Extracto
α-tomatina, un glicoalcaloide tomate, se ha informado que poseen propiedades antibióticas contra patógenos humanos. Sin embargo, el mecanismo de su acción contra la leucemia sigue siendo poco clara. En este estudio, se evaluó el potencial terapéutico de α-tomatina contra las células leucémicas
in vitro
y
in vivo
. experimentos de viabilidad celular mostró que α-tomatina tenía efectos citotóxicos significativos en las líneas celulares de cáncer de leucemia humana HL60 y K562, y se encontró que las células de estar en la fase de Anexina V-positivo /yoduro de propidio-negativo de muerte celular. Además, α-tomatina inducida tanto HL60 y apoptosis de las células K562 en un ciclo-celular y de manera independiente de caspasas. α-tomatina exposición condujo a una pérdida del potencial de membrana mitocondrial, y este hallazgo fue consistente con la observada en la activación de la Bak y MCL-1 forma corta (MCL-1) proteínas. La exposición a alfa-tomatina también desencadena la liberación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias en el núcleo y las reguladas expresión de survivina. Por otra parte, α-tomatina inhibió significativamente el crecimiento de tumores de xenoinjertos HL60 sin causar pérdida de peso corporal en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). prueba de inmunohistoquímica mostró que el crecimiento del tumor reducida en los ratones tratados con α-tomatina fue resultado del aumento de la apoptosis, que se asoció con un aumento de translocación de la AIF en el núcleo y la disminución de la expresión de survivina
ex vivo. Estos resultados sugieren que la α-tomatina puede ser un candidato para el tratamiento de la leucemia
Visto:. Chao MW, Chen CH, Chang YL, Teng CM, SL Pan (2012) α-tomatina mediada por la actividad anti-cáncer
in vitro
y
En Vivo
a través de la célula y ciclo-Caminos independiente de caspasas. PLoS ONE 7 (9): e44093. doi: 10.1371 /journal.pone.0044093
Editor: Ferenc Gallyas, Universidad de la Escuela de Medicina de Pecs, Hungría
Recibido: 13 Febrero, 2012; Aceptado: July 30, 2012; Publicado: 6 Septiembre 2012
Copyright: © Chao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC 99-2320-B400-008-MY3) y (NSC-99 a 2628 B002-024-MY3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
α-tomatina es una glicoalcaloide que se encuentra en el tomate (
Lycopersicon esculentum
). En primer lugar, se aisló mediante Fontaine
et al
, y se encontró que era abundante en los tomates verdes inmaduros (500 mg α-tomatina /kg de fruta fresca) [1]; sin embargo, es en gran parte degradada como tomates maduran (5 mg /kg) [2]. Se han notificado los efectos antibióticos e inmunológicas de α-tomatina [3], [4]. α-tomatina También ha expuesto anti-proliferativa y actividad apoptótica a través de la inactivación de la phosphoinostide 3-quinasa (PI3K) /Akt o el factor nuclear (NF) de activación -κB en líneas celulares de tumores sólidos tales como células de hígado, colon, y cáncer de pulmón [1], [5], [6]. Sin embargo, se desconoce la función de la α-tomatina en las células leucémicas.
Leukemia, que es la neoplasia hematológica común, es un tumor maligno que afecta a las células precursoras de la sangre en la médula ósea. Las células sanguíneas inmaduras o incompletamente diferenciados se acumulan en la médula ósea y sustituyen a las células sanguíneas normales. En los últimos años, las tasas de incidencia y mortalidad por leucemia han aumentado y la quimioterapia ha sido la principal estrategia adoptada para el tratamiento y la cura de la leucemia. Sin embargo, el tratamiento más definitivo y eficaz para la leucemia ha sido el trasplante de médula ósea. Sin embargo, debido a la alta tasa de recurrencia de la leucemia, baja relación de éxito del trasplante de médula ósea, la falta de opciones de quimioterapia altamente selectivos, y los efectos adversos graves de los dos enfoques de tratamiento, los investigadores continúan buscando y desarrollar fármacos que sean más selectivos y menos tóxicos para el tratamiento eficaz de la leucemia [7].
