Extracto
Las funciones mitocondriales Lon proteasa humanos dependientes de ATP en la regulación del metabolismo y controlar la calidad de las proteínas y el ADN mitocondrial (ADNmt ). Sin embargo, el papel de Lon en el cáncer no se entiende bien. Por lo tanto, este estudio se realizó para investigar la importancia de Lon en células de cáncer cervical de pacientes y en líneas celulares establecidas. el análisis de microarrays de cáncer y 30 de 10 tejidos normales del cuello uterino se analizaron por inmunohistoquímica para los niveles de proteína Lon. La expresión de Lon También se examinó por inmunotransferencia 16 tejidos de cáncer de cuello uterino frescas y sus respectivos tejidos del cuello uterino no tumorales. En todos los casos, la expresión de Lon fue significativamente elevado en los carcinomas de cuello uterino en comparación con los tejidos normales. Lon expresión aumentada en microarrays de tejidos no varió entre los grados de edad, tumor-nódulo-metástasis, o metástasis en los ganglios linfáticos. El derribo de Lon en células de cáncer cervical HeLa por transducción lentivrial dado como resultado una disminución sustancial tanto en los niveles de proteína y mRNA. Dicha baja regulación de la expresión de Lon bloqueó significativamente la proliferación de células HeLa. Además, derribando Lon dio lugar a la disminución de la bioenergética celular tal como se determina mediante la medición de la respiración aeróbica y la glucólisis utilizando el Seahorse XF24 analizador de flujo extracelular. En conjunto, estos datos demuestran que Lon juega un papel potencial en la oncogénesis de cáncer de cuello de útero, y puede ser un biomarcador útil y de destino en el tratamiento del cáncer cervical. Lon; inmunohistoquímica; cáncer de cuello uterino; proliferación celular; bioenergética celular.
Visto: Nie X, Li M, Lu B, Zhang Y, Lan L, Chen L, et al. (2013) abajo de la regulación sobreexpresa Lon Humano en cáncer cervical suprime la proliferación celular y Bioenergética. PLoS ONE 8 (11): e81084. doi: 10.1371 /journal.pone.0081084
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: 15 Julio, 2013; Aceptado: 8 Octubre 2013; Publicado: 19 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Nie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (número de concesión 31.070.710), el programa Nacional de Investigación básica de China (número de concesión 2013CB531702), el provincial de la disciplina tecla superior de Zhejiang de la medicina de laboratorio, la segunda oleada del programa provincial de Zhejiang para el cultivo de alta -Nivel talentos innovadores para la salud, y el equipo de la innovación científica y tecnológica clave del diagnóstico clínico de laboratorio de la provincia de Zhejiang (604091155). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el tercer cáncer más común en las mujeres en todo el mundo, con más de 500.000 nuevos casos diagnosticados cada año. infección por el virus del papiloma humano (VPH) es el factor de riesgo más frecuente en el desarrollo de casi todos los casos de cáncer de cuello uterino [1,2]. En las primeras etapas, el cáncer de cuello de útero es potencialmente curable a través de una combinación de cirugía, radioterapia o quimioterapia. La tasa de supervivencia a 5 años es superior al 90%. El uso rutinario de pruebas de frotis de Papanicolaou y VPH ha mejorado significativamente los resultados del cáncer cervical en los países desarrollados [3]. Por desgracia, los pacientes en los países de bajos ingresos a menudo son diagnosticados en una etapa avanzada, debido a la falta de una adecuada detección, diagnóstico precoz y tratamientos curativos [4]. A pesar de que la mayoría de los esfuerzos de investigación moleculares se han basado en la relación entre los tipos de VPH de alto riesgo y el cáncer de cuello uterino, la identificación de nuevos marcadores moleculares y los mecanismos que contribuyen a la mejora de la gestión y de diagnóstico de esta enfermedad quimioterapéutico será significativa.
