Extracto
Antecedentes
Varios miembros de la familia de proteínas con dedos de zinc han sido recientemente demostrado tener un papel en la iniciación y progresión del cáncer. proteína de dedo de cinc 367 (
ZNF367
) es un miembro de la familia de proteínas de dedo de zinc y se expresa en tejido eritroide fetal o embrionario pero está ausente en el tejido adulto normal.
Metodología /Principales conclusiones
se demuestra que
ZNF367
se sobreexpresa en el carcinoma de la corteza suprarrenal, feocromocitoma maligno /paraganglioma y el cáncer de tiroides en comparación con el tejido normal y tumores benignos. El uso de ambos desmontables funcional y sobreexpresión ectópica en múltiples líneas celulares, se muestra que
ZNF367
inhibe la proliferación celular, la invasión, la migración y la adhesión a las proteínas extracelulares
in vitro
y
in vivo
. gen integrado y la expresión de microARN análisis mostraron una correlación inversa entre el
ZNF367
y miR-195 expresión. Los ensayos de luciferasa demostraron que el miR-195 regula directamente
ZNF367
expresión y que el miR-195 regula la invasión celular. Por otra parte, la integrina alfa 3 (
ITGA3
) expresión estaba regulada por
ZNF367
.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos sugieren que toman juntos
ZNF367
regula la progresión del cáncer
Visto:. Jain M, Zhang L, M Boufraqech, Liu-Chittenden Y, K Bussey, Demeure MJ, et al. (2014)
ZNF367
inhibe la progresión del cáncer y está dirigido por el miR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10.1371 /journal.pone.0101423
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de febrero de 2014; Aceptado: 6 Junio 2014; Publicado: 21 de julio 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramural del Centro para la Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Algunos de los co-autores son empleados de una empresa comercial -SAIC Frederick INC, no hay conflicto de intereses. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Nuestro conocimiento de los eventos biológicos que inhiben o promueven la diseminación metastásica del cáncer endocrino localmente y para sitios distantes es limitado [1]. La comprensión de los eventos moleculares implicados en la progresión del cáncer tiene implicaciones importantes para la identificación de objetivos para el beneficio terapéutico. Genomic, genéticos y epigenéticos enfoques se han utilizado para identificar cambios en los genes /las vías, factores de transcripción, o firmas de genes mediante la comparación de lo normal, tumores primarios, y /o metástasis. Sin embargo, estos análisis no han distinguido entre menudo promotores, inhibidores, o marcadores de pasajeros en la iniciación y progresión del cáncer, y rara vez definir un mecanismo específico para la expresión génica desregulada.
cánceres endocrinos son un grupo diverso de enfermedades malignas que muestran el completo espectro de comportamiento biológico de los tumores malignos: el crecimiento de los cánceres indolentes para rápidamente progresivas con una baja supervivencia. Por lo tanto, los cánceres endocrinos representan un modelo excelente para el estudio de los factores moleculares que influyen en la iniciación y progresión del cáncer. La identificación de cambios genéticos comunes a estos tipos de tumores endocrino diversamente comportándose se ha demostrado que desempeñan un papel importante en muchos tipos de cánceres humanos. Por ejemplo,
BRAF
mutaciones son muy frecuentes en el cáncer de tiroides y otros tipos de cáncer, y están asociados con una enfermedad más agresiva de cáncer de tiroides [2], [3].
SDHB
mutaciones fueron identificadas inicialmente en paraganglioma familiar, pero más tarde se encontró que eran frecuentes en los cánceres de riñón y los tumores del estroma gastrointestinal y tumores hipofisarios recientemente [2], [4], [5]. Por lo tanto, el descubrimiento de los cambios moleculares asociados a la iniciación del cáncer endocrino y /o progresión es probable que desempeñe un papel importante en un amplio grupo de enfermedades malignas humanas.
En este estudio, se determinó el mecanismo de regulación de la expresión génica y la función de
ZNF367
en una variedad de cánceres del sistema endocrino (cáncer papilar de tiroides, el carcinoma de la corteza suprarrenal, feocromocitoma /paraganglioma).
