaron durante 6 horas ± erlotinib (1 M). Los lisados celulares se sometieron a análisis de la expresión de proteínas con anticuerpos frente a pEGFR, EGFR, pMET, MET, pHer3, Her3, PTEN, pAkt, Akt, gratificación, Erk, y β-actina.
Hemos examinado la
EGFR
estado del gen de ambas células sensibles y resistentes para la mutación T790M secundaria en el exón 20. Aunque las células HCC4006ER retenidos exón 19-L747 A750del INSP, T790M no se detectó incluso con el ensayo de PCR-invasor [34], que es más sensible que la secuenciación directa (datos no mostrados). Además, no hemos encontrado
KRAS
mutaciones de punto de acceso (exón 1 y el exón 2 G12V Q61H; datos no presentados), lo que se asocia con la resistencia primaria EGFR-TKI en NSCLC [43]. Para investigar otros mecanismos de resistencia reportados EGFR-TKI como
MET
amplificación [3], la activación de RFIG señalización [44], o la pérdida de la proteína PTEN [45], se examinaron las moléculas clave de la vía EGFR Western blot y empleó una matriz de fosfo-RTK de análisis para diferentes RTK activados. Sin embargo, se observó ninguna mecanismo de resistencia previamente identificados a EGFR-TKI, incluyendo MET upregulated o actividad RFIG (figura 1B) o la pérdida de la proteína PTEN en las células HCC4006ER (figura 1C). En términos de la señalización de EGFR, la capacidad de erlotinib para inhibir la fosforilación de EGFR se conservó tanto en las células HCC4006 y HCC4006ER. Sin embargo, los niveles de fosfo-Akt y ERK fueron sensibles a erlotinib sólo en las células parentales HCC4006, en contraste con HCC4006ER células (Fig 1C).
Un estudio anterior informó de que Her3 media PI3K vía de señalización /Akt en gefitinib- líneas celulares de NSCLC sensibles [46]. Sin embargo, nuestro análisis de transferencia de Western demostró que las células HCC4006ER perdieron completamente la expresión de proteínas Her3 en comparación con las células HCC4006, explicando la pérdida de fosforilación Her3 en estas células observadas en la matriz de RTK y el análisis Western (Fig 1B y 1C). Para determinar si la pérdida de HER3 podría explicar la resistencia a erlotinib en células HCC4006ER, generamos Her3 sobreexpresan células (células HCC4006ER-Her3) utilizando la infección lentiviral para examinar los efectos de erlotinib en la proliferación celular y de la vía EGFR. células HCC4006ER-Her3 mantuvieron su resistencia a erlotinib (Fig 2A), así como la persistencia de fosfo-Akt y fosfo-Erk (Fig 2B), similar a las células HCC4006ER originales y de control de la sobreexpresión de GFP lentivirus derivado (HCC4006ER-GFP). Estos resultados indican que la pérdida de Her3 no conduce erlotinib resistencia en células HCC4006ER.
, células HCC4006ER con GFP estable o sobreexpresión Her3 (HCC4006ER-GFP y las células HCC4006ER-Her3), así como HCC4006 y las células HCC4006ER original A fueron tratados durante 72 horas con concentraciones crecientes de erlotinib. Los datos generados por ensayo de viabilidad celular (CellTiter-Glo) se expresan como un porcentaje del valor para las células no tratadas. Las barras de error representan SEM de 3 experimentos independientes. B, las células se incubaron HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, y HCC4006ER-Her3 durante 6 horas ± erlotinib (1 M). Los lisados celulares se sometieron a análisis de la expresión de proteínas con anticuerpos frente a Her3, pEGFR, EGFR, PTEN, pAkt, Akt, gratificación, Erk, y β-actina. C, las células HCC4006ER fueron tratados durante 72 h con concentraciones crecientes de erlotinib solo, BEZ235 solo, AZD6244 solo, o BEZ235 y AZD6244 en combinación. HCC4006 células fueron tratadas durante 72 horas con concentraciones crecientes de erlotinib durante 72 horas para trazar una curva de referencia. Los datos generados por ensayo de viabilidad celular (CellTiter-Glo) se expresan como un porcentaje del valor para las células no tratadas. Las barras de error representan SEM de 3 experimentos independientes. índice de combinación (IC) en dosis de IC50 de BEZ235 combinado con AZD6244 se calcula software CompuSyn. CI & gt; 1, CI = 1, y CI & lt; 1 indican, aditivos y sinérgicos efectos antagónicos, respectivamente. D, Tanto HCC4006 y células HCC4006ER se incubaron durante 6 ó 24 horas ± erlotinib (1 M), BEZ235 (500 nM) o AZD6244 (1 M) como se indica. Los lisados celulares se sometieron a análisis de expresión de proteínas con anticuerpos frente a pEGFR, EGFR, pAkt, Akt, Perk, y Erk (muestras de 6 horas) o para PARP junto con anticuerpos para ß-actina como control de carga (muestras de 24 horas).
