Extracto
El cáncer gástrico (CG) sigue siendo uno de los cánceres digestivos más comunes en todo el mundo; Sin embargo, la mayoría de los pacientes presentan en una etapa avanzada al momento del diagnóstico inicial.
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es un nuevo gen supresor tumoral candidato que está silenciado epigenético en GC. En este estudio, se investigó
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promotor de la metilación del ADN en plasma como un marcador molecular novedosa para el diagnóstico precoz y el seguimiento de GC. reacción en cadena de la polimerasa (MSP) de ensayo específica de metilación se realizó para detectar
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promotor de la metilación en el ADN de plasma de 20 sujetos sanos, 50 pacientes neoplasia intraepitelial gástricos, y 104 pacientes GC. El
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tasa de metilación del promotor en las muestras de plasma del grupo de control sano de 0%, pero alcanzó el 54,0% en el grupo de neoplasia intraepitelial y el 60,6% en el grupo GC. Los dos últimos valores fueron significativamente mayores que la que se encuentra en el grupo de control sano (p & lt; 0,05), con una especificidad del 100% para la neoplasia intraepitelial y diagnóstico GC. El valor predictivo positivo de plasma
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metilación del promotor para el diagnóstico de neoplasia intraepitelial y GC fue del 100%. El estado de metilación en el grupo GC no se asoció significativamente con el tamaño del tumor, la diferenciación tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, estadificación TNM, o la invasión tumoral (p & gt; 0,05). Evaluación de la importancia de la detección del antígeno carcinoembrionario (CEA) y nivel
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tasa de metilación del promotor para el diagnóstico GC reveló que la sensibilidad de
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promotor de la metilación fue significativamente mayor que la de el nivel de CEA como un marcador y que la medición combinada de estos dos índices (pruebas en paralelo) la sensibilidad mejorada. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que el
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tasa de metilación del promotor en el ADN derivado del plasma es de gran importancia para la pronta detección de GC y el seguimiento de la tumorigénesis.
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la metilación del promotor puede servir como un nuevo marcador biológico de plasma no invasiva para la detección precoz de la GC y para la evaluación del riesgo en poblaciones de alto riesgo. La medición combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (pruebas en paralelo) pueden elevar las directrices actuales para el diagnóstico precoz de la GC
Visto:. Chen X, Z Lin, Xue M , Si J, Chen S (2015)
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hipermetilación de promotores en el ADN de plasma es un biomarcador potencial para el cáncer gástrico y la neoplasia intraepitelial. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10.1371 /journal.pone.0133906
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: Abril 10, 2015; Aceptado: 2 Julio 2015; Publicado: 24 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang Médico provincial y el plan de salud general de investigación (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang Departamento de Educación provincial plan de investigación (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), y clave de la provincia de Zhejiang equipo de innovación de ciencia y tecnología (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). El donante Shujie Chen concebido y diseñado los experimentos de este manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres digestivos más comunes y la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. La mayoría de los pacientes GC presentes en una fase avanzada en el diagnóstico inicial. A nivel mundial, la GC es responsable de casi 952.000 nuevos casos anualmente de acuerdo con Globocan 2012 [2]. En Japón, la tasa de supervivencia a 5 años para principios de GC (EGC) es del 86% frente al 32% para la CG avanzado, según lo informado por el programa SEER de Estados Unidos [3].
metilación aberrante del ADN es una importante epigenética cambio y un evento temprano en la carcinogénesis [4]. Recientemente, varios genes supresores de tumores (ETG), incluyendo
FAM5C
,
MYLK
,
p16
y
E-cadherina
, han informado de que se metilado en el suero /plasma de los pacientes de GC [5-7]. Además, la hipermetilación del TSG, tiende a mejorar con la progresión de las lesiones precancerosas [8-9]. Por lo tanto, la detección de ADN metilado en suero /plasma puede ser una estrategia prometedora para el diagnóstico precoz de la GC. neoplasia intraepitelial (EN) es una lesión potencialmente precancerosa que confiere un alto riesgo de CG; por lo tanto, la detección de pacientes en es crucial para el diagnóstico y la predicción de GC. Son pocos los informes de ADN hypermethylated análisis de muestras de sangre de la neoplasia intraepitelial gástricos (NGI) de los pacientes están disponibles hasta la fecha.