ZNF367 gratis (también conocido como
ZFF29
y
CDC14B
) es un miembro de la familia de proteínas con dedos de zinc, con un motivo único dedo Cys2His2 cinc, se expresa en embriones o fetal tejido eritroide, y está ausente en otros tejidos adultos normales [6], [7]. Recientemente, se han encontrado varias proteínas con dedos de zinc que se dysregulated en el cáncer, para funcionar como supresores /promotores de tumores, y para hacer que la resistencia a la quimioterapia [8] - [10]. Sin embargo, el papel de
ZNF367
en el cáncer no se ha investigado. En este caso, nos informan de que
ZNF367
se sobreexpresa en una variedad de cánceres del sistema endocrino y que inhibe
in vitro en
y
in vivo
el crecimiento, la invasión celular, la migración y la adhesión . Por otra parte,
ZNF367
sobreexpresión se asocia con la pérdida de miR-195 expresión, que se dirige directamente a
ZNF367
. Por último,
ITGA3
se reduce con el
ZNF367
sobreexpresión, se establece un miR-195-
ZNF367 CD -
ITGA3
eje que funciona para inhibir la progresión del cáncer.
Métodos
Las muestras de tejido y estudios en animales
Las muestras de tejido fueron adquiridos en un protocolo clínico aprobado por la Junta de Revisión Institucional después de obtener el consentimiento informado por escrito (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01005654) . Las muestras de tejido se recogieron en el momento de la cirugía, y fueron inmediatamente se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C. Uno de ciento y cinco por la corteza suprarrenal humana (19 córtex adrenal normal, 79 adenomas corticales, 7 carcinomas de la corteza suprarrenal), 47 de tejido tiroideo (8 normales, 39 cáncer papilar de tiroides), y 68 (19 médula adrenal normales, 28 benignos, 21 maligna /paraganglioma) muestras de tejido de feocromocitoma se utilizaron en este estudio. Todo diagnóstico fue confirmado por un patólogo endocrino, y se confirmaron las muestras tumorales para contener ≥ 80% de células tumorales /núcleos. El diagnóstico de carcinoma de la corteza suprarrenal y malignos feocromocitoma /paraganglioma se basó en la presencia de invasión local bruto y /o metástasis a distancia y una puntuación de Weiss & gt; 3 para el carcinoma de la corteza suprarrenal. corteza suprarrenal y la médula normales se obtuvieron de donantes de órganos sanos utilizando láser captura microdissection virtud de un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Dos conjuntos de datos disponibles públicamente de análisis de la expresión de genes en todo el genoma en muestras de tumores adrenocorticales se utilizaron para evaluar
ZNF367 expresión del ARNm gratis (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 y http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).
el Comité de cuidado de animales y el empleo Instituto Nacional del cáncer aprobó los protocolos para el cuidado de los animales y gastos en el presente estudiar. Cualquier ratón que experimenta signos neurológicos significativamente anormales, sangrado de cualquier orificio, problemas de movilidad, pérdida de peso rápida, debilitante diarrea, pelo áspero, postura encorvada, dificultad para respirar, letargo, decúbito persistente, ictericia, anemia, trauma autoinducido, se convierte moribundos o de lo contrario se vuelve incapaz de obtener alimentos o agua, o con un tumor de 2 cm o más de diámetro ha sido inmediatamente sacrificados por CO
2 cámara.