la apoptosis es un tipo de muerte celular programada y la cascada de la apoptosis puede ser iniciado por dos vías principales, intrínsecos y las vías extrínsecas [8]. La vía intrínseca, también llamada la vía mitocondrial, puede desencadenar citocromo
c
liberación de las mitocondrias. La vía extrínseca, también llamada la vía del receptor de muerte, se activa por receptores de muerte tras la unión del ligando. La activación de caspasa es una característica común de los dos principales vías de apoptosis. Sin embargo, la muerte celular independiente de caspasas se ha informado, que se define como la muerte celular que no implique la activación de caspasa [9], [10]. Recientemente, además de las proteínas mitocondriales conocidos que se asocian con la activación de la caspasa, se han encontrado algunas proteínas mitocondriales para activar la muerte celular independiente de caspasas, incluyendo el factor inductor de apoptosis (AIF), endonucleasa G (Endo G), y HtrA2 ( Omi)
survivina es un miembro de bi-funcional del inhibidor de la familia de proteínas de apoptosis (IAP) que media la supervivencia y controles de células progresión del ciclo celular [11] - [13].. No se encuentra en los tejidos diferenciados normales, pero por lo general es sobre-expresado en tejidos de cáncer de humanos, especialmente en los tejidos de leucemia [14] - [16]. Cuando las células se exponen a estímulos tales como Fas /CD95, radiación o quimioterapia, survivina puede proteger de la muerte celular. Además, la survivina puede inhibir la caspasa-9 directamente y la caspasa-3 y -7 indirectamente mediante la unión a Smac /Diablo [17]. Además de su papel en la vía dependiente de caspasa, survivin se ha reportado que afecta a la ruta de la caspasa-independiente mediante la supresión de la liberación AIF, que proporciona una ruta alternativa para la supervivencia celular [12]. la expresión de survivina es también hasta reguladas en el G
2 /M fase de proliferación de las células [18]. Es un miembro del complejo de pasajeros cromosoma y desempeña un papel importante en la división celular. Por otra parte, muchos otros factores como la Wnt /β-catenina, citoquinas, AKT, y NF-kappa B se han reportado hasta de regular la expresión de survivina independiente del ciclo celular [12].
El propósito de este estudio fue investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la actividad de α-tomatina, que se aisló a partir de tomate, y para determinar su posible papel en el tratamiento de la leucemia. Nuestros resultados muestran que la α-tomatina tiene actividad anti-cáncer, tanto
in vitro
y
in vivo
. α-tomatina exposición induce la muerte celular leucémica independiente de la progresión del ciclo celular y la activación de la caspasa. Sin embargo, causó Bak y Mcl-1 de activación y, posteriormente, la pérdida de potencial de membrana, lo que provocó la liberación FIA. También inhibe la expresión de survivina, tanto
in vitro
y
in vivo
. Estos hallazgos sugieren que la α-tomatina puede ser un fármaco candidato prometedor para el tratamiento de la leucemia.
Materiales y Métodos
Materiales
α-tomatina se adquirió de Tokio de la Industria Química Co., Ltd. y disuelto en DMSO (dimetilsulfóxido), después se mantuvo a -20 ° C. RPMI 1640, suero fetal bovino (FBS), penicilina /estreptomicina se adquirieron de Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). La doxorrubicina, Z-VAD-FMK, rodamina 123, 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5 -diphenyltetrazolium, yoduro de propidio y todos los otros reactivos químicos utilizados en este estudio fueron adquiridos de Sigma Chemical ( St. Louis, MO, EE.UU.). Anexina V-FITC Kit de Detección de Apoptosis y los anticuerpos contra la caspasa-6 y caspasa-7 fueron adquiridos de BD Bioscience (San José, CS, EE.UU.). Anticuerpo contra la caspasa-3 fue adquirido de Imgenex (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra la caspasa-8, survivina, AIF, y la subasta fueron adquiridos de Señalización Celular (Beverly, MA). Anticuerpo contra actina fue adquirido de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Anticuerpo contra la caspasa-9 se adquirió de Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.). α-tubulina, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), MCL-1, Bcl-2, Bak, Bcl-XL, conjugado con HRP anti-ratón y anti-conejo se adquirieron de Santa Cruz (CA, EE.UU.).
