Extracto
El factor de transcripción, dedo de zinc del cerebelo (ZIC1), juega un papel crucial en el desarrollo de los vertebrados . Recientemente, ZIC1 también se ha encontrado para participar en la progresión de los cánceres humanos, incluyendo los meduloblastomas, cáncer de endometrio, y neoplasias mesenquimales. Sin embargo, la función de ZIC1 en la progresión del cáncer de colon no se ha definido. En este estudio, hemos demostrado ZIC1 a ser silenciado o downregulated en líneas celulares de cáncer de colon de manera significativa. Estos efectos se invirtieron mediante tratamiento desmetilación con 5-aza-2 'desoxicitidina (AZA). ZIC1 expresión también está regulado por disminución significativa en tejidos de cáncer colorrectal primario relativas a los tejidos no tumorales adyacentes (
p = 0,0001
). Además, la metilación del promotor de gen ZIC1 se detecta con frecuencia en los tejidos tumorales primarios (85%, 34/40), pero no en los tejidos no tumorales adyacentes. La expresión ectópica de ZIC1 suprime la proliferación celular e induce la apoptosis, que se asocia con MAPK y PI
3K /Akt, así como la Bcl-xl /Bad cascada /Caspase3. Para identificar a los candidatos objetivo de ZIC1, se emplearon microarrays de ADNc y se encontró que 337 genes son downregulated y 95 genes regulados por incremento de la expresión ectópica de ZIC1, que fueron verificados por 10 expresiones de genes seleccionados por QRT-PCR. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que ZIC1 potencialmente puede funcionar como un gen supresor tumoral, que está regulado por disminución a través de la hipermetilación del promotor en los cánceres colorrectales
Visto:. Gan L, S Chen, Zhong J, Wang X, Lam EKY, Liu X, et al. (2011) ZIC1 es downregulated través de la hipermetilación del promotor, y funciona como genes supresores de tumor en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (2): e16916. doi: 10.1371 /journal.pone.0016916
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Octubre, 2010; Aceptó 3 de enero de 2011; Publicado: 15 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Gan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Naturales de China (30900676), la Fundación Científica Natural de la provincia de Zhejiang de China (Y206280), y el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Zhejiang de China (2009C03012-3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común, así como la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La acumulación secuencial de las alteraciones genéticas y epigenéticas conduce a la transformación del epitelio del colon normal a cáncer colorrectal [2]. Estos cambios epigenéticos, incluyendo la metilación del promotor del ADN y las histonas modificaciones, pueden inducir la inactivación de genes supresores de tumores (TSG) [3] - [5]. Las regiones de ADN enriquecidos con dinucleótidos CpG, denominadas islas CpG, pueden llegar a ser hypermethylated en las células cancerosas y el resultado en el silenciamiento de las ETG [5]. Un subconjunto de CRCs pantalla metilación de múltiples genes, denominado el fenotipo isla methylator CpG (CIMP) [2], [5]. Nosotros y otros han encontrado previamente que un número creciente de TSG, incluyendo APC, CDKN2A /p16, UCHL1, y TBX5 son frecuentemente silenciadas a través de la hipermetilación del promotor de CRC [2], [6] - [9]. Estos eventos pueden ocurrir en la etapa temprana de CRC [9], [10], lo que pone de relieve la importancia de la hipermetilación del promotor en el proceso tumoral en los CRC.