Lon es una proteasa dependiente de ATP conservado evolutivamente presente en las bacterias y las mitocondrias de mamíferos y peroxisomas [5-8]. En la matriz mitocondrial, Lon no sólo funciona en el control de calidad de las proteínas mediante la eliminación de las proteínas anormales, sino también en la regulación de proteínas que degradan selectivamente por la limitación de velocidad proteínas clave [9-13]. Lon está regulada positivamente en diversas condiciones de estrés tales como la acumulación de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico, la hipoxia y otras condiciones de estrés [10,14,15]. Los experimentos en células cultivadas y en modelos animales muestran que el aumento de expresión de Lon es provocada por hipoxia o estrés ER, y potencialmente pueden afectar la facturación proteolítica y /o montaje complejos de la cadena respiratoria tales como el citocromo c oxidasa [14]. En la ataxia de Friedreich, una enfermedad neurodegenerativa hereditaria rara, una disminución progresiva de proteínas mitocondriales Fe-S se acompaña de un aumento asociado en los niveles de proteína Lon y proteólisis mediada por Lon [15]. Además, Lon es una proteína de unión a ADN mitocondrial, que se asocia preferentemente con la región de control del genoma en el que se inicia la replicación y la transcripción [16]. Lon está presente como un componente de proteína de nucleoides mitocondriales, y se ha implicado en el mantenimiento y la expresión de ADN mitocondrial (ADNmt) [13,16,17].
Sobre la base de la idea de que Lon está regulada positivamente en condiciones de estrés para aliviar el estrés metabólico y proteotoxic en las células cancerosas, se analizó la expresión Lon en tejidos de carcinoma cervical humano y los tejidos normales del cuello uterino mediante inmunohistoquímica e inmunotransferencia y encontramos una correlación positiva entre sobreexpresión lon y el cáncer de cuello uterino. Para abordar el mecanismo y funciones biológicas de Lon en la tumorigénesis del cáncer de cuello uterino, que redujeron regulado los niveles de proteína Lon utilizando un ARN corto horquilla (shRNA) transducido en células HeLa, que son una línea celular de carcinoma de cuello uterino comúnmente empleado. Hemos demostrado que la anulación de Lon en células de cáncer cervical HeLa reducción de la proliferación celular, la respiración mitocondrial y la glucólisis aeróbica. Nuestros hallazgos sugieren que Lon apoya la tumorigénesis del cáncer de cuello de útero y puede ser un nuevo biomarcador y diana terapéutica en el cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos de análisis
2.1 microarray de tejido de cáncer cervical para Lon por inmunohistoquímica
uterinos microarrays de tejidos de cáncer de cuello uterino se adquirieron de Biomax (número de catálogo CR602). Este microarray contenía tejidos normales de cuello uterino (n = 10) y tejidos de cáncer en diferentes etapas (n = 30). La inmunohistoquímica se realizó usando el siguiente protocolo. Brevemente, los microarrays de tejidos se incubaron a 60 ° C en una cámara durante 2 horas, desparafinaron con xileno, y rehidratada a través de una serie de etanol con diferentes concentraciones. Los portaobjetos se hierven en una solución tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) durante 15 minutos para la recuperación de antígeno, y después se inactivó mediante la inmersión en peróxido de hidrógeno al 3% en agua destilada durante 20 minutos. Después de bloquear la unión no específica con 3% de albúmina de suero de oveja durante 20 minutos, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo de conejo anti-Lon anticuerpo (Beijing Biosíntesis Biotechnology, China) (1: 100 dilución en 1% de BSA en PBS) durante la noche a 4 ° C . Los portaobjetos se aclararon entonces tres veces en PBS y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo anti-conejo de oveja biotinilado a una dilución de 1: 100 en 1% de BSA en PBS. A continuación, el anticuerpo secundario se aspiró y los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS seguido de incubación con avidina de rábano picante conjugada con peroxidasa. Las diapositivas fueron tratados posteriormente con 3'3 -Diaminobencidina tetra-clorhidrato (DAB), de contraste con hematoxilina y, finalmente, se montaron con balata neutros. También se realizaron controles negativos sin la incubación del anticuerpo primario. Se observaron
Las secciones de tejido bajo un microscopio Olympus (Olympus Corporation, Japón) y se tomaron imágenes a 200 × magnificación con la misma intensidad y tiempo de exposición de luz. Todas las imágenes se convierten después en 8 bits de escala de grises. La intensidad de la tinción de los tejidos del cuello uterino Lon fue comparada semi-cuantitativamente mediante el análisis del valor de densidad óptica integrada (IOD) de cada imagen, que se midió por el Plus software de análisis de imágenes Image-Pro (Media Cybernetics, EE.UU.).