Las líneas celulares
línea celular K562 de leucemia mieloide crónica humana y la línea celular de leucemia promielocítica aguda HL60 se obtuvieron a partir de bio-Recogida y Centro de Investigación. Ambos fueron cultivadas en medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvo en 5% de CO
2 a 37 ° C.
Cell viabilidad ensayo
La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. La deshidrogenasa mitocondrial en células vivas reduce 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio, MTT (amarillo) a formazán colorantes (púrpura). células K562 (3 × 10
5 /ml) y células HL60 (4 × 10
5 /ml) se sembraron en placa de 24 pocillos. Las células fueron tratadas con α-tomatina de 24 hr. Después del tratamiento con fármaco, se añadió 100 l solución de MTT (0,5 mg /ml en PBS) por pocillo a la placa de 24 pocillos y la placa se incubó a 37 ° C durante 1 hr. Finalmente, se añadió tampón de extracción 100 l (tampón de acetato de sodio 0,1 M) a la placa por pocillo para disolver los colorantes de formazano y la absorbancia se midió a 550 nm mediante un lector de ELISA (Packard, Meriden, CT, EE.UU.).
citometría de flujo análisis
el fenómeno de la apoptosis se detectó mediante la fosfatidilserina (PS) translocación de la membrana interna a la superficie celular externa. Y se marcaron con anexina V se puede unir a PS para detectar células apoptóticas. Después las células fueron tratadas con α-tomatina durante el tiempo, se recogieron las células y se tiñeron por yoduro de propidio (PI, 0,5 mg /ml) y solución de Anexina V-FITC (25 mg /ml) durante 15 min a temperatura ambiente. El porcentaje de células apoptóticas se analizaron por FACScan citómetro de flujo y el software CellQuest (Bectan Dickinson). contenido de ADN se puede utilizar para analizar el ciclo celular. Tras el tratamiento con α-tomatina durante el tiempo indicado, las células (5 × 10
5 /ml) se recogieron y se fijaron con 70% (v /v) de etanol frío de hielo a -20 ° C durante 30 min por lo menos. Las células fijadas se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), resuspensed en 0,2 ml de tampón de extracción de ADN (0,2 M Na
2HPO
tampón citritic M 4-0,1, pH 7,8) durante 30 min y se tiñeron con PI solución (80 mg /ml de yoduro de propidio, 100 mg /ml de RNasa a, y 1% de Triton X-100 en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. Los datos se analizaron por FACScan citómetro de flujo y el software CellQuest (Bectman Dickinson).
Medición del potencial de membrana mitocondrial
El potencial de membrana mitocondrial se controló por rodamina 123. rodamina 123, un tipo de fluorona lipófilo colorante con carga negativa, puede ser absorbido selectivamente en la membrana mitocondrial. Cuando se pierde el potencial de membrana mitocondrial, rodamina 123 no puede ser absorbido en la membrana. Las células fueron tratadas con la α-tomatina durante el tiempo indicado. Se añadió rodamina 123 (concentración final 10 mM) antes de se recogieron y se incubaron durante 30 min a 37 ° C las células. Entonces, finalmente, las células se recogieron, se enjuagaron con PBS y se analizaron por FACScan citómetro de flujo y el software CellQuest (Bectman Dickinson).
Western El análisis de transferencia
Después del tratamiento, las células (10
6cells /ml) se recogieron. sedimentos de células enteras se lavaron dos veces con PBS, se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, 10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, orthovandate de sodio 1 mM y NaF 1 mM) durante 30 min y posteriormente se centrifugó a 13.000 rpm a 4 ° C durante 30 min. Para la extracción de la proteína nuclear, los sedimentos celulares se lisaron en tampón A (Hepes 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, PMSF 0,2 mM, 0,5 mM de DTT, dH
2O). Después de la incubación en hielo durante 15 min, se centrifugaron las células a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min y después los gránulos se lavaron con tampón B (Hepes 10 mM, pH 7,9, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 25% de glicerol, dH
2O). Finalmente, los sedimentos se resuspendieron en tampón C (Hepes 20 mM, pH 7,9, NaCl 420 mM, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 0,2 mM, 25% de glicerol, PMSF 0,2 mM, DTT 0,5 mM) durante 20 min en hielo y se centrifugó a 13.000 rpm a 4 ° C durante 30 min. La proteína se cuantificó mediante el kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Para el análisis de transferencia de Western, la proteína se separó por electroforesis y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, bloquear la membrana con leche descremada durante 1 hora y se incubó con anticuerpo primario en PBS a 4 ° C durante la noche. En el día siguiente, la membrana se lavó con PBST (0,1% de Tween 20 en PBS) y se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 hr a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se lavó de nuevo con PBST y se detectó finalmente la señal con un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).