Situado en el cromosoma 3q24, codifica una ZIC1 C
2 H
2 de tipo dedo de zinc factor de transcripción que juega un papel crítico en el desarrollo de la cresta neural y el cerebelo en los vertebrados [11] - [15]. Como factores de transcripción de dedos de zinc, proteínas de la familia ZIC pueden unirse a la secuencia rica en GC en genes diana [15]. A pesar de su papel en el desarrollo neural, ZIC1 también fue encontrado para participar en la progresión de los cánceres humanos, tales como meduloblastoma, cáncer de endometrio, y neoplasias mesenquimales [16] - [18]. Hemos identificado ZIC1 como una novela TSG candidato en el cáncer gástrico [19]. En apoyo de su papel en el cáncer, ZIC1 puede funcionar como un represor de la diana aguas abajo de sonic hedgehog (Shh), BMP (proteína morfogenética ósea), y así como jugar un papel en la vía de señalización de Notch durante el desarrollo del tubo neural [14], [15]. Sin embargo, la importancia biológica de la metilación del ADN, y el mecanismo molecular subyacente ZIC1 funcionar como un TSG en CRCs siguen siendo desconocidos. En este caso, nos informan de que el promotor ZIC1 es frecuentemente metilado en los tejidos CRC y líneas celulares de cáncer de colon. La expresión ectópica de ZIC1 conduce a la inhibición del crecimiento celular, y alterar la expresión de genes diana potenciales que pueden desempeñar un papel importante en la carcinogénesis colorrectal. Nuestros resultados sugieren que ZIC1 potencialmente pueden funcionar como un supresor tumoral novedoso funcional en los CRC.
Resultados
transcripcional silenciamiento de ZIC1 se asocia con su promotor hipermetilación en células de cáncer de colon
para determinar si ZIC1 es silenciado por la hipermetilación del promotor en el cáncer de colon, se analizó la expresión de ARNm ZIC1 en líneas celulares de cáncer de colon seis. Semi-RT-PCR cuantitativa mostró que ZIC1 transcripción fue silenciado o downregulated en todas las líneas celulares de cáncer de colon en comparación con tejido de colon normal (Figura 1A). El tratamiento desmetilación por Aza restaurado de manera espectacular la expresión de mRNA ZIC1 en un subconjunto de células de cáncer de colon (HCT116, HT29 y SW620) (Figura 1B), lo que implica que la metilación del ADN puede estar implicado en la regulación de la expresión ZIC1. Además, se empleó PCR específica de metilación (MSP) y se encontró que se detectaron tres líneas celulares de cáncer de colon (HCT116, DLD1 y SW620) con plena metilación. Las otras tres líneas celulares (HT29, LS180 y SW480) se encontraron con la metilación parcial. No metilación se detectó en los tejidos de colon normales (Figura 1C). Por lo tanto, estos resultados indican que el silencio transcripcional de ZIC1 en líneas celulares de cáncer de colon puede ser mediada por el promotor de la hipermetilación del ADN.
(A) La expresión de ZIC1 es silenciada o downregulated en líneas celulares de cáncer de colon, en comparación con los normales tejido de colon por RT-PCR. GAPDH se utilizó como control interno. de colon normal: tejidos de colon normales. (B) la expresión ZIC1 se restaura en las células de cáncer de colon (HCT116, HT29 y SW620) después del tratamiento con el agente de desmetilación 5-Aza por RT-PCR. AZA: 5-aza-2 'desoxicitidina. (C) El estado de metilación del promotor ZIC1 CpG se detecta mediante PCR específica de metilación (MSP) en líneas celulares de cáncer de colon. M: metilado; T:. Metilado
Regulación a la baja y la hipermetilación del promotor ZIC1 en los tumores primarios de colon
Para investigar más a fondo la relación entre la expresión ZIC1 y promotor hipermetilación, analizamos la expresión del ARNm y ZIC1 sitio CpG metilación estado del tumor colorrectal primario y tejidos no tumorales adyacentes de QRT-PCR y MSP, respectivamente. El nivel de ZIC1 mRNA fue significativamente disminuido en la mayoría de los tejidos tumorales en relación con los tejidos no tumorales adyacentes (
p
= 0,0001, n = 24) (Figura 2A). Además, se detectó la metilación del promotor en 85% (34/40) de los tejidos tumorales de colon, pero no en los tejidos no tumorales adyacentes mediante análisis de MSP (los datos representativos se muestran en la Figura 2B), lo que implica una hipermetilación específica de tumor del promotor ZIC1 en el CRC. Sin embargo, no hemos podido encontrar una correlación significativa entre el promotor ZIC1 metilación y características clínicas, tales como la edad, el género, la diferenciación del tumor y estadio TNM (Tabla 1).
