Extracto
La regulación epigenética de los genes implica la coordinación de la metilación del ADN y las histonas modificaciones para mantener el estado transcripcional. Estas dos características se alteran con frecuencia en tumores malignos tales que los genes críticos sucumben a la inactivación. 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC) es un agente que inhibe la ADN metiltransferasa, y tiene un gran potencial como un tratamiento para el cáncer, sin embargo, el alcance de su eficacia varía mucho entre los tipos de tumores. La evidencia previa sugiere estado de expresión después de la exposición 5-aza-DC no puede explicarse por el estado de metilación del ADN solo.
Objetivo
Hemos tratado de identificar cambios en la cromatina involucrados con la reactivación de genes a corto y largo plazo tras 5-aza-dC exposición. Dos líneas celulares de cáncer colorrectal, HCT116 y SW480, se trataron con 5-aza-dC y luego crecer en medio libre de drogas para permitir ADN re-metilación. metilación del ADN y la cromatina modificaciones fueron evaluados con la secuenciación de bisulfito y el análisis de la cromatina inmunoprecipitación.
Resultados
El aumento de acetilación H3, H3K4 tri-metilación y la pérdida de H3K27 tri-metilación se asociaron con la reactivación. hypermethylated genes que no muestran un aumento de la acetilación se expresaron de forma transitoria con el tratamiento con 5-aza-DC antes de volver a un estado inactivo. Tres genes reactivados, CDO1, HSPC105 y MAGEA3, se expresan todavía 10 días después de la 5-aza-DC tratamiento y muestran hipometilación localizada en el sitio de inicio de la transcripción, y también un mayor enriquecimiento de la acetilación de la histona H3.
Conclusiones
estas observaciones sugieren que la hipometilación sí sola es insuficiente para reactivar los genes silenciados y que el aumento de la acetilación de la histona H3 en unísono con la hipometilación localizada permite la reversión a largo plazo de estos genes silenciados epigenetically. Este estudio sugiere que los inhibidores de ADN metiltransferasa y la histona deacetilasa combinadas pueden ayudar a la reactivación a largo plazo de los genes silenciados
Visto:. Mossman D, Scott RJ (2011) a largo plazo de la transcripción de genes Reactivación epigenetically silenciado en células de cáncer colorrectal Requiere ADN hipometilación y acetilación de histonas. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10.1371 /journal.pone.0023127
Editor: Michael Freitag, Universidad Estatal de Oregón, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2010; Aceptado: 12 de julio de 2011; Publicado: 4 Agosto, 2011
Derechos de Autor © 2011 Mossman, Scott. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por fondos de la NBN Teletón, la Universidad de Newcastle y el Instituto de Investigación médica Hunter. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El genoma humano contiene aproximadamente 3 mil millones de pares de bases de ADN [1] que requieren envases estratégica en una estructura compacta, pero dinámica. La condensación se consigue con el superenrollamiento de ADN ~147 pb alrededor de un octámero de proteínas histonas (dos copias de cada H2A, H2B, H3 y H4) para formar un nucleosoma [2] que impide la expresión de genes accidental y aumenta la dependencia de activadores de la transcripción [ ,,,0],3]. Represión transcripcional puede estar mediada por la metilación del ADN y es asistido por extensas modificaciones en los residuos de lisina muy conservadas en las colas de las proteínas histonas. acetilación de lisina facilita la transcripción por el debilitamiento de la asociación de la histona y unión al ADN [4] y permite factor de transcripción [5]. metilación lisina es más complejo y se puede asociar con las dos regiones activas y reprimidos de ADN, y puede estar presente en mono-, bi-, y tri-metilado formas [6]. Por ejemplo, trimethylation de la histona H3 lisina 4 (H3K4me3) es una marca activa [7], mientras que la metilación de H3K9 y H3K27 aparece en los promotores de genes transcripcionalmente silenciosos [7], [8].
