Extracto
Antecedentes
ET-743 (trabectedina, Yondelis®) y PM00104 (Zalypsis®) son compuestos de origen marino que tienen actividad antitumoral. ET-743 y PM00104 la exposición durante períodos sostenidos de tratamiento dará como resultado el desarrollo de resistencia a los medicamentos, pero los mecanismos que conducen a la resistencia aún no se comprenden.
Metodología /Principales conclusiones
condrosarcoma humano se establecieron líneas de células resistentes a ET-743 (CS-1 /ER) o PM00104 (CS-1 /PR) en este estudio. El CS-1 /ER y CS-1 /PR exhibieron resistencia cruzada al cisplatino y metotrexato, pero no a la doxorrubicina. arrays Affymetrix gen chip humanos se utilizaron para examinar la expresión génica relativa en estas líneas celulares. Se encontró que un gran número de genes han alterado los niveles de expresión en CS-1 /ER y CS-1 /PR, en comparación con la línea celular parental. 595 /ER y 498 CS-1 /PR-1 CS genes fueron identificados como que sobreexpresan; 856 CS-1 /ER y 874 transcripciones CS-1 /PR fueron identificados como underexpressing. Tres proteínas dedo de zinc (ZNF) los genes estaban en la lista de los 10 genes sobreexpresados. Estos genes no se han asociado previamente con la resistencia a fármacos en células tumorales. expresiones diferenciales de ZNF93 y ZNF43 genes fueron confirmados en ambos /ER y CS-1 /PR líneas celulares resistentes CS-1 por tiempo real de RT-PCR. ZNF93 se sobreexpresa en dos líneas celulares de sarcoma ET-743 resistentes Ewing, así como en una línea celular de cáncer de ovario resistente a cisplatino, pero no se sobreexpresa en líneas celulares resistentes a paclitaxel. ZNF93 desmontables de siRNA en el CS-1 /ER y CS-1 /PR han causado un aumento de sensibilidad para ET-743, PM00104, y cisplatino. Por otra parte, las células transfectadas ZNF93 CS-1 son relativamente resistentes a ET-743, PM00104 y cisplatino.
Conclusiones /Importancia
Este estudio sugiere que las proteínas dedo de zinc, y ZNF93, en particular, están implicados en la resistencia a eT-743 y PM00104
Visto:. Duan Z, Choy e, D Harmon, Yang C, K Ryu, Schwab J, et al. (2009) ZNF93 aumenta la resistencia a ET-743 (trabectedina; Yondelis®) y PM00104 (Zalypsis®) en líneas celulares de cáncer humano. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10.1371 /journal.pone.0006967
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: April 2, 2009; Aceptado: August 10, 2009; Publicado: 9 de septiembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Duan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado, en parte, por una beca de PharmaMar. El Dr. Duan está apoyada, en parte, a través de una subvención de Ovario Fundación de Investigación del Cáncer (OCRF), y una subvención del Instituto Nacional del Cáncer, NIH (Nanotecnología Plataforma de Asociación), R01-CA119617. El Dr. Choy es apoyado por la Fundación Jennifer Hunter Yates. El apoyo también ha sido proporcionada por los proveedores de fondos funds.The Gattegno y Wechsler tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. También reconocemos que los 2 a cabo varios medicamentos de quimioterapia utilizados en este estudio, ET-743 y PM00104, fueron fabricados y suministrados por la empresa, que también PharmaMar en parte financió el trabajo
Conflicto de intereses:. confirmo que PharmaMar EE.UU., Inc. no tiene ninguna influencia sobre los resultados y conclusiones de este estudio. Asimismo, declaro que los resultados y conclusiones que no se vieron afectados por una subvención de PharmaMar EE.UU., Inc. Aunque este estudio fue apoyado, en parte, por una beca de PharmaMar, esto no altera nuestra adhesión a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales con otros investigadores. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. También reconocemos que los 2 a cabo varios medicamentos de quimioterapia utilizados en este estudio, ET-743 y PM00104, fueron fabricados y suministrados por la empresa, que también PharmaMar en parte financió el trabajo.