expresión (A) ZIC1 ARNm se determinó mediante cuantitativa PCR en tiempo real en veinticuatro pares de tumor colorrectal primario y de acuerdo tejidos no tumorales adyacentes. Los datos se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon pares. (B) El estado de metilación del promotor ZIC1 en el carcinoma colorrectal primario y tejidos no tumorales adyacentes se determinó mediante MSP. se muestra la imagen representativa. tejidos tumorales;: T N: tejidos no tumorales adyacentes; M: metilado; T:. Metilado
ZIC1 inhibe la proliferación de células de cáncer de colon
Para explorar el efecto de ZIC1 sobre la proliferación celular en el cáncer de colon, se realizó la viabilidad celular y la formación de colonias Los ensayos en líneas celulares de CRC. En primer lugar, la eficiencia de transfección de nuestro constructo ZIC1 fue confirmada por RT-PCR y Western blot en líneas celulares tumorales (HCT116 y HT29) (Figura 3A). A continuación, se evaluó el efecto supresor de ZIC1 sobreexpresión en la proliferación celular mediante el ensayo de la viabilidad celular. Como se muestra en la Figura 3B, la expresión ectópica de ZIC1 viabilidad celular significativamente inhibida en las células HCT116 y HT29 (
p
& lt; 0,05). También se observó que el número de colonias supervivientes formados en las placas se redujo significativamente en comparación con los transfectantes de control del vector (
p
& lt; 0,01) (Figura 3C). Además, se reveló que la expresión ectópica de ZIC1 inhibe la fosforilación de Erk1 /2 y Akt quinasas (Figura 3D), dos reguladores clave de la vía de proliferación celular. Estos resultados confirman el efecto supresor de ZIC1 sobre la proliferación celular.
(A) re-expresión de ZIC en transfectantes estables en células de cáncer de colon (HCT116 y HT29) se confirmó mediante RT-PCR (carril superior) y occidental blot (bajo carril), GAPDH y β-actina utilizada como control interno. (B) Ensayo de viabilidad celular después de ZIC1 re-expresión en líneas celulares de colon (HCT116 y HT29). El número de células viables se midió por el ensayo de MTS después transfectadas transitoriamente con pCDNA3.1-ZIC1 o vector pCDNA3.1. El ensayo se realizó por triplicado. El asterisco indica significación estadística (
p Hotel & lt; 0,05). (C) El efecto de la inhibición de la proliferación celular por la expresión ectópica de ZIC1 se determinó por el ensayo de formación de colonias en células de cáncer de colon. El análisis cuantitativo de los números de colonias formadas en pcDNA3.1-Zic1 o vector pCDNA3.1 transfectantes se muestra en el diagrama de barra de la derecha en tres experimentos individuales en células HCT116 y HT29. El asterisco indica significación estadística (
p Hotel & lt; 0,05). (D) La expresión Phos-Akt y Phos-ERK1 /2, así como el total de Akt y ERK1 /2 se analizaron por Western blot. densidades de bandas se cuantificaron y los niveles de proteína (p-Akt, p-ERK1 /2) se normalizaron a ß-actina. Los valores de densitometría (Zic1 transfectantes) se expresan como factor de cambio en comparación con los transfectantes del vector valores normalizados a 1.
La expresión ectópica de ZIC1 induce apoptosis de las células
Para explorar los mecanismos subyacentes a la inhibición de la la proliferación de células por la expresión ectópica de ZIC1, se analizó la apoptosis celular y ciclo celular por citometría de flujo ensayo. Como se muestra en la Figura 4A, las células transfectadas con ZIC1 inducida por apoptosis de las células. Además, nuestros resultados mostraron que la re-expresión de ZIC1 dio lugar a la activación de cascadas relacionados con la apoptosis, incluyendo la escisión de caspase3, regulación a la baja de Bcl-XL, y dephosporylation Bad (Figura 4B). Estos resultados indican que la inducción de la apoptosis de las células a través de la sobreexpresión de ZIC1 está mediada por la Bcl-xl /Bad Caspase3 cascada /. Sin embargo, re-expresión de ZIC1 no afectó a la progresión del ciclo celular (datos no presentados)
.