modelos de xenoinjertos de tumores
Para estimar el
In vivo
actividad antitumoral de α-tomatina, células HL-60 (10
8 células /ml) fueron inyectadas en 20 ratones inmunodeficientes graves combinados (SCID) por vía subcutánea. Cuando el tamaño medio del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron separados en dos grupos (un grupo de 10 ratones) y luego tratados con α-tomatina (5 mg /kg) en 5% de DMSO /5% Cremophor /90% D5W (5% de glucosa) por vía intraperitoneal. Una vez que el tamaño promedio del tumor fue mayor que 2,500 mm
3, se sacrificaron los ratones. Los tumores fueron resecados, se pesaron y se congelaron en formalina para experimentos de inmunohistoquímica. El tamaño del tumor se midió mediante medición del calibre (mm) y la fórmula esfera elipsoide (LW
2/2, L: longitud; W: anchura). Todos los procedimientos fueron seguidos por la Universidad Nacional de Taiwán Animal Comité de Gestión y Uso.
tinción inmunohistoquímica
incluido en parafina los tejidos tumorales de los ratones fueron seccionadas y deparaffinized con xileno. Los portaobjetos se sumergieron en diferentes concentraciones de alcohol (100%, 95%, 75%, 50%, ddH
20) paso a paso para la rehidratación y luego en 3% H
20
2 para bloquear endógeno peroxidasa. Para la recuperación de antígenos, la inmersión de los portaobjetos en ebullición (95-100 ° C) de tampón de citrato (pH 6,0) durante 20 min se requiere. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se sumergen en la solución (3% de BSA) a temperatura ambiente de bloqueo para 30 min. Los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo primario diluido, survivin o AIF (Cell Signaling, Beverly, MA) a 4 ° C durante la noche. Después de enjuagar con PBS durante varias veces, el anticuerpo secundario, HRP polímero reactivo de conjugado (SuperPicTure Polymer kit de detección), se añadió durante 10 min y luego cromógeno DAB para 5 min. Cada etapa de incubación, los portaobjetos se seguido de lavado con PBS durante 5 min. Y luego, se utilizó solución de hematoxilina de Mayer durante counterstaining. Por último, los portaobjetos tenían que estar deshidratado, secado al aire y montado. Para la tinción de hematoxilina y eosina (H & amp; E mancha), en pocas palabras, las diapositivas de sección se colocaron en solución de hematoxilina durante 15 min, se lavó con ddH
2O y counterstained con eosina para 5 min. El color de los núcleos de las células era azul y del citoplasma era rosa. Este tipo de tinción puede distinguir los núcleos y el citoplasma de las células tumorales
El análisis estadístico
Todos los datos experimentales se expresaron como valores medios ± SEM y evaluados por Bonferroni
t
. - prueba. Los experimentos con animales se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. La significación estadística se determinó por
P
. & lt; 0,05
Resultados
α-tomatina la apoptosis inducida en HL60 y K562 líneas celulares de leucemia
α-tomatina se compone de tomatidina similar a los esteroides, galactosa, glucosa y xilosa (Fig. 1A). La citotoxicidad de α-tomatina se determinó primero con dos tipos diferentes de células leucémicas humanas, K562 (leucemia mieloide crónica humana) y HL60 (leucemia promielocítica aguda humana). ensayo de MTT revelado α-tomatina tenía fuertes efectos citotóxicos que podrían inhibir la supervivencia celular en HL60 y K562 de una manera dependiente de la concentración en IC
50 de 1,92 y 1,51 M, respectivamente (Fig. 1B). Estos resultados también se muestran en otras líneas celulares de leucemia (Fig. S1). Sin embargo, α-tomatina tenía efecto citotóxico más bien débil en la línea celular de linfoma y células normales (Fig. S1 y S2). Para confirmar el estado del proceso de la muerte celular inducida por α-tomatina, PI y Anexina V doble tinción se realizaron. Como se muestra en la Figura 1C, aproximadamente el 40% de las células HL60 tratadas con α-tomatina durante 12 h se tiñeron por Anexina V, lo que representó células apoptóticas etapa temprana, y 10% de las células se tiñeron por tanto PI y Anexina V, lo que indica apoptosis fase tardía o necrosis. Después del tratamiento durante 24 hr, 60% de las células estaban en la fase temprana de la apoptosis y 20% de las células estaban en la fase tardía. Estos hallazgos indican que α-tomatina podría inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis en el HL60 y las líneas celulares K562.