La creciente evidencia indica que
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miembro de la familia 1 , emparejado odd-homólogo de Drosophila) participa en la progresión de varios tipos de cáncer [10-13]. Hemos descubierto previamente que
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, una novela TSG, se silencia a través de la hipermetilación del promotor tanto en las células y tejidos GC [14]. También hemos demostrado que
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está implicado en la inhibición de la supervivencia celular GC y el deterioro de la migración celular [15].
En el presente estudio, se determinó el potencial de diagnóstico y de pronóstico iniciales de
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hipermetilación en el plasma de pacientes GC. Se midió el estado de metilación de
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en el plasma de pacientes con sujetos normales de control (NC) GC o gin. La asociación de
también se evaluó Zic1
la metilación del promotor con los parámetros clínico-patológicos. Además, se clasificaron de alto grado IN y T1 GC como EGC y colocamos los pacientes con cáncer gástrico y la ginebra en un GC Plus en grupo (GPI). A continuación, analizamos la
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tasas de hipermetilación en tanto la EGC y grupos GPI. Además, la evaluación combinada del antígeno carcinoembrionario (CEA) y el nivel de
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metilación del promotor para el diagnóstico de GC se evaluó mediante el plasma de los pacientes con cáncer gástrico y la ginebra.
Materiales y Métodos
las muestras clínicas
se obtuvieron muestras de plasma antes de la operación en el Sir Run Run Shaw hospital, Hangzhou, Zhejiang, china, desde noviembre de 2012 hasta abril de 2015. Todos los pacientes incluidos en nuestro estudio fueron sometidos a gastroendoscopy y se agruparon de acuerdo con el diagnóstico histopatológico. Las muestras de plasma se obtuvieron de pacientes con cáncer gástrico y la ginebra naïve a los tratamientos curativos, como la quimioterapia, la radioterapia y resección quirúrgica. Los criterios de exclusión incluyeron enfermedades gastrointestinales con otras causas y enfermedades en otros órganos. También se excluyeron los pacientes con metástasis de otros tumores gástricos.
Numeramos las muestras de acuerdo con el orden en el que fueron recogidos y luego llevaron a cabo la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP) para evaluar las muestras en orden numérico. Las muestras se agrupan adicionalmente de acuerdo con los resultados de patología. Las muestras de plasma se obtuvieron de 104 pacientes con cáncer gástrico con una edad media de 59,8 años que fueron diagnosticados de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud [16]. Cincuenta pacientes GIN con una edad media de 58,0 años fueron diagnosticados mediante gastroscopia. Las muestras de sangre también se recogieron de 20 voluntarios sanos en el grupo NC con una edad media de 38,5 años.
Ética declaración
Nuestro proyecto recibió la aprobación del Comité Ético de Investigación Clínica del Instituto de Gastroenterología de la Universidad de Zhejiang. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la recogida de muestras. Las personas que participaron en este estudio dieron su consentimiento informado por escrito (como se indica en el
PLOS
formulario de consentimiento) para publicar estos detalles del caso.
aislamiento del ADN y modificación con bisulfito
DNA se extrajo de las muestras de plasma usando un kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). las concentraciones de ADN se midieron por espectroscopía de una longitud de onda de 260 nm. ADN fue tratado con bisulfito con un kit de ADN Zymo Modificación (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.). El ADN modificado se almacenó a -20 ° C hasta su uso.
ensayos MSP
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metilación del promotor se examinó mediante la realización de ensayo de MSP utilización de dichas bisulfite modificados libre ADN en plasma como la plantilla. MSP se llevó a cabo durante 40 ciclos a una temperatura de hibridación de 56 ° C como se describe anteriormente [14]. Los cebadores específicos de metilación fueron ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) y ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), y los cebadores metilados específicos fueron ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) y ZIC1-UR (5' CCCATTAACCACATTAAACA). El protocolo de PCR incluía una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 56 ° C durante 40 s, extensión del cebador a 72 ° C durante 40 s, y una extensión final a 72 ° C durante 7 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5%, se tiñeron con gel rojo, y se visualizaron mediante iluminación UV.