apoptosis (A) de la célula se detectó mediante el ensayo de citometría de flujo Annuexin V-PI. Las figuras representativas se muestran tras transfectadas transitoriamente con ZIC1 o el control de vectores después de 48 horas en células HT29 y HCT116. Región A1 indica células apoptóticas temprano, A2 muestra células apoptóticas tarde. (B) Análisis de transferencia Western de las proteínas reguladas apoptóticos. La expresión de fosfo-malo y lo malo, Bcl-XL, caspase3-troceados, y Caspase3 se detectaron después de transected con ZIC1 o el control del vector en líneas celulares de cáncer de colon (HT29 y HCT116). densidades de bandas se cuantificaron y los niveles de proteína (p-Bad, Bad, Bcl-XL, y se escindió-caspase3) se normalizaron a ß-actina. Los valores de densitometría (Zic1 transfectantes) se expresan como factor de cambio en comparación con los valores transfectantes vector normalizado a 1.
cambios
perfil de expresión génica mediante la expresión ectópica ZIC1 exógeno
Para buscar genes diana de ZIC1 en células de cáncer de colon, hemos utilizado cDNA microarray para analizar genes cambios en el perfil de expresión inducidos por la expresión ectópica de ZIC1. Este análisis reveló que 337 genes fueron regulados a la baja y 95 genes se upregulated por la expresión exógena de ZIC1 cuando se utiliza un cambio de 2 veces de la expresión como umbral (genes representativos se muestra en la Figura 5A). Como se muestra en la Tabla 2, muchos de estos genes se ha informado que desempeñan papeles importantes en la proliferación celular y la apoptosis. Para confirmar el patrón de expresión observado en el microarray, hemos validado la expresión de 10 genes seleccionados en células de cáncer de colon transfectadas con ZIC1 de QRT-PCR. Los resultados mostraron que
CCNA2 gratis (cilin A2) y
IGFBP3 gratis (factor de crecimiento similar a la insulina proteína transportadora 3) fueron upregulated significativamente (& gt; 2 veces el cambio), mientras que
ANGPT2
(angiopoyetina 2),
GADD45B gratis (detención del crecimiento y daño del ADN-inducible, beta),
LAMB2 gratis (laminina, beta 2),
LAMB3 gratis (laminina , beta 3),
MALAT1 gratis (metástasis pulmonar asociada adenocarcinoma de transcripción 1),
PNMA2 gratis (paraneoplásico MA2 antígeno),
RPA4 gratis (proteína de replicación A4), y
TACSTD2
(transductor asociado a un tumor señal de calcio 2) (& lt; -2 veces el cambio) se downregulated por la sobreexpresión de ZIC1 en células HCT116 y HT29 (Figura 5B y Tabla S1). Estos datos fueron concordantes con los obtenidos a partir del análisis de microarrays.
(A) La expresión diferencial de genes en los perfiles Zic1 o vector de control transfectantes estables se visualizó usando Java Treeview en líneas celulares HCT116. representante genes más de doble cambio se indican en la parte derecha de esta imagen. (B) Los genes cantidad transcripción de 10 genes seleccionados se midió mediante qRT-PCR y calcula utilizando el valor de 2
- △△ CT. la expresión génica relativa en transfectantes Zic1 se comparó con el vector de control vacío, que se normalizó como valor de referencia de 1,0. Las barras blancas indican el resultado del análisis de microarrays, y las barras de negro representante de QRT-PCR datos en la línea celular HCT116.