silenciamiento epigenético aberrante de genes puede iniciar malignidad y con frecuencia aparece además de alteraciones genéticas, lo que contribuye a la progresión de la enfermedad en varios tipos de cáncer [9], [10], [11]. Además, la hipometilación aberrante de proto-oncogenes puede conducir a su activación [12], [13] La reducción de expresión de numerosos genes debido al silenciamiento epigenético se correlaciona con mal pronóstico en muchas formas de tumores malignos como el de pulmón [14], el melanoma [15] , de mama [16], gástrico [17] y de colon [18]. En raras ocasiones, la metilación de mono-alélica en todo el soma de MLH1 se ha demostrado que surgen a través de la transmisión de la línea germinal [19]. Además, las variaciones del número de copias hereditarios pueden dar lugar a la transcripción y leer a través de in-
cis
metilación cuando están adyacentes a los genes clave [20]. Estos mecanismos ofrecen una explicación de por qué algunas familias están en un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad a pesar de no llevar a una mutación genética subyacente de los genes cruciales. Los individuos dentro de estas familias podrían beneficiarse de la detección precoz de las marcas epigenéticas aberrantes en los genes que confieren un riesgo elevado de una enfermedad en particular. Con un aumento de la conciencia de las anomalías en la enfermedad epigenéticos, contrarrestando estos cambios con los inhibidores de la metiltransferasa tales como 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC) parece ser un tratamiento potencialmente eficaz. En realidad, este tratamiento no es eficaz en un grupo específico de tipos de tumores [21], lo que puede deberse a los genes reactivados revierten a un estado silenciada tras el cese del tratamiento.
Hemos identificado previamente la reactivación de numerosas genes en líneas celulares de cáncer colorrectal después del tratamiento con el agente de desmetilación 5-aza-dC [22]. Tras la retirada del fármaco y diez días de crecimiento, algunos de estos genes permaneció altamente expresado, lo que sugiere un cambio del estado de la transcripción de estos genes. Aunque se ha reducido en un 5-aza-DC, los cambios en la metilación del ADN no se correlacionaron con los niveles de expresión en el grupo de genes analizados, lo que indica otras modificaciones epigenéticas estaban controlando la transcripción. Los genes seleccionados para el análisis se examinaron debido a su participación en una gama de tipos de tumores y su posible uso como biomarcadores en estos tumores [23], [24], [25], y /o debido a su fuerte re-expresión y el patrón de la expresión génica después de 5-aza-dC en células de cáncer de colon [22]. CDKN2A se eligió específicamente en lo que se reprime con frecuencia en tumores de cáncer de colon [26]. Estos genes pueden representar genes importantes en el desarrollo epigenético de un número de tipos de tumores. En este estudio hemos caracterizado los cambios en la metilación del ADN y la cromatina estado que permiten, ya sea para una reactivación largo o corto plazo de expresión después de la exposición 5-aza-DC.
Métodos
Cultivo Celular
cultivos por triplicado de células HCT116 y SW480 se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células fueron tratadas con 5-aza-2 'desoxicitidina (Sigma-Aldrich) como se describe anteriormente [22]. ADN y ARN se extrajeron a partir de células no tratadas, 5-aza-dC células tratadas (72 h de tratamiento), y a las 4 y 10 días después del cese del tratamiento (día 4 y 10 de re-metilación). Las células fueron obtenidas de la ATCC y se autentican utilizando el kit de ADN Identifiler identificación (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
metilación global
metilación global fue evaluado como se describe anteriormente [22]. En resumen, 50 g de ADN se digirió enzimáticamente con nucleasa P1 (biológicas Estados Unidos, Swampscott, MA, EE.UU.), seguido de separación cromatográfica en una estación de trabajo Varian estrella cromatografía con una columna Supelcosil LC-18-DB (Sigma-Aldrich). Se monitorizó la absorbancia a 278 nm y áreas de los picos se cuantificaron con Star Software Crítico (Varian, Palo Alto, CA, EE.UU.). El contenido de 5-metilcitosina se expresó como un porcentaje de la reserva total de citosina después de la corrección de extinción coeficientes.