2.2 Recogida de muestras de tejido cervical
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente. muestras cervicales humanos fueron recogidos en el Departamento de Obstetricia y Ginecología durante la cirugía en pacientes con cáncer de cuello uterino, que fueron sometidos a resección quirúrgica completa de la enfermedad en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou (Wenzhou, China) entre agosto de 2012 y marzo de 2013. Los pacientes fueron seleccionados sobre la base de un diagnóstico patológico de cáncer de cuello uterino. No hubo evidencia de ningún otros tumores malignos y sin antecedentes de tratamiento contra el cáncer preoperatoria. Después de cada extracción quirúrgica, la muestra de tejido fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior análisis.
2.3 Cell Cultura y
La línea de células HeLa se adquirió de América Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células fueron cultivadas en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Sigma) y antibióticos (100 U /ml de penicilina y estreptomicina) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
2.4 Lon desmontables por lentiviral shRNA trasduction
Las células HeLa fueron sembradas 16 horas antes de la transfección en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo. Las células se infectaron con partículas LONP1-lentiviral shRNA (MOI 5) (Santa Cruz, sc-97290-V) o el control shRNA (Santa Cruz, SC-108080) en medio de cultivo que contiene polibreno a una concentración final de 5 mg /ml. El medio se aspiró y se reemplazó posteriormente con medio fresco después de una incubación durante la noche. Setenta y dos horas más tarde, las células fueron luego sembradas en placas de 60 mm con medio que contiene puromicina a la concentración final de 3 mg /ml. medio fresco con puromicina fue sustituido a diario para la selección de células transducidas. Varios clones de una sola célula se transfirieron selectivamente utilizando discos de clonación estériles a los pocillos de una placa de 24 pocillos y expandida. Los clones LONP1-shRNA que muestran la caída más eficiente en comparación con el control de clones shRNA fueron identificados por análisis de inmunotransferencia y se utilizan para el análisis adicional
2,5 cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR)
ARN total se extrajo usando un kit RNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó usando un lector de NanoDrop y 2 g de ARN se transcribe de forma inversa en ADNc usando el ADNc de alta capacidad kit de transcripción (Applied Biosystems) con cebadores aleatorios inversa. El cDNA se diluyó y 200 ng de cDNA se utilizó como plantilla por reacción. La PCR en tiempo real (RT-PCR) se realizaron análisis con ensayos de expresión TaqMan de genes (Hs00998404_m1 LONP1, Hs02800695_m1 HPRT1, Applied Biosystems) utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y recocido y extensión a 60 ° C durante 1 min. La relativa
LONP1
los niveles de expresión de ARNm se normalizaron en contra de la limpieza de genes hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) usando el método comparativo ΔΔCt. ΔΔCT se calculó con la ecuación [Ct1 (LONP1) -Ct1 (HPRT1)] - [Ct2 (LONP1) -Ct2 (HPRT1)], TC1 y TC2 son los valores de Ct en el grupo LONP1-shRNA y el grupo control shRNA respectivamente, y factor de cambio relativa de genes se calculó mediante la ecuación 2
-ΔΔCt.