Discusión
En el presente estudio, se encontró que ZIC1 fue silenciado o downregulated en líneas celulares de cáncer de colon, así como en los tejidos tumorales primarios en relación con los tejidos no tumorales adyacentes (
p
& lt; 0,05). Por otra parte, nuestras observaciones identifican que la hipermetilación del promotor del ADN contribuye a ZIC1 silenciamiento o la regulación a la baja en los CRC. Estos resultados son consistentes con nuestro estudio anterior de ZIC1 en el cáncer gástrico [19], lo que indica que el promotor CpG methlyation es el mecanismo predominante para ZIC1 regulación a la baja. Sin embargo, no podemos excluir la aparición de otros mecanismos de silenciamiento de ZIC1, como las histonas o remodelación nucleosoma. Por ejemplo, la expresión ZIC1 no pudo ser restaurada después del tratamiento Aza en LS180 y las líneas celulares SW480 (datos no mostrados). Estudios recientes muestran que la metilación de la histona H
3 en la lisina 27 está vinculado a ZIC1 silenciamiento en células madre embrionarias [18]. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina muestran que la expresión de ZIC1 se asocia con la histona H
3 dimethylation en la lisina 4 en los tumores desmoides y células MEF [18].
A pesar de la ilustración de la función crítica de ZIC1 en vertebrados desarrollo [ ,,,0],13], [15], sigue siendo en gran medida desconocido caracterización funcional de ZIC1 en la carcinogénesis. Aquí, nuestros resultados muestran que ZIC1 exógeno inhibe la proliferación celular a través de p-Akt y p-Erk1 /2 inactivación en células de cáncer de colon. PI
3K /Akt y MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno) vías de señalización son bien conocidos para funcionar como componentes cruciales de la proliferación celular en células tumorales [20], [21]. Akt y Erk1 /2, una vez activado por fosforilación, pueden funcionar como efectores clave de la PI
3K y MAPK vías de señalización para promover la supervivencia y la proliferación [20] de células - [24]. Por lo tanto, ZIC1 puede mediar la proliferación celular a través de PI
3K /Akt y MAPK en células de cáncer de colon. Además, se encontró que la expresión ectópica de ZIC1 puede inducir la apoptosis de células de cáncer de colon. Entre el amplio espectro de proteínas y genes implicados en la apoptosis, los miembros de la familia Bcl-2 desempeñan un papel central en este proceso [25], [26]. Caspasa-3 ha sido identificado como un mediador clave de la apoptosis en células de mamífero, y la fosforilación de Bad puede bloquear su función apoptótica [22], [25], [26]. En este sentido, se encontró que la expresión de escindido con caspase3 y Bad fueron inducidos, mientras fosfo-Bad y Bcl-XL fueron suprimidos por la re-expresión de ZIC1. Nuestros resultados sugieren que la inducción de la apoptosis por ZIC1 puede estar asociada con Bcl-xl /Bad Caspase3 cascada /en células de cáncer de colon.
En un intento de identificar objetivos de abajo ZIC1 en CRC, se analizaron los perfiles de expresión génica de cáncer de colon células con o sin ZIC1 sobreexpresión. Los resultados revelaron que 337 genes fueron regulados a la baja y 95 genes se upregulated por ZIC1 (nuevos genes representativos mostrados en la Tabla 2). Muchos de estos genes se han relacionado con el crecimiento celular, la apoptosis, la adhesión, la angiogénesis y la transducción de señales en la tumorigénesis [27] - [33]. Por ejemplo, ZIC1 reprime la expresión de
GADD45B
.
GADD45B
es inducida por la activación de la p38 /JNK (quinasa c-Jun N-terminal) vía [27], y un importante mediador de la diafonía NF-kappa B-JNK y apoptosis de las células [28]. JNK es otro componente importante de aguas abajo de las cascadas de MAPK, y se asocia con el crecimiento celular y la respuesta celular al daño del DNA [21], [23], [24]. Además, se encontró que ZIC1 aumentó la expresión de
RSU1
(Ras supresor de proteína 1), que se informó para elevar los niveles de p21
inhibidor de CDK CIP, así como inactivate Jun y Rho-dependiente quinasas EGF en virtud de la estimulación [29]. Con nuestro hallazgo de ZIC supresión de p-ERK1 /2, proponemos que ZIC1 puede regular las vías de MAPK mediada por quinasas ERK y JNK. Se requieren más estudios para ilustrar los mecanismos por los cuales ZIC1 regula estas vías potenciales en la progresión del cáncer. Por otra parte, hemos demostrado que ZIC1 puede suprimir la expresión de otros genes novedosos (
TACSTD2
,
ANGPT2
,
LAMB2, LAMB3
y
MALAT1
etc. ) relacionados con la angiogénesis tumoral y la metástasis.