Introducción
ET-743 (Yondelis®; trabectedina) es derivado de alcaloide marino aislado del tunicado caribeño
ecteinascidia cornete
[1], [2]. ET-743 tiene un amplio espectro de actividad en las líneas celulares tumorales en pM y bajas concentraciones nM, y también tiene actividad clínica hacia el cáncer de ovario, cáncer de mama, sarcomas y [2], [3]. ET-743 ha sido aprobado por la EMEA /UE para los pacientes con sarcomas avanzados que o bien han progresado tras el tratamiento con una antraciclina o no son clínicamente adecuado para recibir agentes convencionales [4]. ET-743 se compone de tres subunidades de tetrahidroisoquinolina que contienen un resto central de carbinolamina que permite que se una covalentemente al ADN. ET-743 se une al surco menor de la hélice de ADN con preferencia de unión específica de la secuencia para los tríos ricas en GC y posteriormente forma aductos covalentes con el N2-posición de guanina. Como resultado, el surco menor se expone y se volvió hacia el surco mayor. Cuando se produce dicha unión, las hebras de ADN se convierten en enlaces cruzados y no pueden ser reproducidos, lo que resulta en la muerte celular [5], [6]. La dirección de giro de ADN es una nueva característica entre los agentes de ranura interactivo de ADN menor, con lo que ET-743 único.
PM00104 (Zalypsis®), derivado de moluscos, es una entidad química novedosa relacionada con la jorumicina, una compuesto natural marino perteneciente a la familia de
Renieramycinas
, obtenida a partir de las esponjas [7], [8]. PM00104 ha
in vitro
y
actividad antitumoral in vivo hacia una amplia variedad de tumores sólidos y hematológicos. Al igual que con ET-743, PM00104 también se une al ADN y es citotóxico; Sin embargo, a diferencia de ET-743, PM00104 no se activa la respuesta "puesto de control de daños en el ADN". Por lo tanto, los efectos citotóxicos de PM00104, aunque depende de la unión al ADN, no son desencadenadas por mecanismos de respuesta a los daños del ADN [8].
Al igual que con otros fármacos quimioterapéuticos, ET-743 y PM00104 la exposición durante períodos sostenidos de tratamiento se dan como resultado el desarrollo de resistencia a los medicamentos, pero los mecanismos no se conocen bien. Diferentes estudios han informado de las descripciones en conflicto de la relación entre la expresión de ABCB1 y resistencia ET-743 en líneas celulares de cáncer humano [9], [10]. En la línea celular de ovario humano IGROV-1, que se selecciona para la resistencia a ET-743, ABCB1 se sobreexpresa [11]. La sensibilidad puede ser restaurada por la adición del inhibidor de pGP1 PSC-833, lo que sugiere que ET-743 puede ser un sustrato pGP1. Otro estudio, sin embargo, observó que dos líneas humanos que sobre-expresan Pgp epidermoides celulares de cáncer (KB-8-5 y KB-C-2) no eran resistentes a ET-743 [9]. En particular, las concentraciones sub-letales de ET-743 podrían revertir la resistencia a la doxorrubicina y vincristina en estas líneas celulares. No hay informes que describen el mecanismo de resistencia PM00104 en las células tumorales.
Los condrosarcomas son un grupo heterogéneo de tumores de origen mesenquimal que se desarrollan en el hueso o cartílago y muestran características chondrocytic [12]. Estos tumores no responden bien a los tratamientos convencionales como la quimioterapia y la radiación, y el pronóstico se relaciona con el grado del tumor y el estado de diferenciación. La sensibilidad de las células del sarcoma de ET-743 y PM00104 nosotros y otros ha llevado a considerar estos compuestos como candidatos interesantes para el tratamiento futuro de condrosarcoma [13], [14], [15]. Sin embargo, como con otros agentes quimioterapéuticos, la propensión de las células tumorales para desarrollar resistencia a ET-743 o PM00104 plantea un reto significativo para el uso de este medicamento durante un período prolongado de tiempo. El objetivo de este estudio es explorar los mecanismos de ET-743 o PM00104 resistencia en el condrosarcoma
Material y Métodos
Los medicamentos de quimioterapia
ET-743 (Yondelis®.; La trabectedina) y PM00104 (Zalypsis®) fueron suministrados por PharmaMar (España). Paclitaxel (Taxol), doxorrubicina (Adriamycin RDF®, CE Nº 2.468.183), metotrexato (Trexall) y cisplatino (Cisplatinum; CDDP) se obtuvieron a través de material clínico residual no utilizada proporcionada por la farmacia en el Hospital General de Massachusetts. La solución madre de fármacos se prepararon de acuerdo con las especificaciones de la droga y se almacena a -20 ° C.