2,6 detección por inmunotransferencia de la proteína Lon
congeladas muestras de tejido y las células se lisaron en presencia de un cóctel inhibidor de la proteasa y se centrifugaron a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C. Se recogió la fracción sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA). Cantidades iguales de extracto de proteína (20 mg por pocillo) se separaron por electroforesis en gel de poli acrilamida SDS (SDS-PAGE). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de 0,2 micras de nitrocelulosa y se bloquearon en leche desnatada al 3% en PBS. La transferencia se incubó con el conejo Lon anti-humana (1: 300) a 4 ° C durante la noche seguido de rábano picante de cabra anti-conejo anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1: 5.000, Santa Cruz). Anticuerpo contra β-actina se utilizó como control de carga para el experimento. A continuación, la membrana se incubó con sustrato quimioluminiscente (Denville) durante 5 minutos y se expuso a película de rayos X y se desarrolló en una habitación oscura. Las señales fueron detectados y cuantificados por densitometría usando el software Image-J (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
2,7 proliferación de las células de ensayo
desmontables células de control y Lon se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células por pocillo y se incubaron durante la noche. Después de tripsinización, las células se resuspendieron en un volumen igual de medio de cultivo y de azul de tripano (solución 0,05%). El número de células vivas en pocillos por triplicado que excluía azul de tripano se contó para 6-días para obtener la curva de crecimiento celular.
2,8 Seahorse XF-24 análisis de flujo metabólico
tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se midieron utilizando un caballito de mar XF24 extracelular flujo analizador (Seahorse Bioscience). Veinticuatro horas antes del experimento, las células LONP1-shRNA HeLa estables (grupo Long), y células de control shRNA HeLa (grupo CTR) se cultivaron en caballito de mar XF-24 placas a una densidad de 5 × 10
4 células por pocillo. En el día del análisis de flujo metabólico, el medio de cultivo se reemplazó con 675 l de DMEM sin búfer (DMEM suplementado con glucosa 25 mM, piruvato de sodio 1 mM, NaCl mM 31, Glutamax 2 mM, rojo fenol, pH 7,4) y se incubó a 37 ° C en un no-CO
2 incubadora durante 1 hora. Todos los reactivos de inyección se ajustaron a pH 7,4. las tasas de línea de base se midieron a 37 ° C cuatro veces antes de inyectar secuencialmente los siguientes inhibidores-oligomicina mitocondrial (10 mM), carbonycyanide p- fenilhidrazona (trifluorometoxi) (FCCP, 1,50 M), y la rotenona (10 M). Después de la adición de cada inhibidor, también se tomaron cuatro lecturas. OCR y el CERA se calculan automáticamente por el software Seahorse XF-24. Cada punto representa una media de 7 pozos diferentes.
2.9 estadístico El análisis
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS.11. Una forma de análisis de ANOVA se realizó para los resultados inmunohistoquímicos y para la comparación de los grupos Lon y CTR en los
in vitro
experimentos. Las barras de error para los experimentos representan la desviación estándar del valor medio (valor medio ± S.D.) a partir de tres experimentos separados a menos que se indique lo contrario.
Los valores P Red de ≤ 0,05 se consideró como estadísticamente significativo.
Resultados
3.1 LONP1 está sobre expresado en tejidos de cáncer de cuello uterino
Hemos determinado los niveles de proteína en Lon 30 de carcinoma de cuello uterino y 10 muestras cervicales no neoplásicas por inmunohistoquímica de alto rendimiento análisis. secciones representativas de la expresión Lon en todos los tejidos se muestran en la Figura 1. Sin embargo, Lon se expresó en niveles sustancialmente más altos en las muestras de cáncer por contraste con la expresión débil pero detectable en los tejidos normales con una significación estadística (
P
& lt; 0,01) (Tabla 1). Se observó la expresión aumentada de Lon a través de diversos grados de cáncer de cuello uterino sin diferencias aparentes en los tejidos bien, moderadamente y pobremente diferenciados (Figura 1 B-D). Del mismo modo, en tejidos frescos de cáncer cervical, Lon se encontró que era más altamente expresado que en correspondientes tejidos no tumorales, como se muestra por inmunotransferencia (Figura 2 A y B). También se examinó si Lon sobreexpresión se asocia con factores de riesgo como la edad y con las características clínico-patológicas, incluyendo el tamaño del tumor, el estadio tumoral, invasión local y metástasis en los ganglios linfáticos. Lon expresión no se correlacionó significativamente con la edad, el grado del tumor, TNM (tumor-nódulo-metástasis) grados, o metástasis de los ganglios linfáticos que se resumen en la Tabla 2. En conjunto, Lon está regulada positivamente en el carcinoma de cuello uterino.