ACE sérico prueba
Las muestras de suero fueron enviadas al laboratorio clínico de Sir Run Run hospital de Shaw para la prueba, y una concentración de CEA de & gt; 5 ng /ml fue considerado como anormal.
Los análisis estadísticos
Las frecuencias de metilación y los niveles de CEA en las muestras de plasma se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. La asociación entre las características clínico-patológicos y la hipermetilación del ADN se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado. El valor diagnóstico de la combinación de
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la metilación del promotor y el nivel de CEA en plasma se evaluó de acuerdo con el área bajo la curva ROC (AUC). La sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos para el diagnóstico patológico se calcularon con intervalos de confianza del 95% para
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la metilación del promotor o
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metilación del promotor combinado con el nivel de CEA. También se calcularon los cocientes de probabilidad positivos y negativos. Para todas las pruebas, un valor de corte de p & lt; 0,05 se aplicó para determinar la significación estadística. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
El estado de metilación en el plasma
Para evaluar las alteraciones en
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promotor metilación en GC, lo primero que detecta el estado de metilación de este promotor en 104 pacientes con GC, 50 con GIN, 31 con CGT y 20 CN y realiza comparaciones entre los grupos. Las tasas de metilación de los
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promotor en las muestras de plasma fueron 0% en el grupo NC (0%), aumentando a 54,0% en el grupo GIN y a 60,6% en el grupo GC (p & lt; 0,001 tanto para GIN y GC vs Carolina del Norte), con un 100% de especificidad para el diagnóstico de GPI (20/20) (figura 1). Los valores predictivos positivo y negativo y los cocientes de probabilidad positivo y negativo para el diagnóstico de IN y GC fue del 100% (90/90), el 23,8% (20/84), infinita y 0,42, respectivamente. los resultados del ensayo MSP representante de
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metilación del promotor se muestran en la Figura 2.
Los porcentajes de
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la metilación del promotor eran el 60,6% (63/104) en el GC, 54,0% (27/50) en el GIN, el 54,8% (17/31) en el EGC y el 0,0% (0/20) en los grupos de Carolina del Norte (*: p & lt; 0,001) guía empresas
M: cebadores específicos de metilación; T:. Cebadores específicos no metilado-
Asociación de características clinicopatológicas con
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promotor de la metilación en el plasma de pacientes GC
A continuación, se correlacionó las características clinicopatológicas con el
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tasa de metilación del promotor en el plasma de los pacientes con cáncer gástrico para identificar cualquier asociación. Los resultados no revelaron asociaciones importantes entre el
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tasa de metilación del promotor y los parámetros clínicos, incluyendo el tamaño del tumor, grado de diferenciación, los ganglios linfáticos, la profundidad de la invasión tumoral y el estadio TNM (p & gt; 0,05) (Tabla 1) .
determinación combinada de
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hipermetilación y el nivel de CEA
la importancia de la determinación combinada de la
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tasa hipermetilación y la CEA se analizó el nivel para el diagnóstico y la predicción precoz de la GC. Se midió el nivel de CEA en 9 CN, 24 pacientes y 71 pacientes GIN GC antes del tratamiento. Las sensibilidades del nivel de CEA en los grupos GC, EN, y EGC eran el 22,5% (16/71), el 16,7% (4/24) y el 10,5% (2/19), respectivamente. En todos los 3 de los grupos, la sensibilidad de
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promotor de la metilación fue significativamente mayor que la del nivel de CEA (p & lt; 0,05).
determinación combinada de
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hipermetilación y el nivel de CEA en el grupo GC.