El condrosarcoma línea celular CS-1 |
La línea celular humana chonodrosarcoma, propagada desde 1999 y designado CS -1, se establecieron a partir de un alto grado chonodrosarcoma humano resecado quirúrgicamente que no fue expuesto previamente a la quimioterapia o la radioterapia, y se cultivaron en monocapa. Brevemente, el tejido se obtuvo asépticamente inmediatamente después de la resección, se colocó en medio de cultivo tisular RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal 10%, y el tejido cultivado a 37 ° C incubadora que contiene 5% de CO2 [13], [14]. Se ha informado que el análisis detallado de CS-1 anteriormente [13], [14], [15], [16], [17]. ARN total fue extraído después de CS-1 se pasó cuatro veces.
Establecimiento de ET-743 o la línea celular resistente al PM00104
p>
Otro línea celular resistente a los fármacos utilizados en este estudio
líneas celulares de cáncer de ovario Humanos Skov-3 y A2780 y una línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 fueron adquiridos de Recogida de tejido en la American Type (Rockville, MD). El paclitaxel resistente Skov-3
TR, MCF-7
TR y cisplatino-resistentes A2780cp líneas celulares se establecieron como se informó anteriormente [19], [20]. El Dr. Katia. Scotlandi (Instituto Rizzoli Ortopedia, Italia) proporcionó el sarcoma de Ewing ET-743 línea celular resistente TC-ET [21].
Cultivo de tejidos
Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen). Las células se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
atmósfera de aire 2-95% y se pasaron cuando cerca de monocapas confluentes se lograron usando solución de tripsina-EDTA. líneas celulares resistentes a fármacos se cultivaron periódicamente en la droga respectiva para confirmar sus características de resistencia a fármacos. Las células estaban libres de contaminación por micoplasmas como probado por MycoAlert Kit de detección de (R) Mycoplasma de Cambrex (Rockland, ME).
Ensayo de citotoxicidad
citotoxicidad del fármaco se evaluó in vitro usando el ensayo MTT como anteriormente se describe [22]. Brevemente, 2 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio de cultivo (RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina /estreptomicina) que contienen concentraciones crecientes de fármaco. Después de 7 días de cultivo, 10 l de MTT (5 mg /ml en PBS, obtenido de Sigma) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 4 h. El producto de formazano resultante se disolvió con ácido-isopropanol y la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (A
490) se leyó en un espectrofotómetro de microplacas SpectraMax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los valores de absorbancia se normalizaron por la asignación del valor de la línea de control en el medio sin fármaco a 1,0 y el valor del control no celular a 0. Los experimentos se realizaron por triplicado.
ARN extracción
El ARN total se obtiene de CS-1 (línea celular de sus padres con sometidas a pases 4 veces), CS-1 /ER y CS-1 /PR (líneas celulares resistentes a la hija con cultivaron durante un año) usando el reactivo TRIzol® (GIBCO, Grand Island , NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para tener en cuenta y eliminar el ruido biológico, el ARN se aisló de tres frascos distintos de cada línea celular. Estas réplicas biológicas se agruparon. Se determinó la calidad del ARN
a través de
etidio tinción después de la electroforesis en gel de agarosa /formaldehído bromuro.