(A) los tejidos del cuello del útero humano normal. (B) de cuello uterino de grado del cáncer 1. (C) cervical grado de cáncer 2. (D) Cáncer de cuello uterino de grado 3. Barra de Escala: 50 micras.
Categoría
Casos
Lon tinción IOD (× 10
4)
a
P
-valor
*
normal cervix104.47 ± 2.070.004Cervical cancer307.19 ± 2.52Table 1. Lon expresión en tejidos cervicales normales y tejidos de cáncer de cuello uterino.
a la tinción Lon densidad óptica integrada (IOD) se midió por el Image Pro además de software de análisis. Los datos se analizaron semi-cuantitativamente y se expresaron como el valor medio ± S.D. *
P
≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. CSV Descargar CSV
(A) de inmunotransferencia Representante de expresión de la proteína Lon detectado en el cáncer de varios humano cervical (incluso las líneas) y la correspondiente no tumoral (líneas impares) tejidos del cuello uterino por análisis de transferencia Western. (B) El cáncer cervical expresa significativamente mayor nivel de Lon por comparación con el tejido cervical no tumoral,
P
& lt; 0.05. Los datos representan el valor medio ± S. D. de 16 grupos de tejidos del cuello uterino (Normal & Amp; Cáncer).
Categoría Subcategoría
Casos
Lon tinción IOD (× 104)
a
Total
P-valor
*
Edad (años) & lt; 50196,72 ± 2.47300.186≥50118.00 ± 2.52Tumor GradeGrade 1107,00 ± 2107,93 ± 3.16300.522Grade 2.55Grade 3106,65 ± 1.74Invasion de tumorT1176 0,81 ± ± 2.82300.347T2137.70 2.06Lymph nodo metastasisN0287.18 ± ± 2.59300.900N127.41 1.80Table 2. Relación entre la expresión de Lon y las características clínico-patológicas de los cánceres de cuello uterino.
una densidad óptica integrada La tinción Lon (IOD) se midió por el software Image Pro Plus análisis. Los datos se analizaron semi-cuantitativamente y se expresaron como el valor medio ± S.D. *
P
≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Descargar CSV CSV
3.2 regulación a la baja de Lon en células de cáncer cervical HeLa
Para determinar la importancia de Lon en la supervivencia de las células de cáncer cervical, tomamos ventaja de la técnica shRNA. Para evaluar la especificidad de shRNA a la
LONP1
gen y el grado de Lon baja regulación aplicada a las células HeLa, se llevaron a cabo RT-PCR y análisis de inmunotransferencia. RT-PCR confirmó que el LONP1 shRNA específicamente redujo el
LONP1
nivel de ARNm en un 60% a los 10 días después de la transfección (
P Hotel & lt; 0,001; Figura 3 A). El análisis por inmunotransferencia mostró una disminución sustancial en los niveles de proteína ~ 100 kDa Lon en comparación con el grupo control (CTR
, P
& lt; 0,001; Figura 3 B y C). El clon celular más eficiente downregulated de LONP1-shRNA fue seleccionado para una mayor investigación.