en el grupo GC, la sensibilidad y la especificidad de la determinación combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (prueba de tándem) fueron 16,9 % y 90,9%, respectivamente (Tabla 2). La sensibilidad del análisis combinado de estos dos parámetros (pruebas en paralelo) era 69,0% (Tabla 2), que fue mayor que la sensibilidad logrados por la prueba de cualquiera de los parámetros solo. Se realizó un análisis de la curva ROC para evaluar la importancia de la tasa de metilación del ADN y el nivel de CEA para el diagnóstico de GC. El AUC para
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pruebas de metilación del promotor solo fue 0,610 (S1 figura) y que para la evaluación combinada de
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la metilación del promotor y el nivel de CEA (prueba de tándem) fue de 0.539 (S2 figura) . En particular, cuando
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la metilación del promotor y el nivel de CEA se ensayaron en paralelo, el AUC aumentó a 0.633 (figura 3). Con base en los resultados anteriores, la determinación combinada de la
fue encontrado Zic1
tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (pruebas en paralelo) para el diagnóstico de GC para ser sinérgico en comparación con el uso de cada método por sí solo.
Una curva ROC para evaluar la importancia de la detección combinada de los dos parámetros para el diagnóstico de GC.
determinación combinada de
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hipermetilación y el nivel de CEA en el grupo GPI.
En el grupo GPI, la sensibilidad y la especificidad de la determinación combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (prueba de tándem) fueron 15,8% y 100,0%, respectivamente (Tabla 3) . La evaluación combinada de estos dos parámetros (pruebas en paralelo) presentó la mayor sensibilidad al 65,3%, con un valor predictivo positivo alcanzando el 98,4% (Tabla 3). Se realizó un análisis de la curva ROC para evaluar la importancia de la tasa de metilación del ADN y el nivel de CEA para el diagnóstico GPI. El AUC para
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pruebas de metilación del promotor solo fue 0,792 (Fig S3) y que para la evaluación combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (pruebas en paralelo) fue 0,771 (Fig 4). Por lo tanto, la detección de
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promotor de la metilación podría ser una alternativa más eficaz para el diagnóstico de GPI.
Una curva ROC para evaluar la importancia de la detección combinada de estos dos parámetros para el diagnóstico GPI.
Discusión
Recientemente, se han encontrado numerosos genes a ser metilado en los tejidos GC, incluyendo
E-cadherina
,
RASSF1A
,
p16
,
GSTP1
,
SOCS1
,
SFRP1
y
PTEN
[17]. frecuencias de metilación reportados han oscilado entre el 56% y el 96% [17]. la metilación de ADN también se ha observado en muestras de sangre de pacientes GC. Se han encontrado varias ETG a ser metilado en muestras de sangre de pacientes con cáncer gástrico, incluyendo
p16
,
E-cadherina
, y
RAR
, con tasas de detección de 37% a 48%, respectivamente [18-21].
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está regulado por disminución de manera aberrante en ciertos tipos de cáncer, indicativos de su función como ETG. Nuestro trabajo previo ha puesto de manifiesto que el
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promotor es frecuentemente metilados en los tejidos de carcinoma gástrico primario, con una alta tasa de detección del 94,6%, pero no en los tejidos normales gástricas [14]. Nuestros resultados han revelado que
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es un nuevo candidato ETG que se downregulated a través de la hipermetilación del promotor en GC. Sin embargo plasma, a lo mejor de nuestro conocimiento, ningún estudio ha investigado
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promotor metilación en GC o GIN.
En el presente estudio, se demostró por primera vez que la metilación aberrante del
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promotor podría ser detectada en el plasma de pacientes GC y GIN en las frecuencias de 60,6% y 54,0%, respectivamente, que eran significativamente más alta que la de los CN. Estos resultados son consistentes con los de estudios anteriores [14]. Desde un punto de vista diagnóstico,
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la metilación del promotor exhibieron una alta especificidad para discriminar los Comités Nacionales de los pacientes con cáncer gástrico y la ginebra (100%). Nuestros resultados también demostraron que la detección de la
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tasa de metilación del promotor tenían un alto valor predictivo positivo y un cociente de probabilidad positivo y AUC para GC y el diagnóstico GIN, lo que sugiere que
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evaluación de la metilación del promotor tiene utilidad potencial para el diagnóstico y la predicción temprana de GC.