Gene transcripcional de perfiles
El ARN total se procesó y se hibridó a Affymetrix gen chip de U133 Plus 2,0 arrays (Santa Clara, CA) por el Centro de Tecnología de genes de matriz en la Escuela de Medicina de Harvard (http://genome.med.harvard.edu). Affymetrix gen chip de U133 Plus 2.0 en la primera y más amplia gama de expresión del genoma humano completo. Este conjunto se completa la cobertura de todo el genoma humano con más de 47.000 transcripciones. Cada sonda consta de 20 oligonucleótidos 23-meros separados. El nivel de expresión de cada ARNm se cuantifica midiendo su hibridación con estos 23-meros en comparación con su hibridación a un oligonucleótido de falta de coincidencia de una sola base.
Datos análisis
GeneSifter se utilizó para analizar la los datos de microarrays (http://www.genesifter.net/web/). GeneSifter proporciona algoritmos de análisis de gran alcance (RMA, PAM, ANOVA, clara, Benjamini-Hochberg, etc.) a través de una interfaz web intuitiva. GeneSifter puede identificar genes expresados diferencialmente y análisis de conglomerados para la identificación de patrones de expresión génica y la segregación de genes basados en estos patrones. Se evaluó el cambio veces en la expresión entre las líneas celulares sensibles y resistentes mediante la prueba de Mann-Whitney. Se utilizó un diez veces o mayor cambio en la intensidad combinada con un valor P asociado Mann-Whitney menos de 0,05 como criterio para la inclusión en nuestro conjunto de datos filtrada. información de intensidad se exportó a Microsoft Excel, según sea necesario.
TaqMan PCR con transcripción inversa para la cuantificación de genes expresados diferencialmente
Real-time RT-PCR se llevaron a cabo para validar los genes expresados diferencialmente. Para la detección de la expresión del gen, cDNA de transcripción inversa se realizó a partir de muestras de ARN total usando cebadores oligo dT específicas de la Taq hombre RNA Los ensayos y los reactivos del kit de ARN TaqMan transcripción reversa (Applied Biosystems). El ADNc resultante se amplificó por PCR usando proteína de dedo de Taq hombre Zinc 93 (ZNF93), ZNF43 y THADA cebadores ensayo de gen con Universal PCR Master Mix Taq hombre y se analizaron con un StepOnePlus Sistema PCR real tiempo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems) . GAPDH y actina se utilizaron como control. Los niveles relativos de la expresión de genes se calcularon a partir de las señales relevantes por normalización con la señal de GAPDH o expresión de actina. mezclas de reacción PCR contenían Taq hombre ZNF93 humana, o ZNF43 y THADA y Universal PCR Master Mix en un volumen total de 20 AL. variables de los ciclos eran las siguientes: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos a 95 ° C (15 s) y recocido /extensión a 60 ° C (1 min). Todas las reacciones se realizaron por triplicado
ZNF93 siRNA ensayo
Para ZNF93 (número de acceso al GenBank: NM_031218). Interferencias, el sentido ZNF93 oligo (5'-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 ') y oligo antisentido ZNF93 ( 5'-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 ') fueron adquiridos de Applied Biosystems y se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la validación de ZNF93 RNAi especificidad, los siGenome SmartPool Humanos ZNF93 siRNAs se adquirieron de Dharmacon (Chicago, IL) con los siguientes cuatro secuencias diana de ZNF93 gen. secuencia diana 1: 5'-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 '; secuencia diana 2: 5'-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 '; secuencia diana 3: 5'-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-secuencia 3' y el objetivo 4: 5'-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 '. Para la transfección, las células se sembraron ya sea en placas de 96 pocillos para ensayos de MTT o sembraron en placas para la extracción de RNA. Las transfecciones se realizaron con SIPORT ™
NeoFX
™ reactivos de transfección siRNA (Ambion. Inc, Austin, TX) según lo indicado por el fabricante. El Silencer ™ siRNA EGFP (Ambion) y reactivo siRNA Control® (Dharmacon) se utilizaron como controles positivos y negativos en todos los experimentos. Para ZNF93 inhibición, la concentración final de siRNA era o bien a 25 nM o 100 nM. Se reemplazó el medio con RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS 24 horas después de la transfección. El ARN total se aisló después de 72 horas de ZNF93 siRNA transfección de confirmación en tiempo real RT-PCR.