bisulfito de Secuenciación
ADN fue convertido por duplicado utilizando un kit de conversión Qiagen Epitect bisulfito ( Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), utilizando 2 g de fenol-cloroformo ADN purificado. Las muestras se eluyeron en 30 l de tampón de elución y una parte alícuota se diluyó 1:03 antes de la PCR y se almacenaron a 4 ° C, mientras que la fracción restante se almacenó a -20 ° C. islas CpG que rodean el sitio de inicio de la transcripción de los genes fueron objeto de análisis por PCR utilizando los cebadores enumerados en la Tabla S1. Las reacciones de secuenciación se realizaron por duplicado y se analizaron en un ABI 3730 secuenciador. El análisis de datos se realizó utilizando el software de escáner Secuencia (Applied Biosystems). El porcentaje de metilación en cada CpG se determinó dividiendo el pico de la citosina por las alturas de los picos combinados de citosina y timina como se describe anteriormente [27].
tiempo real de análisis PCR de la expresión génica
ARN se convirtió en ADNc usando Superscript II (Invitrogen) y cebadores aleatorios (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se realizaron por triplicado usando los cebadores listados en la Tabla S1, 2 × SYBR Green (Applied Biosystems) en un PRISM 7500 máquina de PCR ABI (Applied Biosystems). C
valores T se determina automáticamente por el software de detección de secuencias versión 1.4 y cálculos finales se expresaron como diferencias veces en comparación con B-actina utilizando el ΔΔC
T método. Los genes con expresión sin ser detectados se les asignó un C
valor T de 40. Las barras de error en las cifras de expresión representan el error estándar.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y Análisis de
En pocas palabras, la reticulación de ADN con las proteínas y la lisis celular se realizó utilizando el EZ-Magna chIP a Kit (Upstate /Millipore) según las instrucciones del fabricante. La sonicación se realizó usando 8 x ciclos de 30 segundos en el ciclo de trabajo del 60% en un baño de hielo y las muestras se enfría adicionalmente durante 30 segundos entre los ciclos de sonicación. Inmunoprecipitación de cromatina se realizó como se describe anteriormente [28], con ligeras modificaciones. Los anticuerpos se obtuvieron de Upstate (números de catálogo; a-H3Ac 06-599, α-H3K4me3 07-473, α-H3K9me3 17-625, α-H3K27me3 17-622) con la excepción de la IgG de conejo anticuerpo no específico de Santa Cruz de Biotecnología (número de catálogo SC2027). cantidades de anticuerpos por reacción fueron determinados en experimentos preliminares y fueron 5 l de α-acetil H3, 5 l de α-H3K4me3, 4 l de α-H3K9me3, 4 l de α-H3K27me3. 5 l de IgG de conejo se añadió a las muestras de control negativo. enlaces cruzados se invirtieron con la adición de 20 l de proteinasa K (Promega) y se incubaron a 62 ° C durante 3 h con agitación. El ADN recuperado se purificó usando un kit PCR Clean Up (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.).
tiempo real PCR análisis de la cromatina inmunoprecipitada
ADN se cuantificó usando el sistema de cuantificación de ADN (Promega ) según las instrucciones del fabricante, y las mediciones fueron tomadas utilizando un luminómetro TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El tiempo real de las reacciones de PCR se realizaron usando 200 ρg de plantilla de ADN con SYBR Green 2 × Mastermix (Applied Biosystems) y los cebadores enumerados en la Tabla S1. Las reacciones se realizaron por triplicado y se llevaron a cabo usando una máquina de PCR ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems). C
valores T se ha determinado automáticamente por el software de detección de secuencias versión 1.4 (Applied Biosystems) y los valores finales se expresan como un porcentaje de la fracción de entrada. Las barras de error en las cifras de cambio de la cromatina representan el error estándar.
Análisis estadístico
Las desviaciones estándar se calcularon y se empleó un T-test para comparar los niveles de expresión y niveles de modificación de histonas en células tratadas con fármaco contra sin tratar Células.