(A) La estructura química de α-tomatina. (B) Las células fueron tratadas con o sin α-tomatina durante 24 horas, y la viabilidad celular se midió utilizando el ensayo de actividad de reducción de MTT mitocondrial. Los datos se expresan como la media ± SEM de al menos tres determinaciones. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control. (C) La citometría de flujo análisis de las membranas plasmáticas con Anexina V-FITC /PI tinción doble. Las células se incubaron con DMSO durante 12 horas o en presencia de 5 mM α-tomatina de 12 y 24 hr. En los siguientes experimentos, 0,1% DMSO se usó como control. células en buen estado se tiñeron negativamente por Anexina V-FITC /PI (abajo cuadrante izquierdo). Después de la incubación con 5 M de α-tomatina durante 12 horas, había un número significativo de células apoptóticas que se tiñeron positivas con Anexina V-FITC y PI negativo con (parte inferior cuadrante derecho). Los datos se expresan a partir de al menos tres determinaciones separadas.
α-tomatina no afectó a la distribución del ciclo celular
El análisis de la distribución de fase del ciclo celular podría ayudar a evaluar el mecanismo de α-tomatina de acción; para observar la distribución del ciclo celular para ambas líneas celulares K562 y HL60, se utilizó α-tomatina en 10 M durante 12, 24, y 48 hr. No se observaron cambios obvios de fase del ciclo celular con respecto a la exposición dependiente del tiempo a alfa-tomatina (Fig. 2A y 2B). Estos hallazgos sugieren que la fase del ciclo celular de las líneas celulares HL60 y K562 no se alteró después del tratamiento α-tomatina. En otras líneas celulares de leucemia, α-tomatina también no tienen influencia en la distribución del ciclo celular (Fig. S3). De acuerdo con estudios previos, la acumulación del ciclo celular en el G
fase 2 /M se observó con paclitaxel [19]. Paclitaxel se utilizó como control positivo. La citometría de flujo mostró que la proporción de células en el G disminuyó
0 /G
1 fase y sub-G
1 población aumentó después del tratamiento de las células con paclitaxel a una dosis de 10 mM. Después del tratamiento durante 24 horas, en comparación con las células del grupo de control, el número de células en el sub-G
1 fase aumentó aproximadamente 15 veces (Fig. 2A). Estos hallazgos sugieren que α-tomatina no afectó a la distribución del ciclo celular de las células de leucemia humana estudiados.
(A) El carril superior muestra células HL60 que fueron tratados con α-tomatina (10 M) para la indicada hora; la distribución del ciclo celular se determinó mediante análisis de citometría de flujo FACScan. El carril inferior, las células HL60 tratadas con paclitaxel (10 M) durante el tiempo indicado, sirvió como control positivo. (B) las células K562 fueron tratados con α-tomatina (10 M) durante el tiempo indicado. Los datos se expresan a partir de al menos tres determinaciones separadas.