Pires
construcción ZNF93 vector de expresión y transfección
Un par fragmento de cDNA que contiene la base de 1907 completo ORF de ZNF93 humano se amplificó por RT-PCR a partir del ARN de CS-1 /PR línea celular que sobreexpresa ZNF93 altamente. RT-PCR se realizó usando los cebadores sentido y antisentido a ZNF93 humano: sentido de cebadores 5'-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 'para introducir un sitio Not I como subrayado, y el cebador antisentido: 5'-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3' (GenBank#NM_031218) a introducir un sitio BamHI como se ha subrayado. Los sitios de enzimas de restricción introducidos fueron diseñados para el seguimiento de estudios de transfección. de Clonetech (Palo ATLO, CA) vectores de expresión de mamífero pIRESneo se utilizó para estudio de la expresión funcional. El producto ZNF93 RT-PCR resultante se clonó en el vector pCR®2.1 usando de Invitrogen TA Cloning Kit original. Después de la confirmación de secuencia, ZNF93 se cortó del vector pCR®2.1, purificada, se subclonó en el MCS del vector de expresión pIRESneo, y posteriormente se secuenció para confirmar la ORF correcta. Expresión de ZNF93 cDNA estaba bajo el control del pCMV. Las transfecciones se realizaron utilizando reactivos LipofectAmina Plus (Invitrogen) como sigue: aproximadamente 5 × 10
5 células CS-1 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 90 milímetros y cultivadas durante la noche. Antes de la transfección, el medio de cultivo fue reemplazado con suero libre de RPMI 1640 y se cultivaron durante tres horas. Lipofectamine reactivo que contiene 5 g de pIRES
vacío, pIRES
ZNF93 se combinó con reactivo Plus y se aplicó a las células. Después del cultivo durante cuatro horas, se reemplazó el medio con medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. sulfato de G418 (Invitrogen) de selección (300 mg /ml) se inició a las 24 horas después de la transfección. El medio de selección se cambió cada 2 días. Efectos de la sobreexpresión de ZNF93 ET-743 y PM00104 se determinaron mediante el ensayo de citotoxicidad MTT.
Resultados
CS-1 /ER, CS-1 líneas celulares /PR son resistentes a varios agentes quimioterapéuticos
CS-1 /ER y CS-1 /PR fueron seleccionados a partir de la línea celular de sus padres, CS-1, por la exposición a los aumentos graduales en las concentraciones de PM00104 ET-743 o por un período de un año. Se encontró que el fenotipo de resistencia a los medicamentos a ser estable después de 14 meses de cultivo continuo en las drogas o al menos 6 meses en condiciones libres de drogas. No se observó ninguna diferencia significativa entre las células CS-1 /PR CS-1 y CS-1 /ER o
in vitro
crecimiento celular (tiempo de duplicación similar) y la morfología microscópica. análisis de citotoxicidad MTT muestra que CS-1 /ER, CS-1 /PR son 10- 20 veces más resistente a ET-743 y PM00104, en comparación con la línea celular parental sensible. El IC
50-valor de ET-743 en las células CS-1 fue de 0. 0008 M en comparación con 0. 01 micras de células /ER CS-1 (resistencia a 12,5 veces). El IC
50-valor de PM00104 en las células CS-1 fue de 0. 002 M en comparación con 0. 04 micras de células /PR CS-1 (resistencia de 20 veces). Además, CS-1 /ER y CS-1 /PR exhibe resistencia a cisplatino y metotrexato, pero no a la doxorrubicina (Fig. 1).
CS-1 /ER, CS-1 /PR y CS- 1 células se expusieron a concentraciones variables de las drogas durante 6 días. La inhibición del crecimiento se determinó mediante la incubación con el colorante de tetrazolio MTT y por medición de la absorbancia a 490 nm. Los datos reflejan tres repeticiones a cada concentración.