líneas celulares, cultivo celular, reactivos, siRNA, y miR 195 transfección
La línea celular de carcinoma de la corteza suprarrenal SW13 (ATCC, Rockville, MD) se cultiva y se mantiene en medio DMEM suplementado con 1% de selenio transferrina insulina (STI; BD Biosciences, San Jose, CA) y el 2,5% Nu -suero I (BD Biosciences) en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. La línea celular de carcinoma adrenocortical BD140A fue proporcionado amablemente por el Dr. Kimberly Bussey (TGen, Pheonix, Arizona), y se cultivó en medio RPMI suplementado con 10% de SFB (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de penicilina-estreptomicina, y 1 % de L-glutamato. El cáncer humano papilar de tiroides (TPC-1) línea celular se mantuvo en DMEM suplementado con FBS, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml), fungizona (250 ng /ml), TSH (10 IU /L ), y la insulina (10 mg /ml). Las células humanas de riñón embrionario (HEK293) se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FBS, 1% Pen-strep (Gibco, Grand Island, NY), y 1% de L-glutamato (Gibco). Todas las líneas celulares fueron autenticados por corto repetir tándem perfilado el 14 de octubre, 2012.
ZNF367 siRNAs (s46962, s46963) y ARNip de control negativo (AM4613) se utilizaron a una concentración final de 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, CA). Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) se utilizó para la transfección de células de siRNAs. Madura miARN precursor, pre-miR-195, y el control pre-miR-negativo secuencia aleatoria (Applied Biosystems) a 5 nM se transfectaron en células SW13 utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para
ZNF367
sobreexpresión en células HEK293, las células (8 × 10
5 en cada uno de 6 pocillos) fueron transfectadas con un
ZNF367
cDNA constructo o un vector vacío (OriGene, Rockville, MD ) usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
la inmunohistoquímica
fijados en formalina y secciones de tejido incluidas en parafina se des-con parafina y luego rehidratados usando xileno y etanol. La recuperación del antígeno se completó utilizando un 10% de tampón de citrato pH 6,0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) en una olla de presión a 120 ° C durante 10 minutos. Las secciones de tejido se incubaron con peróxido de hidrógeno 6% a apagar la actividad de la peroxidasa endógena durante 30 minutos (Dako, Carpinteria, CA), seguido de la incubación con suero durante una hora (Dako, Carpinteria, CA). anti-ZNF367 anticuerpo policlonal de conejo primaria (Sigma, St. Louis, MO; HPA015785) en 5 g de dilución /ml se utilizó durante la noche a 4 ° C. Anti-conejo anticuerpo secundario se utilizó (Dako Envision anti-conejo, Carpinteria, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron desarrolladas utilizando 3,3'-diaminobencidina como cromógeno DAB (Dako, Carpinteria, CA), y se contratiñeron con hematoxilina. Las secciones se deshidrataron y se montaron con el montaje vectamount medio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La inmunotinción de ZNF367 fue evaluada por microscopía de luz (Nikon, Tokio, Japón), y las imágenes escaneadas con 20 aumentos.
preparación de ARN, la transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN se aisló usando el reactivo TRIzol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). El ARN total (200 a 500 ng) fue inverso-transcrito utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad, y el ADNc se amplificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de PCR y sondas para
ZNF367 gratis (Hs00400665_m1),
ITGA3 gratis (Hs01076873_m1), y
GAPDH gratis (Hs_99999905_m1) se obtuvieron de Applied Biosystems.
Western blot
Los lisados se prepararon con 1% de SDS plus mM Tris [pH 7,5] tampón 10, y Western blot se realizó el 10% de gel de SDS-PAGE. anticuerpos policlonales de conejo primarias, anti-ZNF367 (HPA015785; Sigma, MO) y anti-ITGA3 (Sigma; SAB1100194) se usaron a 5 mg /ml y 2 mg /ml, respectivamente, y anti-GAPDH (sc-32233; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) se utilizó a una dilución 1:1,000. anticuerpo secundario anti-conejo se utilizó en 1:5,000 dilución (Señalización Celular, Danvers, MA).