(A) Análisis Representante de RT-PCR de
LONP1
nivel de ARNm en células HeLa transfectadas con shRNA control o LONP1. (B) inmunotransferencia representativo que muestra los niveles de proteína Lon extractos de células HeLa transfectadas con el control o LONP1 shRNA. (C) La densitometría se utilizó para cuantificar los niveles de proteína Lon relativa normalizada de beta-actina se muestra en (B); ***
P Hotel & lt; 0.001. (D) El crecimiento celular de control y LONP1 shRNA transduced células HeLa,
P Hotel & lt; 0.05. Los datos representan el valor medio ± S. D. a partir de tres experimentos separados.
3.3 El descenso de regulación de Lon disminución de la proliferación y la formación de colonias de células de cáncer de cuello uterino
crecimiento de las células HeLa Enhanced es una de las características más importantes del desarrollo del tumor. A continuación estudiamos el impacto de derribar Lon sobre la proliferación de células HeLa
in vitro
. El ensayo de proliferación celular demostró que la tasa de crecimiento de las células en el grupo de Lon shRNA fue significativamente menor que en el grupo CTR (
P
& lt; 0,05; Figura 3 D). El análisis microscópico mostró que se observó el tamaño de la colonia celular a ser relativamente menor en el grupo Lon en comparación con el grupo de control (datos no mostrados).
3,4 Down-regulación de la expresión de Lon disminuye el metabolismo energético de HeLa células de cáncer cervical
Se procedió a determinar el efecto de Lon caída en la energética celular mediante la medición de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), que son indicadores de la respiración mitocondrial y la producción de ácido láctico a través de la glucólisis aeróbica en células, respectivamente. Basal OCR (línea de base menos oligomicina), que es una medida de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), se encontró que era considerablemente menor en el grupo Lon en comparación con la del grupo control (
P
& lt; 0,001; figura 4 B), lo que refleja una menor dependencia de la fosforilación oxidativa para la producción de energía en las células Lon-shRNA. Un bloque sustancial en la glicólisis también se observó en el grupo de Lon como se muestra por una disminución significativa en ECAR relación con el grupo CTR (Figura 4 D, la línea de base). La adición de oligomicina, que inhibe la F
0 ATP sintasa y complejo flujo de electrones, se redujo drásticamente el OCR en ambos grupos en un grado similar (Figura 4 A, oligomicina). Se encontró un aumento de la ECAR en respuesta a oligomicina que se correlaciona con la disminución de OCR (
P
& lt; 0,05; Figura 4 D, oligomicina), lo que indica aumento de la producción de lactato a través de la glucólisis. inyección FCCP desacoplado la respiración mitocondrial de la síntesis de ATP y dramáticamente aumentó el OCR en ambas líneas celulares, dando una estimación de la capacidad respiratoria de reserva de la mitocondria (Figura 4 A, FCCP). Por último, la adición del complejo I inhibidor de rotenona resultó en una disminución drástica de manera similar OCR en ambas líneas celulares, y el residual OCR se consideró el consumo de oxígeno celular no mitocondrial (Figura 4 A, rotenona). Lon shRNA desmontables dio lugar a una marcada reducción de la capacidad respiratoria mitocondrial total, en comparación con las células de control (
P
& lt; 0,001; Figura 4 C). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la regulación por disminución de la expresión de Lon en células HeLa inhibe el metabolismo de la energía celular.
(A-C) Seahorse Bioscience XF24 extracelular flujo analizador se utilizó para medir OCR (pmoles /min), indicativo de la fosforilación oxidativa en las células HeLa transfectadas con el control o LONP1 shRNA. se añadieron secuencialmente (A) Después de establecer una línea de base, oligomicina (10 mM), FCCP (1,50 M), y la rotenona (10 M). (B) El OCR basal se calculó usando la diferencia entre la media de puntos de tiempo en la línea de base (números 1 a 4) y en el tratamiento oligomicina (números 5 a 8) (línea de base menos oligomicina OCR). (C) La máxima mitocondrial área de la capacidad respiratoria bajo la curva (AUC) de los dos grupos se calculó utilizando la diferencia entre las AUC ROC (pmoles) sumas de puntos de tiempo en el tratamiento FCCP (números 9 a 12) y en el tratamiento de la rotenona (números 13 a 16) (FCCP menos rotenona AUC OCR). (D) de perfiles de ECAR (mph /min) en el control y desmontables células Lon se midió en los mismos experimentos que se describen en (A). ***
P Hotel & lt; 0.001. Los datos representan el valor medio ± S. D. a partir de tres experimentos separados.