Un gran número de genes están asociados con ET-743 y PM00104 resistencia
Humano Affymetrix gen chip de U133 Plus 2,0 arrays se utilizaron para examinar relativa los niveles de expresión de ARN entre CS-1, CS-1 /ER, y CS-1 /PR. Los perfiles de expresión de estas tres líneas celulares de condrosarcoma se evaluaron por GeneSifter. Además, hemos presentado nuestros datos de microarrays a Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y estos datos de la matriz se les ha asignado un número de acceso GEO como GSE16748. Hemos encontrado un gran número de genes tenía significativamente diferentes niveles de expresión en CS-1 /ER y CS-1 /PR, en comparación con CS-1. Para centrarse en genes con cambios significativos en los niveles de expresión, se identificaron los genes con un cambio de diez veces o mayor en los niveles de expresión. Usando este criterio, 595 (CS-1 /ER), 498 (CS-1 /PR) genes exhiben sobreexpresión de más de diez veces en las líneas resistentes a ET-743 y PM00104 en relación con su expresión en las líneas parentales sensibles (Fig. 2A). Además, 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) transcripciones fueron más de diez veces la disminución en las líneas celulares resistentes en comparación con los controles (Fig. 2B). Los cambios en los niveles de expresión variaron de 10 a 536- veces. Los genes identificados eran en gran parte no se solapan entre líneas celulares y codificada para las proteínas con una amplia variedad de funciones bioquímicas. Los genes codifican identificadas para las proteínas que se unen al ADN tienen actividades catalíticas, actividades transductor molecular, regular la transcripción, proteínas de transporte y moléculas, regular enzimas y hay muchos otros genes que han caracterización limitados. Los 20 genes más altamente sobreexpresados y underexpressed en cada una de las líneas celulares resistentes se resumen en la Tabla 1. Hubo siete genes sobreexpresados en tanto CS-1 /ER y CS-1 /PR y un gen que underexpressed en ambas líneas celulares. En estas dos líneas celulares resistentes, hay más superpone gen en el top 20 sobre la lista de genes expresados en comparación con el bajo expresó lista de genes. También hay que destacar el grado de cambio en la expresión génica fue más dramático en el conjunto de genes expresados bajo (Tabla 1).
Los genes sobreexpresado /bajo expresado en más de una línea celular se indican en las regiones de solapamiento de los círculos.
los genes expresados diferencialmente en ambas líneas celulares resistentes
Fig. 2 diagrama de Venn muestra que 185 genes se sobreexpresa, 174 genes fueron underexpressed en los dos /ER, y las líneas celulares resistentes CS-1 /PR CS-1 en comparación con CS-1 (Fig. 2A y Fig. 2B). Los 20 genes más altamente overexpresssed en ambas líneas celulares resistentes se resumen en la Tabla 2. Como 3 sobre la parte superior 20 genes overecpressing tanto en el CS-1 /ER, y las líneas celulares resistentes CS-1 /PR son genes de la proteína de zinc dedo (ZNF93, ZNF43 y ZNF568), que decidieron validar aún más por estos genes en tiempo real de RT-PCR.
TaqMan en tiempo real RT-PCR análisis de los genes expresados diferencialmente
para validar la matriz de datos, se realizó en tiempo real RT-PCR de tres genes que son expresados diferencialmente en las dos líneas celulares resistentes. ZNF93, ZNF43, y la expresión de ARN THADA se midieron mediante el kit de ensayo TaqMan ARN. Expresión diferencial de ZNF93 y ZNF43 se confirmaron en ambas /ER y CS-1 /PR líneas celulares resistentes CS-1 (Fig. 3A, Fig. 3B y Fig. 3C). THADA sobreexpresión no se confirmó en la línea celular resistente al CS-1 /ER
Un gratis (figura 3D.):. Gráfica de amplificación para el gen de β-actina.
B Opiniones: gráfico de amplificación de genes ZNF93.
C
: los niveles de expresión de ARNm ZNF93.