La proliferación celular
Las células se sembraron a una concentración de 2.000 células en una placa de 96 pocillos en seis repeticiones. Se utilizó el kit de ensayo CyQUANT ™ (Invitrogen) para evaluar el número de células, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
ensayo clonogénico
células HEK293 (8 × 10
5) fueron transfectadas con el vector vacío o
ZNF367
construyen. Después de 24 horas, las células se trataron con tripsina, se volvieron a suspender en los medios de comunicación, y se cuentan. Las células fueron re-sembradas en placas de 6 pocillos a 250, 500 y 1.000 células. Después de 10 días, se retiró el medio de los pocillos y se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. Las colonias se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y se tiñeron con 2 ml de cristal violeta durante 60 minutos sobre una plataforma oscilante. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se seca al aire, y las colonias fueron fotografiados en FluorChem Imager (San Jose, CA).
invasión celular y la migración de ensayo
invasión celular y la migración eran evaluó a través de la Cámara BioCoat Matrigel invasión BD (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 1 × 10
5 células fueron sembradas en los insertos (membranas de policarbonato de tamaño de poro 8-M) con y sin una capa delgada de la capa de Matrigel membrana basal Matrix (BD Biosciences). Los insertos se colocaron en pocillos de fondo, con 10% de medio de cultivo que contiene suero como un quimioatrayente. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ° C. Las células que invadieron la matriz de Matrigel o que migraron a través de los poros sin la matriz de Matrigel a la superficie inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas con Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ) y se contaron bajo un microscopio de luz en cuatro campos separados con foto software de J (NIH, Bethesda, MD).
la adhesión celular ensayo
SW13 células fueron transfectadas con
ZNF367
siRNA y el control negativo. Después de 120 horas de la transfección, se tripsinizaron las células, y 1 × 10
5 células se sembraron en una placa de 48 pocillos que contiene cinco moléculas de adhesión (fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina I, y fibrinógeno) y se incubaron a 37 ° C durante 90 minutos según las instrucciones del fabricante (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Los pocillos se lavaron dos veces con PBS, y se añadieron 200 l de la solución de tinción y se incubaron durante 10 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con agua desionizada. Los pocillos se secaron-aire, y se añadieron 200 l de la solución de extracción y se incubaron durante 10 minutos. Un total de 150 l se transfirió de cada muestra extraída a una placa de 96 pocillos, y se midió la absorbencia a 560 nm en un lector de microplacas SpectraMax M5e (Sunnyvale, CA).
Genoma toda la expresión de mRNA de microarrays
SW13 células fueron transfectadas con
ZNF367
siRNA y el control negativo por triplicado. Después de la transfección, el RNA total se extrajo usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA transcripción inversa, síntesis, amplificación, la fragmentación y la denominación de los terminales de 150 ng de ARN total se realizaron utilizando el GeneChip WT Sentido Meta Etiquetado y reactivos de control (Affymetrix, Santa Clara, CA). Un total de 25 ng /l de ADNc se hibridó a la Affymetrix Human Gene 1,0 ST GeneChip matriz. Pathway análisis se realizó utilizando los recursos de bioinformática David (http://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).
in silico
identificación de microRNA orientación ZNF367
bases de datos (MIR Objeto de Análisis (http://www.targetscan.org) y mirDB (http://mirdb.org/miRDB/) se utilizaron para identificar micro ARN que pueden apuntar a
ZNF367
. microARN candidatos predicho para apuntar
ZNF367
luego se analizaron para determinar si fueron expresados diferencialmente en carcioma adrenocortical y cáncer papilar de tiroides.
luciferasa ensayo
de tipo salvaje
ZNF367
3'UTR se clonó en la construcción GoClone (Conmutación de Genomics, Menlo Park, CA). el constructo mutante de
ZNF367
3'UTR se obtuvo mediante la introducción de la mutación en los tres primeros nucleótidos de la región de semillas (143-150, GCTGCTA - CGAGCTA). para el miR-195 de tipo salvaje
ZNF367
3'UTR o mutante
ZNF367
3'UTR y el vector vacío con pre 3'UTR miR-195 o pre-NC fueron co-transfectadas en células SW13 (Conmutación de Genómica). El método de normalización de la eficacia de transfección en el ensayo indicador de luciferasa fue de acuerdo a la recomendación de la aparamenta Genómica (Menlo Park, CA) con el vector vacío utilizado como control positivo para la transfección. El vector vacío 3'UTR contiene un promotor constitutivo (que se encuentra en todos los constructos de UTR) y el gen de luciferasa (RenSP). Esta construcción sirve como control positivo para la transfección. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se co-transfectaron con 5 nM de miR-195 o el control negativo (Applied Biosystems), 0,12 g del vector (Conmutación de Genómica), y 0,75 l de Lipofectamine (Invitrogen). La luminiscencia se leyó después de 24 horas con el sistema de ensayo Interruptor de luz, utilizando un lector de microplacas SpectraMax M5e.