Con la fosforilación de Akt y persistente Erk en células HCC4006ER, se examinaron los efectos del inhibidor de PI3K /mTOR, BEZ235, y el inhibidor de MEK, AZD6244. Hemos observado que la fosfo-Akt se activa por inhibición fosfo-Erk con AZD6244 tanto en las células HCC4006 y HCC4006ER. Esta activación fosfo-Akt inducida por AZD6244 no fue completamente inhibida por BEZ235 en células HCC4006 y HCC4006ER (Fig 2D). La combinación de BEZ235 y AZD6244 no restauró la inhibición de la proliferación celular o la escisión de PARP en células HCC4006ER inducidos por el tratamiento erlotinib en HCC4006 células, aunque índice de combinación (IC) de esta combinación indica efecto sinérgico (CI & lt; 1) (Fig 2C y 2D ). Estos resultados demuestran que la inhibición dual de Akt y ERK no superó erlotinib resistencia en células HCC4006ER, aunque fosfo-Akt y ERK se activan persistentemente independiente de la vía EGFR.
células HCC4006ER muestran un fenotipo de EMT con la activación de la TGF-β /Smad vía
Para determinar si la resistencia en las células HCC4006ER se asoció con un proceso de EMT, hemos probado la migración celular usando los ensayos de cero. En las células HCC4006ER, la brecha se cerró por completo dentro de las 12 horas, mientras que se requieren más de 12 horas en las células HCC4006 parentales (Figura 3A). También se encontró que la proliferación de las células HCC4006ER era significativamente más lento que las células parentales (figura 3B), consistente con estudios recientes que sugieren un crecimiento más lento de las células resistentes a fármacos [47]. Varios informes han indicado que EMT se asocia con primaria y la resistencia adquirida a EGFR-TKI en NSCLC [4-11]. El aumento de la migración, resistencia a erlotinib, y reducción de la proliferación de las células HCC4006ER fueron consistentes con un proceso de EMT. Para examinar esta posibilidad, buscamos moléculas relacionadas con la EMT en las células HCC4006 y HCC4006ER. Es importante el descubrimiento pérdida de E-cadherina y la regulación positiva de N-cadherina, vimentina, y fibronectina en las células HCC4006ER, que no fueron afectados por el tratamiento con erlotinib (Figura 3C). Por otra parte, se encontró que todos los clones de células resistentes individuales (HCC4006ER-S1 a -S5) se habían sometido a EMT, así como la pérdida de la proteína Her3, similar a los resultados observados en las células HCC4006ER originales (S2B FIG). estudio anterior indica que el mantenimiento de gefitinib impidió que el proceso de EMT y la migración celular inhibida en las células NSCLC gefitinib resistente con
MET
-amplification (pero sin EMT fenotipo) [48]. Sin embargo, los niveles de expresión de marcadores de EMT (E-cadherina, N-cadherina, vimentina y fibronectina) no se vieron afectados por la exposición continua de erlotinib durante 72 horas en células HCC4006ER (S3 A) Fig. Además, la capacidad de la migración en las células HCC4006ER eran todavía superior a la de las células HCC4006 incluso incubadas con erlotinib (S3B Fig). Estos resultados sugieren que la EMT fenotipo en las células HCC4006ER eran estables independientemente de la presencia de erlotinib.