P
-valores inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
Genómica metilación del ADN con 5-aza-DC tratamiento
metilación global niveles disminuyeron después del tratamiento con 5-aza-dC en un 53% y un 59% en el HCT116 y SW480 líneas celulares, respectivamente (figura 1). Esto representa una disminución significativa en comparación con las células que eran modelo de tratamiento que no hayan sufrido desmetilación (HCT116 valor de p = 0,003, SW480 valor de p = 0,017). Seguido de incubación de las células durante otros diez días después del tratamiento en un medio libre de drogas permitidas ADN re-metilación y nivel genómico se incrementaron, pero no volver al mismo nivel que antes del tratamiento observado en este periodo.
metilación genómica niveles disminuyeron significativamente en ambas líneas celulares después de la exposición 5-aza-dC. los niveles de metilación genómica fueron restaurados gradualmente durante los próximos diez días de crecimiento libre de drogas en los que se acercaban a los niveles previos al tratamiento con la droga.
Gene metilación específica y re-expresión con 5-aza-DC tratamiento
Uso del genoma amplias gamas de expresión que hemos identificado previamente los patrones de expresión de genes después del tratamiento dC-5-aza [22]. Los mismos genes fueron examinados de nuevo en este estudio para permitir la caracterización de modificaciones de las histonas. En este experimento, la expresión se determinó con PCR cuantitativa y genes fueron clasificados en cinco categorías; "Siempre expresado '(expresión detectado en todos los tiempos)," hasta reguladas' (dos veces en la expresión después de 5-aza-DC tratamiento), 'a largo plazo reactivado' (no detectado en las células no tratadas, pero expresó después del tratamiento, así como cuatro y diez días después de la exposición al fármaco (basado en un C
valor T de 40 para las transcripciones no detectables)), "corto plazo reactivado '(lo mismo que" a largo plazo reactivado', con la excepción del cuarto día y /o diez expresión que se requiere para ser & lt; 100 veces por encima del nivel de las células no tratadas), o el "otro" (cualquier otro patrón de expresión génica)
los tres genes que fueron reactivadas durante un breve período de tiempo (. CXCL6 y ZFP3 en las células HCT116 y CDKN2A en las células SW480) fueron todos hypermethylated en toda la región ensayada de sus islas CpG. El patrón de expresión de estos genes era muy diferente en la otra de las dos líneas celulares; aquí, estos genes mostraron muy poca o baja metilación en el sitio de inicio de transcripción (TSS) y se expresaron ya sea continuamente o se convirtieron hasta reguladas (figura 2). Los genes que permaneció altamente expresado después de la reactivación (CDO1, HSPC105, MAGEA3) muestran perfiles de metilación único y presentaron un sitio CpG hypomethylated adyacente al sitio de inicio de transcripción (TSS) como se muestra en la figura 3. La desmetilación específica isla CpG después del tratamiento fue de 10 15% como máximo ,, por lo tanto, sólo los patrones de metilación no tratados se muestran en la Figura 2 y 3. los datos para los cuatro puntos de tiempo se muestra en la Figura S1 para el gen MAGEA3 que muestra la mayor disminución asociada de genes en la metilación del ADN. Un ejemplo de los cromatogramas de secuenciación directa de MAGEA3 se muestran en la Figura S2
A - CXCL6 la isla CpG metilación.; v corto plazo siempre expresa. (B) - las células SW480 muestran hipometilación y CXCL6 se expresó en todos los puntos de tiempo. (C) - hipermetilación Uniforme de la línea celular HCT116 se asoció con una reactivación a corto plazo de la expresión. D, E, F - CDKN2A metilación CpG Island; A corto plazo v expresión constante. células SW480 muestran hipermetilación del gen CDKN2A y fueron temporalmente re-expresadas, mientras que en las células HCT116 CDKN2A está metilado ~ 50% a los sitios CpG cerca de la SAT, y se expresó en todos los momentos. Los asteriscos denotan cambio significativo en comparación con las células no tratadas. G, H, I - ZFP3 la isla CpG metilación; A corto plazo v expresión hasta reguladas. células SW480 mostraron hipometilación en CpG sitios cerca de la SAT y la expresión se reguló hasta después del tratamiento-5-aza-DC. ZFP3 permanece hypermethylated en células HCT116 y se reactivó temporalmente con tratamiento con 5-aza-dC. J - Cambios significativos en modificaciones de las histonas en comparación con las células no tratadas (p & lt; 0,05).