α-tomatina la muerte celular inducida independiente de la activación de caspasa
La activación de caspasa juega un papel importante tanto en las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos. Entre todas las caspasas, se cree que la activación de las caspasas 3, 6, y 7-a ser el más importante en la vía de apoptosis. Por lo tanto, para confirmar el papel de la caspasa-3 y la HL60 células K562 fueron tratados con α-tomatina a diferentes concentraciones. Los resultados mostraron que la caspasa-3 no está activado por α-tomatina (Fig. 3A y 3C). Sin embargo, paclitaxel (3 M), utilizado como control positivo, activa la caspasa-3. Además de la caspasa-3, caspasa-6, -7, -8, -9 y eran aparentemente sin cambios después del tratamiento α-tomatina, incluso después de la exposición a una alta concentración de α-tomatina (5 M) durante 24 horas (Fig. 3A y 3C). Con el fin de confirmar que la totalidad de la activación de la caspasa participó en vías de la muerte celular inducida por α-tomatina, un inhibidor de la caspasa pan, z-VAD-fmk, se utilizó para los experimentos de confirmación. MTT ensayo mostró que el tratamiento conjunto de HL60 y células K562 con z-VAD-FMK y α-tomatina no revirtió la muerte celular inducida por tomatina-α (Fig. 3B y 3D). Además, estos resultados similares también se muestran en otras líneas celulares de leucemia (Fig. S4). Estos resultados sugieren que la apoptosis celular inducida por α-tomatina es independiente de la activación de la caspasa en las líneas celulares de leucemia.
(A) células HL60 se trataron con α-tomatina (5 mM) o paclitaxel (3 M) para 24 se detectaron hr y la caspasa-3, -6, -7, -8, -9 y activaciones. Las proteínas se separaron y se evaluaron usando análisis de transferencia Western. Paclitaxel (3 M) se utilizó como control positivo. (B) Las células HL60 se pretrataron con 100 M z-VAD-fmk para 30 min y luego tratados con α-tomatina (5 M) durante 24 horas. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de MTT. (C) las células K562 fueron tratados con α-tomatina (5 M) y la caspasa-3, -6, -7, -8, y se detectaron -9 activaciones. (D) células K562 fueron pretratados con 100 M z-VAD-fmk para 30 min y luego tratados con α-tomatina (5 M) durante 24 horas.
α-tomatina afectó el potencial de membrana mitocondrial y proteínas relacionadas
Debido a que las mitocondrias desempeñan un papel importante en ambas vías de la apoptosis intrínsecos y extrínsecos, se midió el potencial de membrana mitocondrial. Las células HL60 y K562 fueron expuestos a a-tomatina a una concentración de 5 mM durante los tiempos indicados (1, 2, 4, 8, y 12 hr) y se trataron con rodamina 123 por 30 min; y, a continuación, las células se analizaron por citometría de flujo. Las figuras 4A y 4B muestran un fenómeno de desplazamiento banda observada después de incubación durante 1 hr y 2 en el HL60 y las líneas celulares K562, respectivamente; estos fenómenos cambiaron significativamente a las 4 horas. Lo anterior indica que α-tomatina afectado el potencial de membrana mitocondrial. No sólo en las células HL60 y K562, α-tomatina también causó la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en otras células leucémicas (Fig. S5).
El potencial de membrana mitocondrial se cuantificó por análisis de citometría de flujo con rodamina 123. El ( a) y B) HL60 líneas celulares K562 (se trataron con 10 mM de rodamina 123 y se incubaron a 37 ° C durante 30 min en presencia de 5 mM α-tomatina. El eje horizontal muestra la intensidad de fluorescencia relativa y el eje vertical indica el número de células. La curva verde indica que el control. La curva azul indica las células α-tomatina tratados. Un desplazamiento de la curva verde a la curva azul indica una pérdida de potencial de membrana mitocondrial. Los datos se expresan a partir de al menos tres determinaciones separadas.