D
: Resumen de los niveles relativos de expresión de ZNF93, ZNF43 y ARNm THADA
Expresión de ZNF93 en líneas celulares resistentes a múltiples fármacos otra
ZNF93 gen sobreexpresado en ambos. CS-1 /ER y líneas de células /PR CS-1 y la función de ZNF93 está claro si bien la proteína ha sido implicado en la regulación transcripcional celular. Como gen ZNF93 anteriormente no se ha relacionado con la resistencia a fármacos y fue seleccionada para el estudio adicional. Además, evaluó la expresión de ZNF93 en otras líneas celulares resistentes a múltiples fármacos por tiempo real de RT-PCR. Los resultados demostraron que ZNF93 se sobreexpresa en dos líneas de células del sarcoma de ET-743 resistente Ewing, TC-ET, así como en una línea celular de cáncer de ovario resistente a cisplatino, A2780cp, en comparación con sus cisplatino líneas celulares parentales sensibles ET-743 o, pero ZNF93 no se sobreexpresa en líneas celulares resistentes a paclitaxel Skov-3
TR y MCF-7
TR (Fig. 4).
Todo en tiempo real RT-PCR datos han sido normalizados a ß -actina.
Efectos de la inhibición de la expresión de siRNA en ZNF93 sensibilidades de drogas
Para determinar si ZNF93 juega un papel en la ET-743 y la sensibilidad PM00104, que redujo su expresión en CS -1 células /PR utilizando siRNA desmontables. Las sensibilidades de drogas relativos se evaluaron por comparación de IC
50 valores determinados por MTT en, líneas celulares siRNA tratados no específicos siRNA tratados y no tratados de control a múltiples fármacos resistentes. En primer lugar, se midió la citotoxicidad de ET-743 y PM00104 4 días después de la transfección de las células resistentes con oligos ZNF93 siRNA de Applied Biosystems. Hemos observado que ZNF93 baja regulación se recuperaron parcialmente la sensibilidad a PM00104 (Fig. 5A) en la línea celular /PR CS-1. en tiempo real RT-PCR reveló ZNF93 expresión se redujo significativamente después de las células tratadas con siRNA (Fig. 5B). Resultados similares fueron encontrados en las drogas línea celular resistente a la CS-1 /ER (datos no mostrados). Además, para la validación de ZNF93 RNAi especificidad, los siGenome SmartPool Humanos ZNF93 siRNAs se adquirieron de Dharmacon con las cuatro secuencias diana de ZNF93 gen y se ensayaron en la línea celular resistente cisplantin A2780cp. El ZNF93 expresión en siRNA transfectadas las células A2780cp disminuyó significativamente según la evaluación de Real-Time RT-PCR (Fig. 5D). ensayo de MTT mostró la IC
50 valores de la siRNA tratados A2780cp células fueron inferiores en comparación con las líneas resistentes no tratados (Fig. 5C), lo que sugiere que ZNF93 siRNA inhibe la expresión ZNF93 y parcialmente restaura la sensibilidad de la línea celular resistente al cisplatino .
Un
: CS-1 /PR se transfectadas con siRNA ZNF93 * (Applied Biosystems), así como siARN no específico.
C
: A2780cp se transfectó con ZNF93 siRNA
† (Dharmacon), así como siRNA no específica. La sensibilidad relativa de cada tratamiento para PM00104 o cisplatino se determinó por análisis MTT 72 horas después de la transfección.
B y D
: Confirmación de ZNF93 desmontables por tiempo real RT-PCR. ARN total fue aislado 72 horas después de la transfección y expresión ZNF93 se analizó por tiempo real RT-PCR.
Efectos de la sobreexpresión de ZNF93 de ET-743, PM00104 y cisplatino sensibilidades
Nuestros análisis de la expresión endógena ZNF93 demostraron que se ZNF93 frecuencia aumentada en varias líneas celulares de cáncer resistentes a los medicamentos cisplatino ET-743, y PM00104, ZNF93 baja regulación de siRNA podría recuperar parcialmente la sensibilidad a ET-743, PM00104 y cispatin. Estos resultados sugieren que la proteína ZNF93 puede ser críticamente involucradas en el desarrollo de resistencia a estos fármacos. A fin de determinar si ZNF93 participa directamente en el establecimiento del fenotipo resistente, transfectadas la línea celular sensible a ET-743 y PM00104 CS-1 con un vector de expresión ZNF93 y generamos línea celular estable que sobreexpresan ZNF93 (Figura 6D). Luego preguntamos si la sobreexpresión exógena de ZNF93 era suficiente para conferir una mayor resistencia ET-743 y PM00104. Los resultados del ensayo de MTT en las líneas celulares transfectadas se muestran en la Fig. 6. ZNF93 transfectadas las células CS-1 son relativamente resistentes a ET-743, PM00104 y cisplatino, mientras que no se observó ningún cambio significativo en la resistencia en las células CS-1 transfectadas con el vector vacío (Figura 6A a C). ZNF93 expresión elevada en las células transfectadas fue confirmada por tiempo real de RT-PCR (Fig. 6D).