A, B, C - CDO1 la isla CpG metilación; v largo plazo corto plazo expresado. El análisis de secuenciación reveló CpG sitios cerca de la SAT en las células SW480 tienen metilación más baja y se muestran expresión a largo plazo en comparación con las células HCT116 que se hypermethylated uniformemente en CDO1 y experimentaron un patrón plano de la expresión regulada. D, E, F - HSPC105 la isla CpG metilación; Siempre expresado-v largo plazo expresado. La línea celular SW480 muestra localizada hipometilación en el SAT y puede quedar expresado diez días post-tratamiento. La línea celular HCT116 se hypomethylated en el promotor HSPC105 y se expresa continuamente. G, H, I - MAGEA3 la isla CpG metilación; v expresado siempre-largo plazo re-expresado. células SW480 muestran hipometilación localizados en el SAT y se expresan diez días post-tratamiento. células HCT116 muestran ~ 50% de metilación en el SAT y MAGEA3 se expresa en todos los puntos de tiempo. J - Cambios significativos en modificaciones de las histonas en comparación con las células no tratadas (p & lt; 0,05).
Los genes determinados como "siempre expresado 'se muestra un máximo de 50% de metilación en el SAT que sugiere mono-alélica metilación, y hasta reguladas genes muestran diferentes patrones de metilación. El gen MLH1 se expresó en ambas líneas celulares y la metilación no se detectó en la isla CpG TSS asociado (datos no mostrados). A la inversa, una variante de DICER1 no se expresó en cualquiera de las líneas de células en cualquier punto de tiempo como se determina por el análisis de microarrays y la ausencia de su expresión fue confirmada por PCR cuantitativa. DICER1 no está asociado con una isla de CpG, por lo tanto, no se realizó el análisis de secuenciación de bisulfito. CDKN2A se expresó en HCT116 y mostró metilación parcial en el SAT. La región correspondiente en las células SW480 se hypermethylated y expresión fue clasificado como corto plazo reactivado después del tratamiento.
Continúa la incubación de las células en medios libres de drogas permitido volver a la metilación del ADN, que volvió a los niveles originales en las islas CpG promotoras . La expresión de genes no necesariamente se ve afectado por el regreso de la metilación del promotor sin embargo, y la expresión de la CDO1, HSPC105 y MAGEA3 genes en las células SW480 se mantuvo alta diez días después de tratamiento con 5-aza-DC. Estos genes únicos muestran patrones de metilación isla CpG que cuentan con sitios CpG hypomethylated adyacentes a la SAT. A medida que los niveles de metilación en las islas CpG promotoras no reflejar con exactitud la expresión de los genes estudiados, hemos tratado de examinar los patrones de modificaciones de las histonas en las respectivas islas CpG que pueden explicar los altos niveles de expresión.
modificaciones de la cromatina después 5-aza-dC exposición
inmunoprecipitación de cromatina y q-PCR revelaron que la histona H3Ac y H3K4me3 eran características asociadas con los genes expresados, tales como GAPDH y MLH1 y genes reprimidos se asociaron con H3K9me3 y menos frecuentemente H3K27me3 que estaban ausentes de genes expresados constitutivamente .. chip resultados se resumen en la Figura 2 y 3, con p-valores listados en la Tabla 1. Los cambios específicos en modificación de la cromatina se muestran en las Figuras S3, S4, S5, S6.