A, monocapas de células y HCC4006 HCC4006ER se rasparon en una línea recta con una punta de pipeta de 1000 l. fotos monocapa con arañazos fueron tomadas después de una incubación de 12 horas. B, células HCC4006 y HCC4006ER se cultivaron a 1x10
3 células /pocillo en la pared negro placas de 96 pocillos, se incubaron en RPMI con FBS al 10%, y se dejó crecer durante días indicados. Los datos generados por ensayo de viabilidad celular (CellTiter-Glo) se expresan como un porcentaje del valor para las células no tratadas. Las determinaciones se realizaron por triplicado. Bares, SEM. * P & lt; 0,0001 para HCC4006 frente HCC4006ER (Estudiante
t
prueba). células C, HCC4006 y HCC4006ER se incubaron durante 6 horas ± erlotinib (1 M). Los lisados celulares se sometieron a análisis de expresión de proteínas con anticuerpos frente a E-cadherina, N-cadherina, vimentina, fibronectina, y β-actina. células D, HCC4006 y HCC4006ER se incubaron durante 6 horas ± TGF-β1 (10 ng /ml) o erlotinib (1 M), como se indica. Los lisados celulares se sometieron a análisis de expresión de proteínas con anticuerpos frente a pSmad2 y para beta-actina. E, HCC4006 o HCC4006ER células se incubaron durante la noche. El medio se reemplazó con RPMI libre de suero con o sin erlotinib (1 M) y se incubó durante 24 horas adicionales. Se recogieron los sobrenadantes y se sometieron a TGF-β1 ELISA. Las determinaciones se realizaron por triplicado. Bares, SEM. *
P Hotel & lt; 0,0001 frente HCC4006 células con o sin tratamiento con erlotinib (Estudiante
t
prueba). F, la transcripción inducida por TGF-β se incrementa por el co-tratamiento con TGF-β y erlotonib en transfecciones transitorias y con construcciones de luciferasa de TGF-ß-sensible. células HCC4006 y HCC4006ER fueron transfectadas transitoriamente con el reportero p3TP-Lux o pSBE4 y tratados con DMSO, 5 ng /ml de TGF-β1, 1 erlotinib mu M, o una combinación de 5 ng /ml de TGF-β1 y 1 erlotinib mu M durante 48 horas. Después de 48 horas, se determinó la actividad de luciferasa como se describe en Materiales y Métodos.
De acuerdo con estudios anteriores que muestran que la vía de TGF-β es crítica para la resistencia adquirida EGFR-TKI relacionados con la EMT en NSCLC [8 , 9], encontramos mayores niveles basales de Smad2 fosforilación en células HCC4006ER. Como era de esperar, SMAD2 fosforilación aumentó aún más después del tratamiento de TGF-β, y este aumento era independiente del tratamiento erlotinib (Fig 3D). Además, en comparación con las células HCC4006, la cantidad de TGF-β1 en el medio se upregulated en células HCC4006ER (independientes de tratamiento erlotinib) (Fig 3E), lo que sugiere que la vía de TGF-β se activó secundaria al aumento de la expresión del ligando. La activación de la vía de TGF-β en células HCC4006ER se confirmó mediante la transfección de los plásmidos de TGF-ß-sensible reportero de la luciferasa, pSBE4 y p3TPlux, en ambas células HCC4006 y HCC4006ER tratados con 5 ng /ml de TGF-β y /o erlotinib 1 M . Como puede verse en la figura 3F, la transcripción impulsada por el TGF-β es mayor en las células HCC4006ER que en las células de los padres cuando son estimuladas por TGF-β, independientemente de la presencia de erlotinib (Fig 3F). *
P Hotel & lt; *
P Hotel & lt;