TACSTD2
se ha encontrado asociado con la agresividad del tumor y de mal pronóstico en los tumores de células epiteliales, como el de colon y cáncer de estómago [30], [31].
ANGPT2
está emergiendo como un regulador clave de la remodelación vascular durante la angiogénesis del tumor [32], [33].
Como factores de transcripción con dedos de zinc, la familia de proteínas ZIC se puede unir a rica en GC secuencias en genes diana [13], [15]. ZIC1 puede regular los genes diana en ambos específicos de secuencia y secuencia independiente modales [15]. Dependiendo de sus compañeros de interacción, las proteínas ZIC pueden activar o suprimir la transcripción de genes diana. Como era de esperar, se observó que ZIC1 regulada la expresión de importantes factores de transcripción tales como
RPS2
,
Ntf3
,
PRDM16
,
KLF15
,
SHC2
y
Foxj1 gratis (Tabla S2). ZIC1 se ha demostrado para contrarrestar con Gli (glioma asociada oncogén homólogo 1), que funciona como aguas abajo de sonic hedgehog (Shh) vía de señalización y participan en la progresión del cáncer de colon [34] - [36]. Mientras tanto, muchos de objetivos de abajo ZIC1 incluyendo Notch, ciclina D1, y Wnt3a han sido revisados en los modelos de desarrollo y animales neuronales [15], [37]. Estos genes son bien conocidos por jugar un papel vital en el desarrollo del cáncer. El estudio de los genes diana Zic1 puede proporcionar más información sobre los posibles mecanismos de ZIC1 que actúa como un supresor de tumores en los CRC.
En resumen, que reveló que una novela ZIC1 gen supresor de tumores se inactivó mediante la metilación del promotor de cáncer de colon Células. ZIC1 también se downregulated y con frecuencia hypermethylated en tejidos de cáncer colorrectal primario. ZIC1 inhibe la proliferación celular a través de la supresión de la PI
3k MAPK y las vías, inducción de la apoptosis celular a través de la Bcl-XL /Bad Caspase3 cascada /, la regulación de abajo objetivos y vías implicados en la carcinogénesis colorrectal.
Materiales y métodos
cultivo de células y muestras de tejido
Las líneas celulares de cáncer de colon humano (HCT116, HT29, DLD1, LS180, SW480 y SW620) se obtuvieron a partir de Riken gene Bank (Japón) y la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). línea celular HCT116 se cultivó en medio 5A de McCoy (Invitrogen, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal 10%, todas las demás líneas celulares se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal 10%. Todas las líneas celulares se incubaron a 5% de CO
2, 37 ° C y 95% de humedad.
Cuarenta adenocarcinomas de colon resecado especímenes quirúrgicos y no tumorales adyacentes se obtuvieron de Sir Run Run Shaw Hospital de la Facultad de Medicina la Universidad de Zhejiang. CRC se clasificó de acuerdo a la Unión Internacional contra el Cáncer Criterios y se escenifica con el sistema tumor-nódulo-metástasis (TNM). Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan en -80 ° C hasta su posterior procesamiento. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la obtención de las muestras de estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Sir Run Run Shaw.
desmetilación del ADN farmacológico con 5-Aza-2'- desoxicitidina
Las células fueron tratadas durante 72 horas con 5 M 5-
aza
-2 '-
desoxicitidina gratis (aza) (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.), un inhibidor de la metiltransferasa bien utilizado. Aza se reponía cada 24 horas. Una concentración equivalente de vehículo (DMSO) se utilizó como control.