los cambios en las proteínas de la cromatina siguientes 72 h de exposición dependían del estado de la expresión génica. Los genes con una mayor expresión después de tratamiento aumentó en H3K4me3, mientras H3Ac solamente se asoció con genes reactivados por períodos más largos. Generalmente las marcas represivas H3K27me3 se redujeron después del tratamiento, con la excepción del gen de CXCL6. Una comparación de modificaciones de las histonas en genes reactivados a corto plazo reveló aumento transitorio de la histona H3K4me3 y la disminución o nivel estable de lisina H3 histona trimetil-9 y 27. A pesar de esto, la transcripción de estos genes de diez días después del tratamiento se encontraba en un similares a las células no tratadas. La diferencia más evidente entre los genes sola reactivados corto y largo plazo fue la modificación H3Ac. Los genes que constituyen «a largo plazo reactivado 'reveló un aumento de H3Ac, aunque no siempre alcanzar significación estadística, después del tratamiento que persistió hasta diez días después del tratamiento de drogas. También había una tendencia en el restablecimiento de los genes expresados a largo plazo en los que se observó una reducción en H3K27me3 Los genes regulados (CDO1 en las células HCT116 y ZFP3 en SW480) y los genes que siempre se expresaron mostró una ganancia de marcas de cromatina activa y una pérdida de modificaciones de las histonas represivas después de 5-aza-dC exposición.
Discusión
El control epigenético de la expresión génica está mediada por metilación del ADN y modificaciones de las histonas. Al alterar la metilación del ADN y hasta la regulación de la expresión génica podemos identificar patrones de cambio en modificaciones de las proteínas histonas que acompañan el largo y corto plazo la reactivación de los genes silenciados epigenetically. De particular relevancia para este estudio fue el de la transcripción aparente sobre regulación de los genes silenciados que mostraban menos del 15% desmetilación del ADN, donde las modificaciones de histonas son propensos a estar involucrados en la regulación de la expresión génica en estos casos.
El efecto de la metilación del ADN en la expresión génica
Independientemente del patrón de expresión durante el tratamiento de drogas, el grado de metilación de las islas CpG particulares se mantuvo relativamente sin cambios en comparación con los niveles genómicas después de la exposición 5-aza-dC. Esta observación se ha hecho anteriormente, con la metilación de secuencias repetidas que puedan contribuir a esta discrepancia [22], [29]. Otro estudio ha demostrado que la metilación del ADN aumenta en promotores de genes no expresados cuando inhibida por doxiciclina en un sistema promotor tet-sensible [30]. genes expresados constitutivamente se hypomethylated en ambos alelos, o exhiben la isla CpG de metilación del 50% que indica la metilación mono-alélica, tal como el gen CDKN2A en las células HCT116 como se muestra anteriormente [31]. desmetilación leve de las islas CpG del promotor se indujo con 5-aza-dC, sin embargo, la expresión no se limita necesariamente en algunos genes cuando la metilación volvió a los niveles originales. Alta expresión de genes reactivados a largo plazo parece ser dependiente de la hipometilación pre-existentes en el TSS independientemente de si los sitios CpG adyacentes fueron hypermethylated. Este resultado indica el patrón de metilación en lugar del nivel general de metilación a través de la isla CpG es crucial para volver a activar genes silenciados a través de interacciones con otros factores epigenéticos. sitios CpG hipometilados dentro de los promotores hypermethylated se han identificado previamente en el gen del receptor de la oncostatina M [27], pero el efecto de esta hipometilación en la transcripción no se examinó. ¿Por qué la expresión de los genes a largo plazo reactivadas no se produjo en las células no tratadas, que está representada un patrón de metilación casi idéntica puede explicarse por los cambios en las modificaciones de las proteínas histonas.