Un
,
B Opiniones y
C
: citotoxicidad relativa de ET-743, PM00104 y cisplatino en el CS-1 líneas celulares derivadas (CS-1 /pires
ZNF93) transfectadas de forma estable con un
vector de expresión ZNF93 pires y en el de los padres (CS-1) y el vector vacío (CS-1 /pIRES) controles fueron evaluados mediante el ensayo MTT. Todas las muestras se analizaron por triplicado.
D
:. La confirmación de ZNF93 sobreexpresión en Pires
ZNF93 tranfected CS-1 en las células por tiempo real de RT-PCR como se describe en Materiales y Métodos
Discusión
Los resultados de varios ensayos clínicos sugieren que ET-743 tiene actividad antitumoral contra varios tipos de cáncer, incluyendo los sarcomas de tejidos blandos, cáncer de mama y cáncer de ovario [2], [3]. Los pacientes con cáncer de ovario avanzado y de mama, así como los huesos o sarcomas de tejidos blandos típicamente se someten a varias líneas de regímenes contra el cáncer antes de finalmente sucumbir a su enfermedad. resistencia a múltiples fármacos se cree que desempeñan un papel importante en el inevitable fracaso de los tumores para responder a cada línea sucesiva de la quimioterapia. Por lo tanto, la comprensión de los patrones y mecanismos de resistencia cruzada y encontrar maneras de superar es un objetivo importante. Varios estudios han estudiado los mecanismos de resistencia a los medicamentos ET-743 con diferentes enfoques. Sin embargo, los resultados contradictorios se han publicado a partir de diversos grupos que intentan correlacionar resistencia a diferentes niveles de expresión de ARN y proteínas en las células resistentes [9], [10], [13], [14], [21]. Además la resolución de las diferencias entre estos resultados podría ser el más adecuado por la matriz de análisis de todo el genoma transcripcional.
En este estudio, se presenta establecimiento exitoso de dos líneas celulares de condrosarcoma resistentes a ET-743 o PM00104. Luego preguntamos cómo los niveles de expresión de genes relacionados con las diferencias en la resistencia a los medicamentos en estas dos líneas celulares. Se utilizó Affymetrix gen chip de U133 Plus 2 para examinar la expresión de todo el genoma de transcritos de ARN. En comparación con varios estudios utilizando serie de genes de menor escala, esta matriz cubre completamente todo el genoma humano, con más de 47.000 transcripciones. Hemos validado los resultados de la matriz génica para los genes con los cambios más significativos en tiempo real RT-PCR. Como era de esperar, hay un gran número de cambios de transcripción asociados con
in vitro
resistencia a ET-743 y PM00104 adquirida. De hecho, alrededor de 5% a 10% (con valor de corte de 2 veces) de transcripciones se sobre-expresado o bajo-expresado en las líneas celulares resistentes CS-1 /ER y CS-1 /PR, en comparación con la célula parental sensible la línea.
En la lista de los 20 sobre la expresión de genes tanto para CS-1 /ER y CS-1 /PR, los mismos tres genes de la proteína de zinc dedo, ZNF93, ZNF43 y ZNF568 (Tabla 2) fueron todos identificado. Estos genes no se han asociado previamente con la resistencia a fármacos. PCR en tiempo real confirmó ZNF93 y ZNF43 son consistentemente durante expresado en estas líneas celulares resistentes (Fig. 3). Evaluación preliminar de ZNF93 confirma que su expresión se asocia con el fenotipo resistente a múltiples fármacos en líneas celulares adicionales.