in vivo de xenoinjertos
ensayo
atímicos ratones hembra desnudos (de cinco a se obtuvieron 20-22 g) del Laboratorio Nacional de Frederick instalaciones de los animales de investigación del cáncer (Frederick, MD): peso corporal, seis semanas de edad. Después de 48 horas de la transfección con
ZNF367
siRNA y el control negativo, tres millones de células se resuspendieron en 100 l de DMEM y Matrigel (01:01), y se inyectaron en el flanco de ratones desnudos atímicos .
Los análisis estadísticos
Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar (SD) o el error estándar de la media (SEM). Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los datos no paramétrico de tres o más grupos. La prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney se utilizó para comparar las diferencias entre los dos grupos para las variables paramétricas y no paramétricas, respectivamente. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para identificar correlaciones entre los dos grupos. Un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. El análisis estadístico se completó utilizando Graph Pad Prism 5.0 software estadístico.
Resultados
ZNF367
se sobreexpresa en el cáncer
ZNF367 es
sobreexpresa en el carcinoma adrenocortical, cáncer de tiroides papilar, y malignos feocromocitoma /paraganglioma, en comparación con muestras de tejido benigno y normal para cada tipo de tumor (p & lt; 0,05; Figura 1). ZNF367 expresión de la proteína estaba presente en el núcleo y el citoplasma. No era más fuerte tinción ZNF367 en el núcleo que en el citoplasma en cada muestra de cáncer (cáncer adrenocortical, cáncer de tiroides papilar y maligno feocromocitoma /paraganglioma). Para confirmar la expresión elevada de
ZNF367
en el carcinoma adrenocortical en un conjunto mayor de muestras, se analizaron los perfiles de expresión de datos de bases de datos disponibles públicamente depositados en ómnibus expresión génica. En dos conjuntos de datos de expresión de genes en todo el genoma independientes,
ZNF367
se sobreexpresa en el carcinoma de la corteza suprarrenal en comparación con adenoma suprarrenal cortical y muestras de tejidos normales (P & lt; 0,001; Figura S1). Estos hallazgos sugieren que
ZNF367
se sobreexpresa en una variedad de cánceres, con resultados consistentes a través de diferentes análisis y plataformas genómicas utilizadas
.
(A y B) El nivel de expresión en la corteza adrenal normal, benigna adenomas suprarrenales, y carcinomas de la corteza suprarrenal; (C y D) la médula adrenal normal, muestras de tejidos feocromocitoma /paraganglioma benignos y malignos; y (E y F) de la tiroides normal y muestras de tejido de cáncer de tiroides papilar. El eje Y en cada gráfico representa el porcentaje de la expresión del ARNm utilizando la 2
∧-Ct método * 100% ± SEM. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001, *** p & lt; 0,001 (prueba de Kruskal-Wallis). inmunohistoquímica imágenes representativas son a partir de muestras normales, benignas, malignas y tumorales de 20 aumentos.
ZNF367
inhibe la proliferación celular, la invasión, la migración y la adhesión
Debido
ZNF367
se sobreexpresa en el cáncer endocrino, se investigó su efecto sobre la proliferación celular, la invasión y la migración, los eventos que son necesarios para la progresión del cáncer.