RT-PCR y PCR cuantitativa análisis
El ARN total (1 g) se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo el fabricante del la instrucción, a continuación, a transcripción inversa en ADNc con alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Applied Biosystems). RT-PCR se llevó a cabo durante 35 ciclos (95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s). El producto de PCR se sometió a electroforesis en agarosa al 2% y se tiñó con bromuro de etidio. Quantitative PCR en tiempo real (qRT-PCR) se realizó con el kit SYBR Green Mix Master (Takara, Japón) en ABI 7500 sistema de PCR. El nivel de transcripción de genes relativa se normalizó al gen de mantenimiento (GAPDH), utilizando el método 2
-ΔΔCt. Todas las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla S3.
tratamiento con bisulfito del ADN y PCR específica de metilación (MSP)
ADN genómico (1 mg) fue tratado con bisulfito con el Kit de modificación del ADN Zymo (Zymo Investigación , ESTADOS UNIDOS). estado de metilación de ZIC1 se detectó por PCR específica de metilación (MSP) utilizando el bisulfito tratados ADN genómico como molde. MSP se llevó a cabo durante 40 ciclos con la temperatura de recocido a 60 ° C, como se describe anteriormente [38], [39]. Metilación (M) cebadores fueron: 5'-F GGATTTTTTGTTTCGTAATC, R-5 'CCCGTTAACCACGTTAAACG, y no metilación (U) cebadores fueron:. F-5' GGGATTTTTTGTTTTGTAATT, R-5 'CCCATTAACCACATTAAACA
transfección de células y la viabilidad celular ensayo de
Para construir un plásmido de expresión ZIC1, el marco de lectura abierto de longitud completa ZIC1 se clonó en mamíferos pcDNA3.1 vector de expresión como se describe anterior [19]. Para generar la transfección las células estables, las células HCT116 y HT29 fueron transfectadas con pCDNA3.1-ZIC1 o vector pCDNA3.1 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y seleccionados por G418 (400 mg /ml) durante 14 días en una placa de 12 pocillos. La sobreexpresión de ZIC1 fue confirmada por RT-PCR y Western blot en las colonias supervivientes. Entonces estas poblaciones heterogéneas estables de células se transfirieron en placa de 6 pocillos a la selección continua con G418 para estudios adicionales.
La viabilidad celular se determinó por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2- (4-sulfofenilo) 2H -tetrazolium (MTS) reactivos (Promega, Madison, EE.UU.). Brevemente, las células HCT116 y HT29 se cultivaron 24 horas en una placa de 12 pocillos y se transfectaron de forma transitoria con pCDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1. Entonces se sembraron estas células en 96 pocillos (2000-4000 células /pocillo) durante 48 horas. Después de la incubación con CellTiter 96 Aqueous One Solution reactivo durante 1 hora, se midió la absorbancia a 490 nm de acuerdo con la instrucción de MTS.
Colonia ensayo de formación de
células HCT116 y HT29 se cultivaron en 12 - placa de pocillos (1,0 x 10
5 células /pocillo) durante 24 horas y se transfectaron con pCDNA3.1-ZIC1 o vector pCDNA3.1. Después de 48 horas, los transfectantes fueron re-sembraron en placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 12-20 días en medio de cultivo que contienen G418 (400 mg /ml). Las colonias supervivientes se tiñeron con genciana Violer después de la fijación metanol y colonias visibles (≥ 50 células) se contaron. Los experimentos se realizaron por triplicado. Se realizaron
apoptosis de la célula y del ciclo celular análisis
ensayos de apoptosis de las células usando el kit de anexina V /PI (Invitrogen) por citometría de flujo análisis (FCA). Brevemente, las células transfectadas transitoriamente (HCT116, HT29) se suspendieron en tampón de unión de anexina-, se añadieron Alexa Fluor 488 anexina V y la solución de trabajo PI en secuencia. Las células teñidas se analizaron finalmente por el flujo FACScan citometría de flujo (Becton Dickinson, EE.UU.) a 560 nm. Mientras tanto, 2 × 10
5 células sembradas fueron expuestos a la luz ultravioleta para inducir la apoptosis como control positivo.