Muchos estudios anteriores se han centrado en la sangre periférica de metilación del ADN en GC en lugar de los pacientes GIN, con sólo un puñado de estudios centrados en la metilación del ADN en GIN. El desarrollo de técnicas endoscópicas ha permitido la disponibilidad de tratamientos más efectivos y menos invasivos para pacientes EGC y ginebra. En general, la detección de GIN contribuye al seguimiento de GC y la reducción de las muertes relacionadas con GC. Un aspecto interesante de este estudio es que hemos demostrado aberrante
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promotor de la metilación en el plasma de pacientes GIN, con una tasa de detección que fue significativamente mayor que la de los sujetos SC (p & lt; 0,001). En el futuro, la detección de hipermetilación del
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promotor podría ser utilizado como una señal de advertencia temprana o para la detección de GC en grupos de alto riesgo.
También evaluamos
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promotor de la metilación en el plasma de pacientes con cáncer gástrico en asociación con diferentes parámetros clínico. No se observaron relaciones estadísticamente significativas fueron entre los
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la metilación del promotor y los diversos parámetros clínicos, incluyendo el tamaño del tumor, grado de diferenciación, los ganglios linfáticos, la profundidad de la invasión tumoral y el estadio TNM; Sin embargo, en nuestro estudio anterior [15],
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metilación se ha encontrado a participar en la invasión de GC. En el presente estudio, la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico fueron diagnosticados y tratados en una etapa temprana, que puede haber influido en los resultados finales. Validación en una población más grande podría ayudar a comprender estos resultados diferentes. Si existe alguna correlación entre aberrante
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la metilación del promotor y las características clínicas de GC requiere una clarificación por su posterior análisis.
El CEA es un marcador tumoral clásico que se evalúa habitualmente en la clínica. Este marcador se considera que es el más frecuentemente presentes en los pacientes GC finales; Sin embargo, muchos estudios han indicado que la metilación del ADN se puede detectar a partir de las primeras etapas de GC. En nuestro estudio, una curva ROC fue generada para evaluar la importancia de la detección combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (pruebas en paralelo) para el diagnóstico de GC, revelando que su detección combinada produjo más resultados significativos que la detección de cualquiera de los parámetros solos. Por lo tanto, se sugiere que la medición combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA puede mejorar el diagnóstico de GC.
En conclusión, nuestros resultados han puesto de manifiesto que la medición de
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promotor de la metilación en el ADN derivado del plasma es de importancia para la detección precoz de la GC y para la evaluación del riesgo en poblaciones de alto riesgo. La medición combinada de la
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tasa de metilación del promotor y el nivel de CEA (pruebas en paralelo) pueden elevar las directrices actuales para el diagnóstico precoz de GC; Sin embargo, se necesitan más estudios con muestras de mayor tamaño y la validación clínica.
Apoyo a la Información
S1 Fig. La detección de muestras de plasma
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promotor de la metilación en el cáncer gástrico (CG).
Una curva ROC para evaluar la importancia de la
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pruebas de metilación del promotor para el diagnóstico de GC.
Doi : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. detección combinada de las muestras de plasma
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la metilación del promotor y el nivel de CEA (prueba de tándem) en el cáncer gástrico (CG).
Una curva ROC para evaluar la importancia de la detección combinada de los dos parámetros (pruebas de tándem .) para el diagnóstico de GC
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. La detección de muestras de plasma
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promotor de la metilación en la neoplasia intraepitelial gástricos (GPI).
Una curva ROC para evaluar la importancia de la
Zic1
promotor metilación prueba para el diagnóstico de GPI.
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003 gratis (TIF)