ZNF367
se expresó en carcinoma adrenocortical (SW13, BD140A), el cáncer papilar de tiroides (CPT-1), y las líneas celulares HEK293. Por lo tanto, hemos utilizado ambos
ZNF367
desmontables y sobreexpresión enfoques para determinar el efecto de
ZNF367
sobre la proliferación celular, la invasión y la migración. siRNA desmontables consigue hasta un 80% desmontables de ZNF367 ARNm y la expresión de proteínas en comparación con el control negativo siRNA (Figura S2).
ZNF367
caída en células SW13, aumento de la proliferación celular (30-40% )
in vitro y
(3,5 veces)
in vivo gratis (p & lt; 0,05; Figura 2).
ZNF367
caída también aumentó la invasión celular y la migración (p & lt; 0,05; Figura 3A). Teniendo en cuenta el efecto dramático de
ZNF367
en la invasión celular y la migración de las células SW13, el efecto de
ZNF367
caída tras la invasión celular y la migración también fue evaluado en BD140A, TPC-1, y el celular HEK293 líneas. La caída tuvo un efecto similar sobre la invasión celular y la migración de BD140A, TPC-1, y las líneas celulares HEK293 (P & lt; 0,05; Figura 3, B-D). El efecto de
ZNF367
en el crecimiento celular, la invasión y la migración también se confirmó mediante la sobreexpresión de
ZNF367
en células HEK293.
ZNF367
sobreexpresión disminuyó la invasión celular, la migración y la formación de colonias en comparación con el control de vector vacío (Figura 3E-G).
(A)
ZNF367
aumenta la proliferación celular desmontables . El eje Y representa las unidades fluorescentes relativas (RFU), y el eje X indica días después de la transfección. * P & lt; 0,05 en relación con el control negativo. Las barras de error representan ± SD. (B)
ZNF367
caída aumenta el crecimiento tumoral in vivo. células SW13 fueron transfectadas con el control negativo (n = 4) y siRNA (n = 4) en la derecha y flanco izquierdo de cada ratón. Después de 48 horas de la transfección, 3 × 10
se inyectaron 6 células en ratones desnudos atímicos, y el crecimiento del tumor se midió semanalmente. El eje Y representa el volumen del tumor y el eje X las semanas de medición de tumor después de la inyección flanco. * P & lt; 0,05 y barras de error representan ± SD
ZNF367
sobreexpresión disminuye la invasión celular y la migración.. (A) SW13, (B) BD104A, (C) TPC-1, y (D) las líneas de células HEK293. Después de la transfección, las células se colocaron en placas en el interior de una cámara de Boyden durante 48 horas. Las células se tiñeron y se contaron en 4 campos. El panel izquierdo muestra la imagen representativa (12,5 X) del siRNA desmontables y grupos de control negativo. El panel de la derecha indica la medición cuantitativa de células invadidas y migrados en caída y el control negativo. * P & lt; 0,05 y barras de error indican ± SD.
ZNF367
sobreexpresión disminuye el número de colonias, la invasión celular y la migración en las células HEK293. (E) Western blot de
ZNF367
sobreexpresión en células HEK293 y SW13 (vector vacía, XL4). GAPDH se utilizó como control de carga. (F) Imagen clonogénico Representante de células con ectópico
ZNF367
expresión y su control correspondiente (vector vacía, XL4). (G) la invasión celular y la migración disminuyó con el
ZNF367
sobreexpresión en células HEK293. La medición cuantitativa de las células invadidas y migraron por grupo (HEK293-HEK293-Vacío vector o
ZNF367
) se representa en el gráfico de barras en el panel derecho. (H) La proteína de unión extracelular de las células SW13 con
ZNF367
caída. Las células fueron transfectadas con
ZNF367
siRNA y control negativo siRNA, y se sembraron en placas de adhesión y se incubaron durante 90 minutos. El eje Y representa la absorbancia a 540 nM de células adherentes para cada proteína. Las barras de error representan ± SEM. * P & lt; 0,05, *** p & lt;. 0.001
Debido a la invasión celular y la migración requieren la adhesión celular a la matriz extracelular, se evaluó el efecto de
ZNF367
caída en la adhesión celular a las proteínas de la matriz extracelular. Se halló una mayor adhesión celular, con
ZNF367
desmontables, a la laminina I (de dos a tres veces mayor) y el fibrinógeno (tres-seis veces mayor) (p & lt; 0,05; Figura 3H). Estas proteínas son conocidas por funcionar para mejorar la unión celular a la membrana basal o matriz extracelular a través de receptores de la integrina, que permiten la adhesión de células de cáncer y la migración.