En estudios anteriores, la familia Bcl-2 ha demostrado desempeñar un papel crucial en la mitocondria, incluyendo potencial de membrana mitocondrial mediación [20]. Por lo tanto, se investigó si α-tomatina indujo cambios en el potencial de membrana mitocondrial, debido a los efectos de la expresión de la proteína de la familia Bcl-2. En las células HL60 y K562, la proteína MCL-1 forma larga (MCL-1 L), que media la inhibición de la apoptosis de las células, no estaba regulado por α-tomatina; sin embargo, la expresión del MCL-1 forma corta (MCL-1), que induce la apoptosis de las células, aumentó después del tratamiento (Fig. 5A y 5B). Sin embargo, como se muestra en las figuras 5A y 5B, no hubo cambios en los niveles de Bcl-2 y la proteína de la subasta en el HL60 y células K562. Estos hallazgos sugieren Bak y MCL-1 desempeñaron un papel importante en la apoptosis inducida por α-tomatina en las células de leucemia humana
.
(A) α-tomatina inducidos Mcl-1 y hasta Bak-normativa (pro-apoptótica), pero no afectó los niveles de proteína Bcl-2 Oferta y en las células HL60. (B) En el K562 células, α-tomatina mejora de forma significativa la activación de Bak y hasta regulado Mcl-1; Sin embargo α-tomatina no influyó en las expresiones de proteínas Bcl-2 y la oferta. Ambas líneas celulares se trataron con 5 mM α-tomatina para los intervalos indicados. Los datos se expresan a partir de al menos tres determinaciones separadas.
α-tomatina inducida por la translocación nuclear FIA y la expresión de survivina inhibido
Resultados anteriores y los datos aquí presentados han revelado que la α-tomatina inducida la muerte celular independiente de la activación de caspasa [21] y el potencial de membrana mitocondrial afectada. Por otra parte, se ha informado de que la permeabilidad de la membrana mitocondrial también está regulada por AIF. Por lo tanto la muerte celular, inducida por AIF, que no pasa por la activación de caspasas, puede estar implicada en la vía de la apoptosis celular inducida por α-tomatina. Figura 6A y 6B α-tomatina inducida por la translocación nuclear de la FIA en ambas líneas celulares de una manera dependiente del tiempo.
(A) HL60 y (B) K562 células fueron tratadas con y sin α-tomatina ( 5 M) durante 12 h, 18 h, 24 hy 30 h. Las células fueron entonces fraccionaron en componentes nucleares, y las expresiones de proteínas de FIA y nucleolina (control de carga nuclear) se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. (C) HL60 y células K562 (D) fueron tratados con α-tomatina a las concentraciones y el tiempo indicados. La survivina y los niveles de proteína actina se detectaron por análisis de transferencia Western. Los datos se expresan a partir de al menos tres determinaciones separadas.
Según Carter
et al.
, Muchos tipos de líneas celulares de leucemia están asociados con la inhibición de la survivina que promueve la muerte celular independiente de célula la progresión del ciclo [22]. Además, la survivina se ha demostrado que suprimir AIF translocación al citoplasma de la mitocondria que pueden inducir la ruta apoptótica independiente de caspasas [12]. Hemos investigado si α-tomatina podría directamente regular a la baja el nivel de proteína survivina que conduce a la muerte celular. De hecho, la expresión de survivina se había reducido regulado en ambas líneas celulares y otras líneas celulares de leucemia de una manera concentración-y dependiente del tiempo (Fig. 6C y 6D y S6). Estos resultados indican que la inhibición de la translocación y la survivina FIA estuvieron implicados en la muerte celular independiente de caspasa-α mediada por tomatina.