Discusión
infección por VPH es la causa principal de cáncer de cuello uterino. El biomarcador más ampliamente utilizado en el tratamiento de precáncer de cuello uterino es la detección de ADN de VPH [18]. Alto riesgo de tipo de VPH específicos oncoproteínas E6 y E7 se pensaba que eran los factores más importantes en la transformación celular y la carcinogénesis [19,20]. Otros biomarcadores funcionales investigados en el cáncer cervical incluyen marcadores de citoqueratina diferenciación escamosa (CK), marcadores del ciclo celular, tales como p21, p27, MCM5, ciclina A, ciclina E y la ciclina D, y otras moléculas tales como telomerasa, involucrina, y survivina. Samarzija encontrado recientemente que Hedgehog (Hh) vía de señalización se activa en células de cáncer de cuello uterino derivado mediante el uso de ligando de Shh y inhibidores de la vía Hh, indicando la inhibición de esta vía puede ser una opción terapéutica para combatir el cáncer cervical [21].
Estudios anteriores han demostrado que los cambios en la expresión de proteínas Lon mitocondrial se asocian con una variedad de enfermedades humanas, incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica familiar [22], cáncer [23-25], así como el envejecimiento [26], y la ataxia de Friedreich [15]. Estos resultados implican un papel crucial para la proteasa Lon mitocondrial en las funciones celulares fisiológicas. Sin embargo, las preguntas sobre el patrón de expresión y el papel de Lon en la supervivencia de las células cancerosas todavía no se conocen bien. En este estudio hemos dilucidar el papel significativo de Lon en el cáncer cervical humano. Es sorprendente encontrar que la proteína Lon está regulada positivamente en todas las etapas del cáncer de cuello uterino y de microarrays de muestras de los pacientes, en comparación con el control queridos.
Lon es una proteína de estrés similar a calentar factores de choque que están regulados al alza en condiciones de estrés [27]. En general, las células cancerosas están bajo metabólica y el estrés proteotoxic donde hay una necesidad de mecanismo de compensación para aliviar estas tensiones para retener la tumorigenicidad y la viabilidad celular. Las mitocondrias juegan un papel importante durante la proliferación del cáncer mediante el suministro de energía, y evadir la apoptosis. Lon es una de las principales proteasas mitocondriales que reconocen y se degradan desplegada, mal plegada y las proteínas anormales en la mitocondria. La sobreexpresión de Lon mitocondrial que aquí se presenta se verifica firmemente que es uno de los jugadores clave en la carcinogénesis cervical. Como consecuencia de la limitada disponibilidad de tejidos de cáncer de cuello uterino frescos utilizados en este estudio, que no tenía capacidad para determinar la correlación de los niveles de proteína de Lon con la estadificación del cáncer de cuello uterino. El trabajo futuro sobre la base de muestras ampliadas determinará si los niveles de transcripción Lon, así como de proteínas se asocian con las características clínico-patológicas en el cáncer de cuello uterino.