ZNF367
regula la expresión ITGA3
estábamos interesados en identificar el gen (s) y la vía (s) regulado por
ZNF367
, teniendo en cuenta el efecto de
ZNF367
en la invasión celular, la migración y la adhesión, y debido a que es un factor de transcripción predijo para regular la expresión génica. Utilizando el análisis de la expresión de ARNm de todo el genoma en células transfectadas con
ZNF367 Opiniones y siRNAs control negativo, se identificaron dos genes candidatos (
ITGA3, España serpina inhibidor de peptidasa, clado B (ovoalbúmina), miembro de 9 [ ,,,0],
SERPINB9
]) posiblemente regulada por
ZNF367
basado en la aplicación de varios criterios de filtro (FDR & lt; 0,25, & gt-cambio veces; 1,5, común a todos los siRNA desmontables y fuerte correlación en la expresión en tumores humanos muestras) (Figura S3).
ITGA3
fue elegido como un candidato prometedor para el estudio adicional, ya que juega un papel importante en la adhesión celular y la invasión y fue validado que se upregulated hasta 2,5 veces con
ZNF367
desmontables (p & lt; 0,05; Figura 4A) [11]. Además, la expresión de ARNm ITGA3 fue inversamente correlacionada con la expresión de ARNm de ZNF367 en muestras tumorales humanos adrenocorticales (r = - 0,37, p = 0,015; Figura 4B). ITGA3 expresión de la proteína también se incrementó con siRNA desmontables de
ZNF367 gratis (Figura 4C). Por otra parte, la sobreexpresión de
ZNF367
reducida
ITGA3
expresión en comparación con el vector vacío (Figura 4D-E). Estos datos sugieren que
ZNF367
regula la adhesión celular, la invasión y la migración a través de su efecto, al menos en parte, de
ITGA3
expresión.
(A)
ZNF367
regula al alza desmontables
ITGA3
expresión en células SW13. Las barras de error representan ± SEM. (B) La correlación entre el
ITGA3
y
ZNF367
la expresión de ARNm en muestras de tumores de la corteza suprarrenal. ejes X e Y representan los valores log 2-transformado. (C) la cuantificación de transferencia Western de la expresión de proteínas ITGA3 con
ZNF367
caída. (D-E) ITGA3 expresión con ZNF367 sobreexpresión. Las barras de error representan ± SEM.
miR-195 se dirige directamente a
ZNF367
y regula la invasión celular
Para entender el mecanismo por el cual
ZNF367
expresión se desregula en el cáncer, que postula que los microARNs pueden ser responsables de
ZNF367
sobreexpresión. Para identificar microRNAs candidatos que pueden dirigirse a
ZNF367
, nos preguntó el ciclo de destino y bases de datos para miRDB microRNAs prevé que apuntar a
ZNF367
. Un total de 3 de cada 14 microRNAs, predijo para apuntar
ZNF367, España resultaron ser expresadas diferencialmente en el carcinoma de la corteza suprarrenal (Tabla S1). Sin embargo, sólo el miR-195 fue significativamente inversamente correlacionada con
ZNF367
expresión. (R = -0.44; Figura 5A)
(A) La correlación entre el miR-195 y
ZNF367
expresión en un tumor suprarrenal. El coeficiente de correlación de Pearson se indica por r con su valor p. (B) la sobreexpresión ectópica de pre miR-195-resultados en la regulación a la baja de
ZNF367
.