El efecto de las modificaciones de las histonas en la expresión génica
Una instantánea de los factores que regulan la expresión de genes se logró con la compilación de secuenciación isla CpG y los resultados de inmunoprecipitación de la cromatina. Tras la reactivación de numerosos genes y la clasificación de expresión, podríamos distinguir entre los genes sobre la base de los cambios de metilación y cromatina presentes. Antes del tratamiento, transcripcionalmente genes inactivos se caracterizaron por niveles más altos de modificaciones represivas y niveles más bajos de las marcas activadoras. Tras el tratamiento con 5-aza-dC en general, había un aumento de los niveles de H3K4me3 y H3K9me3, mientras H3Ac aumentó sólo en algunos de los genes. Las reducciones a H3K27me3 ocurrieron en los genes que mostraron inicialmente este rasgo. Con respecto a modificaciones de la cromatina, fue durante el periodo de crecimiento libre de drogas que la acetilación de histonas se convirtió en la característica más distinguible entre los genes reactivados a corto y largo plazo. promotores de genes reactivados a largo plazo se asoció cada vez más con la acetilación de la histona H3 ayudando con la activación de genes sin embargo, sólo alcanzado niveles significativos después de diez días de crecimiento libre de drogas. Temporalmente genes reactivados no atrajeron a esta modificación a pesar de un breve período de expresión. Por tanto, parece que la introducción de H3 acetilación es un factor crucial en la reversión de estado de la transcripción de un gen silenciado epigenetically que está asistido por la hipometilación del ADN localizada. Con la excepción de H3K27me3 en CDKN2A en las células SW480, cambios duraderos a las modificaciones epigenéticas no se observaron en los genes reactivados temporalmente.
La sobre regulación de los genes expresados humilde se asoció con mayor acetilación H3 y H3K4me3, tales como el gen ZFP3 en las células SW480. los perfiles de metilación como esto puede indicar un intermedio entre los genes expresados siempre-y los genes reactivados a largo plazo. Coexistiendo marcas activos y represivas puede permitir un nivel restringido de la transcripción, lo que sugiere el control de la expresión de estos genes depende de equilibrio de ambos tipos de modificaciones
.
En los genes examinados en este estudio, los papeles de acetilación de histonas H3 y H3K27me3 fueron evidentes como la activación y la represión de marcas respectivamente, sin embargo el efecto de H3K4me3 y H3K9me3 no parece suficiente para alterar la expresión de genes en una base a largo plazo. Después de 5-aza-DC de la exposición, H3K9me3 se incrementó con frecuencia en los genes expresados cual concuerda con los hallazgos recientes que también se puede acoplar con la activación de genes [29], [32], [33]. Del mismo modo, H3K4me3 que se asocia con las regiones activas del genoma fue encontrado en genes inactivos, aunque a un nivel reducido. Las observaciones de esta naturaleza ponen de manifiesto la naturaleza dinámica de la cromatina y, posiblemente, sugieren una forma intermedia de represión similar a la cromatina que rodea bivalente genes de desarrollo [34] o el efecto de la vecina de la cromatina que ha sido detectado debido a las variaciones en la eficiencia de cizallamiento durante la sonicación.
Vinculación de la metilación del ADN, modificaciones de la cromatina y la expresión génica
los patrones de expresión de re-activados y hasta reguladas genes pueden explicarse en gran medida con la combinación de análisis de la metilación del promotor y los ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Mediante la observación y la comparación de los genes de largo y corto plazo reactivado, nuestros resultados muestran que los genes con una hipometilación localizada en el SAT son más propensos a experimentar un aumento de la acetilación de histonas H3 y permanecen expresaron después de 5-aza-DC exposición. Además se observó que la expresión de genes específicos se reactivó sin mayor cambio en la metilación isla CpG asociada y esto era independiente de la cercana hipermetilación dentro de la misma isla CpG.
Una secuencia de eventos involucrados con la reactivación epigenética ha sido propuesto por Litt
et al.