mitocondrial Lon proteasa se distingue por sus múltiples funciones como una proteína de unión a ADN mitocondrial, una proteína de tipo chaperón durante el ensamblaje de complejos de la membrana interna mitocondrial y la degradación selectiva de proteínas anormales [14,28]. Los estudios en levaduras muestran que el ozono Lon mostrar deficiencia respiratoria debido a la acumulación de proteínas mitocondriales y son incapaces de crecer en fuentes de carbono no fermentables [6,29]. En ambos células de levadura y de mamíferos, la caída de Lon conduce a la acumulación de electrones densas inclusiones que se supone que las proteínas anormales dentro de la mitocondria [6,25,30]. El derribo de Lon mediante pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) causaron una disminución del crecimiento de células tumorales y mejora la sensibilidad de las células para el cisplatino y la luz ultravioleta en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 derivada [31]. Del mismo modo, la regulación negativa de la proteasa Lon en WI-38 VA-13 fibroblastos de pulmón humano por morfolinos antisentido deteriora la estructura y la función mitocondrial y dio lugar a la apoptosis [32]. Además, un estudio reciente ha informado de que Obtusilactone A y (-) - sesamina apoptosis en células de cáncer de pulmón humano inducido por la activación de puntos de control de daño del ADN y la inhibición mitocondrial Lon proteasa [24]. Un trabajo más reciente muestra que el golpe mediada lentiviral abajo de Lon conduce a la muerte celular linfoide B [25]. Estos hallazgos, junto sugieren la participación de Lon en la oncogénesis.
Es bien conocido que las especies reactivas de oxígeno (ROS) se generan principalmente en cadena de transporte de electrones mitocondrial de los mamíferos durante la fosforilación oxidativa contribuyen a la tumorigénesis mediante el control de la proliferación celular, los fenotipos de transformación, y la supervivencia [33]. Curiosamente, la sobreexpresión de Lon en varias líneas celulares de cáncer con exclusión de las células HeLa se demostró recientemente para inducir la producción de ROS y además activar la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y Ras-extracelular quinasa regulada por señales (Ras-ERK) de señalización, que son involucrado en proporcionar ventajas de supervivencia a las células de cáncer, la respuesta de estrés, y la adaptación al microentorno del tumor [34]. Para explorar el papel de Lon en el cáncer de cuello uterino, las células HeLa fueron transducidas con lentivirus que llevan un shRNA para la caída específica de Lon. El descenso de regulación endógena de Lon atenuó la capacidad de proliferación de las células HeLa en cultivo, y dio lugar a una disminución del metabolismo global de energía celular. Los autores especulan que este fenómeno en Lon deficiente en células HeLa resultados de la deficiencia relativa de la función Lon. Disminución de la actividad chaperona de Lon perjudica el montaje y /o la función de los complejos respiratorios y por lo tanto podría inhibir la producción de ROS mitocondrial, que es crucial para la supervivencia y proliferación de las células cancerosas. La inhibición del crecimiento en células HeLa y su menor nivel de OCR OCR basal y después de la adición de inhibidores de complejos respiratorios 'después de Lon silenciamiento están en buen acuerdo con esta explicación [35]. Además, la inhibición del crecimiento se puede atribuir en parte a la pérdida de control de calidad de las proteínas, lo que resulta en la acumulación perjudicial de mal plegada, las proteínas sin montar y /o dañado por oxidación [36]. El mecanismo de esta parte debe ser estudiado en un análisis más detallado.
Conclusión
La regulación positiva de la Lon proteasa en el cáncer de cuello uterino es uno de los mecanismos de adaptación para la viabilidad celular. Abajo regulación o la inhibición de Lon en células de cáncer cervical se detuvo la proliferación de células de cáncer mediante la alteración del metabolismo bioenergético y por lo tanto la orientación Lon puede ser uno de los métodos potenciales en el tratamiento del cáncer. Se requieren más estudios para dilucidar las vías de señalización mediante el cual Lon promueve la tumorigenicidad en el cáncer de cuello uterino. Tomados en conjunto, Lon podría ser un biomarcador útil en el cáncer de cuello de útero y un objetivo potencial en el desarrollo de nuevos fármacos para la terapia contra el cáncer.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. C. K. Suzuki, el Dr. V. Sundararajan y Jae Lee útil para los debates y la revisión de este manuscrito.