ZNF367
la expresión de ARNm en las células transfectadas con SW13 pre-miR-195 y el control pre-negativa en 5 nM durante 24 horas (presentada como veces de cambio con respecto al control pre-negativo). Las barras de error representan ± SEM. El panel derecho muestra el Western blot de la proteína ZNF367 a partir de células transfectadas con SW13 pre-miR-195 y el control negativo. (C) Pre-miR-195 sobreexpresión aumenta la invasión en las células SW13 en comparación con el control negativo. El panel derecho muestra el número medio de células invadidas en el eje Y. (D)
ITGA3
la expresión de ARNm se incrementa después de la transfección de miR-195 y el control negativo en las células SW13. Las barras de error representan ± SEM. (E) El sitio de unión de miR-195 en el
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3'UTR, junto con el mutante de la construcción en la región de semillas predicho. En el panel derecho, el ensayo de luciferasa demuestra la disminución de luminiscencia en las células SW13 co-transfectadas con el miR-195 y el control negativo a 5 nM, con el vector, de tipo salvaje vacío
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3'UTR, o MUT -
ZNF367 Gráficos vectoriales 3'UTR (mutado en los tres primeros nucleótidos de la secuencia de semillas). La luminiscencia se leyó después de 24 horas de la transfección. El eje Y representa la relación de
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3'UTR para el vector vacío. * Valor de p & lt; 0,05 en comparación con el control negativo. Las barras de error representan ± SEM.
Para investigar si el miR-195 regula
ZNF367
expresión, las células fueron transfectadas con pre-miR-195 y el control pre-negativo (pre-NC) , que demostraron una reducción de
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la expresión del ARNm y la proteína (Figura 5B). Por otra parte, la sobreexpresión de miR-195 mostró un aumento
ITGA3
la expresión de ARNm (dos veces) y la invasión celular en comparación con el control negativo (p & lt; 0,05; Figura 5, C-D). Para confirmar que
ZNF367
es un objetivo directo de miR-195, se realizaron ensayos de luciferasa para determinar si el miR-195 se une a la 3'UTR de
ZNF367
ARNm. Hemos observado la actividad de luciferasa reducción significativa con el miR-195 en la sobreexpresión de tipo salvaje 3'UTR comparación con el control negativo y mutado
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células transfectadas-3'UTR (p & lt; 0,01; Figura 5E). Por lo tanto, estas observaciones sugieren que el miR-195 regula negativamente la expresión de
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atacando directamente a su 3'UTR, lo que disminuyó la invasión celular, el efecto más dramático de
ZNF367 Windows que se observó en nuestros estudios funcionales.
Discusión
para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para caracterizar la función de
ZNF367 Hoteles en cánceres. Hemos encontrado que
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se sobreexpresa en una variedad de cánceres del sistema endocrino (carcinoma adrenocortical, cáncer de tiroides papilar, feocromocitoma maligno /paraganglioma) en comparación con muestras de tejidos benignos y o normales. Funcional
in vitro Opiniones y en
in vivo
desmontables y sobreexpresión estudios demostraron que
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regula la proliferación celular, la invasión, la migración y la adherencia. Se utilizó el análisis de expresión de genes en todo el genoma para identificar genes candidatos que están regulados por
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, e identificamos
ITAG3
como un gen que probablemente media el efecto de
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en la adhesión celular, la invasión y la migración. Por otra parte, el análisis in silico de análisis de la expresión de genes en todo el genoma humano muestra de tumor demostrado una relación inversa entre el
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y
ITAG3
expresión. Por último, se demuestra que están alteradas
ZNF367
expresión se asoció con la pérdida de la expresión de miR-195 en muestras de tumores y que este microARN se dirige directamente a
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y regula la invasión celular, proporcionando una comprensión de la mecanismo para mal regulada
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expresión. Sobre la base de estos resultados, proponemos que hay una miR-195-
ZNF367-ITAG3
eje que regula la progresión del cáncer endocrino.
Este es el primer estudio para caracterizar la expresión y función de
ZNF367
en el cáncer.
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nocaut en ratones ha demostrado que no existen alteraciones significativas [12].