distribución del ciclo celular se detectó por el kit Cycletest Plus reactivo DNA (Becton Dickinson, EE.UU.). Brevemente, se recogieron y se lavaron en PBS células transfectadas, el ADN celular se tiñó con 125 mg /ml de yoduro de propidio durante 20 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Después, las células fueron ordenados por FACS Calibur y la distribución del ciclo celular se determinó utilizando el software ModFit LT (Phoenix, EE.UU.).
Western blot
Las proteínas totales se extrajeron a partir de células transfectadas de forma estable usando tampón de lisis RIPA. Los lisados (20-60 g) se resolvieron en gel de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Las transferencias se sondearon con ZIC1 (1:500; Abcam), Caspase3 (1:500; Sigma-Aldrich), Bcl-XL (1:500; Sigma), Bad (1:500; Abnova), fosfo-Bad (1 :1000; Cell Signaling), Akt (1:500; Abcam), fosfo-Akt (1:2000; Cell Signaling), ERK1 /2 (p44 /42) (1:1000; Cell Signaling), fosfato ERK1 /2 (p44 /42) (1:2000; Señalización celular) y β-actina (1:2500, Multisciences Biotech) anticuerpos. Las transferencias fueron desarrolladas utilizando quimioluminiscencia con un Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japón).
cDNA microarray análisis y validación
Se filtraron los estudios de microarrays para identificar los que perfila la expresión génica en ZIC1 o vector de control de línea celular transfectada de manera estable (HCT116) basado en la plataforma Affymetrix. cDNA se transcribe en cRNA con la unión aaUTP, que permiten la incorporación de tinte fluorescente Cy3 (pcDNA3.1-ZIC1) o Cy5 (pCDNA3.1). Finalmente, las muestras marcadas se hibridan con Agilent genoma humano completo que contiene 41.000 sondas y transcripciones. experimentos por duplicado se llevaron a cabo. Seleccionamos registro
2 relación ≥1 o ≤-1 como el umbral para la regulación positiva o regulación a la baja de la expresión génica.
El candidato ZIC1 genes diana fueron clasificados en diferentes subgrupos de acuerdo con sus funciones biológicas (proliferación celular, la migración, y la angiogénesis, etc.). Diez representantes de los genes diana:
ANGPT2
,
CCNA2
,
GADD45B
,
IGFBP3
,
LAMB2
,
LAMB3
,
MALAT1
,
PNMA2
,
RPA4
y
TACSTD2
fueron verificados con QRT-PCR en Zic1 o vector de control transfectantes en HCT116 y células HT29.
El análisis estadístico
de Student
t
y Test de Wilcoxon se realizaron pruebas para comparar con los datos de dos independientes, mientras que los métodos de prueba exacta de Chi-cuadrado o el pescador de análisis de las variables categóricas. Un
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Apoyo a la Información sobre Table S1..
doble cambio (FC) de los genes seleccionados en Zic1 transfecants fueron detectados por microarrays de ADNc y QRT-PCR. Doble cambio (FC): ZIC1 frente al vector de control
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016916.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. | Perfil La expresión del gen representante asociado con regulador de la transcripción y transducción de señales en Zic1 transfectantes en comparación con el control de vector vacío (doble cambio) por microarrays de ADNc en las células HCT116. Doble cambio:. ZIC1 frente al vector de control
doi: 10.1371 /journal.pone.0016916.s002 gratis (DOC) sobre Table S3. secuencias
cebador utilizado para cuantitativa en tiempo real PCR.
doi: 10.1371 /journal.pone.0016916.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Guo Lei útil para sugerencias; El Dr. Yan Shan, Xiaotong Hu y Fubiao Zhang por su excelente asistencia técnica; y el Dr. Manish Gala para la revisión crítica del manuscrito.