[35]. Los autores afirman que la reactivación de la hemi-desmetilación gen HPRT requerida del promotor, "apertura" de la estructura de la cromatina, de unión al factor de transcripción y el montaje del complejo de transcripción antes de la síntesis del ARN HPRT. En base a los experimentos, podemos extender este conocimiento por lo que sugiere que la desmetilación menor inducida por 5-aza-DC y el aumento de H3K4me3 permite la iniciación de la transcripción. El papel de trimethylation H3K9 no está clara, pero puede estar asociada con la reactivación en algunos casos. Una pérdida de marcas represivos como H3K27me3 también puede aumentar aún más la transcripción. Aunque no se examinan aquí, es posible MBD2 de unión podrían perderse en este punto que ya no disuadir a la histona acetiltransferasa de la región [36]. La transcripción se prolonga si se produce el aumento de la acetilación de la histona H3, de lo contrario la expresión es transitoria y la expresión génica es probable que volver a un estado inactivo.
metiltransferasa inhibidores en el tratamiento de tumores
Estudios anteriores han demostrado la genes utilizados en este estudio sucumben a la metilación en otros tumores malignos, tales como ciertas formas de cáncer de mama [24] y [37] el cáncer de ovario. Por lo tanto, la reactivación descrito en este estudio no puede limitarse a cáncer colorrectal, pero también otros tipos de tumores donde la reversión de la represión epigenética puede ser de beneficio terapéutico. Eficacia del 5-aza-DC como tratamiento se limita a ciertos tipos de tumores, sin embargo, lo que provoca un resultado favorable de 5-aza-DC tratamiento se desconoce. Su éxito puede estar en el patrón de metilación en los genes diana Actualmente no-identificados y la capacidad de los fármacos para reactivar los genes silenciados durante un período de tiempo más largo. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que los genes reprimidos que muestran localizada hipometilación TSS pueden ser reactivados con metiltransferasa /histona desacetilasa tratamiento inhibidor combinado. El aumento de la acetilación en los sitios de inicio de transcripción hypermethylated que conducen a la reactivación a largo plazo de genes anti-proliferativos puede ser beneficioso en el tratamiento de tumores cuando se conoce esta información. Este mecanismo sería, además de los informes sobre la apoptosis efecto sinérgico de los inhibidores de la histona deacetilasa metiltransferasa y [28], [38].
Conclusión
El análisis de la cromatina en el promotor de los genes en este estudio sugiere que la hipometilación existente siguiente (pero no necesariamente inducida por) 5-aza-dC tratamiento, ayuda a la histona H3 acetilación, ya sea directa o indirectamente. La combinación de la hipometilación de sitios CpG en el resultado acetilación TSS y H3 en la reactivación estable de los genes estudiados aquí. Los resultados de este estudio destacan las características epigenéticos que necesitan ser modificados con respecto a la reversión del estado transcripcional de genes en el tratamiento de la enfermedad. Un enfoque más estratégico conducirá al desarrollo de terapias epigenéticas en lugar de la utilización de fármacos epigenéticos modificadores como terapias citotóxicas.
Apoyo a la Información
Figura S1. La metilación de
MAGEA3 en las células SW480 tratadas con 5-aza-DC. secuenciación de bisulfito de PCR se realizó en cada punto de tiempo y se representó gráficamente para mostrar los cambios antes y después de tratamiento con 5-aza-dC, el gen MAGEA3 mostró la mayor desmetilación de todos los genes ensayados, con una disminución de 10 a 15% en varios sitios CpG cerca el gen SST
doi:. 10.1371 /journal.pone.0023127.s001 gratis (TIF)
figura S2.
metilación en el MAGEA3 transcripción de inicio del sitio. A - metilación del promotor en toda la isla CpG MAGEA3. La barra roja indica la región de la secuencia que se muestra en B y C. B - La metilación en el MAGEA3 SST en las células SW480. La secuenciación directa de productos de PCR de bisulfito provoca picos T dual C y en los sitios de CpG, y son representativos de alelos metilados y no metilados, respectivamente. El sitio CpG adyacente a la SAT muestra una mayor proporción de alelos T (que representan la citosina no metilada) que indica la hipometilación, mientras que los sitios CpG cercanas muestran un aumento de los picos y los niveles de metilación de citosina superiores. Las flechas indican los sitios CpG, de T en caja indican la posición de no CpG citosina y la secuencia subrayada representa el sitio de inicio de la transcripción. C - sitios CpG en la línea celular HCT116 son mayores que el 50% metilado
doi: 10.1371 /journal.pone.0023127.s002 gratis (TIF)
Figura S3..