La actividad antitumoral y la expresión de survivina FIA y con α-tomatina
in vivo
Para determinar la eficacia antitumoral de la α-tomatina en
>, los ratones SCID se inyectaron por vía subcutánea con células HL60 en su flanco derecho. Cuando el volumen del tumor alcanzó 100 mm
3, los ratones se dividieron en dos grupos: un control (vehículo) y los grupos de tratamiento α-tomatina (5 mg /kg, i.p., en días alternos). El experimento se interrumpió cuando el volumen medio de los tumores alcanzó 2.500 mm
3. La Figura 7A muestra que α-tomatina inhibió el crecimiento del tumor y se asoció con la falta de pérdida de peso en los ratones tratados. Se resecaron los tumores; una parte de los tumores resecados se fijó en formalina y embebidos en parafina para el análisis inmunohistoquímico, y la otra parte se molió y se sumergió después en un tampón de lisis. La tinción inmunohistoquímica se realizó para estimar las expresiones de la FIA y survivina,
ex vivo. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción se utilizó para observar la aparición de las células, con las partes azules y rojos que representan el núcleo celular y el citoplasma, respectivamente. Los núcleos se redujeron en las células tumorales de los ratones tratados con α-tomatina (Fig. 7B). Los resultados de la tinción inmunohistoquímica utilizados para evaluar los niveles de expresión de survivina FIA y mostraron que, en comparación con los ratones tratados con vehículo, los ratones tratados con α-tomatina mostró un incremento en la expresión FIA y la reducción de los niveles de survivina (Fig. 7B). Además, se utilizó el análisis de transferencia de Western para medir una parte del tejido tumoral terreno para las expresiones de AIF y survivina. La Figura 7C muestra que, de acuerdo con los efectos observados de α-tomatina
ex vivo
, el nivel de proteína AIF se incrementó y la survivina se redujo en los ratones α-tomatina tratados. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que la α-tomatina, tanto
in vitro
y
in vivo
, el crecimiento de células de leucemia inhibida por la inhibición de la survivina y la inducción FIA lo que sugiere que α-tomatina puede ser un candidato para tratamiento de la leucemia eficaz.
células HL-60 se implantaron ectópica en ratones SCID y cuando el tamaño de tumor llegó a 100 mm
3, los ratones fueron inyectados con /dosis de α 5 mg kg (q2d, ip) -tomatine. Se estudiaron (A) Efectos de la α-tomatina en el volumen del tumor y los pesos corporales de los ratones. Las curvas de crecimiento son las medias de los tamaños de los tumores medidos para cada grupo (n = 5). (B) Los tumores se extirparon a continuación y se procesaron para la tinción inmunohistoquímica. Los carriles superiores (a.c.e.g y i) son el control, y los carriles hacia abajo (b.d.f.h y j) son el grupo tratado, con α-tomatina (5 mg /kg). a, b: hematoxilina y eosina; c, d, e y f tinción para la FIA (marrón); g, h, i y j tinción de survivina (marrón). c, d, g y h son inferiores a 200 × ampliación; a, b, e, f y j son menos de 1000 × magnificación. (C) Análisis de transferencia Western se realizó para la FIA y survivina expresiones junto con la actina como control de carga del tumor seleccionados al azar en cada uno de los kg de control y alfa-tomatina grupos de tratamiento de 5 mg /.
Discusión
α-tomatina es una saponina principales que se encuentran en el tomate, y estudios recientes han demostrado que tiene actividad antitumoral en las células de tumores sólidos [1], [5], [6]. Sin embargo, el mecanismo molecular de la actividad α-tomatina no se ha determinado en las células leucémicas. En el presente estudio, se encontró α-tomatina para inhibir la supervivencia de las células leucémicas de una manera dependiente de la concentración (Fig. 1B y S1). La inhibición de la supervivencia de las células podría ser atribuido a la inhibición del crecimiento celular o la citotoxicidad celular. Por lo tanto, la distribución del ciclo celular se investigó adicionalmente después del tratamiento con α-tomatina. Los resultados mostraron que α-tomatina no afectó a la progresión del ciclo celular en las líneas celulares de leucemia evaluadas (Fig. 2 y S3). Sin embargo, yoduro de propidio (PI) y V tinción con anexina revelaron que α-tomatina promovido leucémica-apoptosis de las células de principios de las fases tardías (Fig. 1C). Además, el tratamiento α-tomatina resultó en cambios en la expresión de la familia de proteínas BCL-2 (Fig. 5). perturbación mitocondrial significativa se observó (Fig. 4 y S5), y posteriormente activa AIF translocación al núcleo y se inhibe la expresión de survivina que conduce a la apoptosis de células leucémicas (Fig. 6 y S6).
Los resultados de este estudio no mostraron cambios relacionados con la α-tomatina-en la distribución del ciclo celular, incluso a una alta concentración de α-tomatina (10 M). Sin embargo, los resultados de PI-anexina V doble tinción sugirieron que la apoptosis observada fue causado por α-tomatina.