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PLOS ONE: aberrante apoptótica respuesta de las células del cáncer colorrectal a nuevos análogos de nucleósidos


Extracto

A pesar de la mayor comprensión de cáncer colorrectal y la introducción de la terapia dirigida de fármacos, la fase metastásica de la enfermedad sigue siendo refractario al tratamiento. Dado que la desregulación de la apoptosis normal, contribuye a la patogénesis de cáncer colorrectal, nuevos análogos de nucleósidos se sintetizaron aquí y evaluados por su capacidad de inducir la apoptosis y causar la muerte celular en dos líneas de células adeno-carcinoma colorrectal, Caco-2 y HT-29. Tres nuevos análogos de nucleósidos evaluados aquí mostraron actividad citotóxica, tal como se mide mediante el ensayo de MTT en contra de las dos líneas celulares: los IC
50 valores oscilaron entre 3 y 37 mM, con células Caco-2 es más sensible que células HT-29. En comparación con camptotecina, el control positivo, los análogos de nucleósidos fueron significativamente menos tóxicos para los leucocitos no estimulados normales (
p
& gt; 0,05). Por otra parte, los nucleósidos fueron capaces de inducir apoptosis como se mide por un aumento de la caspasa 8 y caspasa 3 actividad superior a la del control. Esto fue además apoyada por los datos derivados de los ensayos de Anexina V-FITC. A pesar de los cambios marginales en el potencial de membrana mitocondrial, los tres nucleósidos causó un aumento significativo en citosólica de citocromo c (
p
& gt; 0,05), con una disminución correspondiente en mitocondrial de citocromo c. El análisis morfológico de las dos líneas celulares mostró la rápida aparición de vacuolas después de la exposición a dos de los nucleósidos, mientras que un tercio causó el desprendimiento celular, retrasó vacuolización citoplásmica y anomalías nucleares. Las investigaciones preliminares, utilizando el indicador de monodansylcadaverine autophagic y cloroquina como control positivo, mostraron que dos de los nucleósidos induce la formación de vacuolas autofágicas. En resumen, los nuevos análogos de nucleósidos mostraron citotoxicidad selectiva hacia las dos líneas celulares de cáncer y son iniciadores eficaces de una respuesta apoptótica inusual, lo que demuestra su potencial para servir como andamios estructurales para los análogos más potentes

Visto:. Harmse L, Dahan -Farkas N, Panayides JL, van Otterlo W, Penny C (2015) aberrante apoptótica respuesta de las células del cáncer colorrectal a nuevos análogos de nucleósido. PLoS ONE 10 (9): e0138607. doi: 10.1371 /journal.pone.0138607

Editor: Ferenc Gallyas Jr., Universidad de la Escuela de Medicina Pecs, Hungría

Recibido: 28 Febrero, 2015; Aceptado: 1 de septiembre de 2015; Publicado: 21 Septiembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Harmse et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos están contenidos en el manuscrito e información de apoyo

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Áreas nicho de Investigación de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Sudáfrica y la Universidad de Witwatersrand la Facultad de Ciencias de la Salud Comité de Investigación . JLP fue apoyada por el Programa de Habilidad Escasa NRF para los estudios hacia un doctorado Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

ha habido un progreso sustancial en la comprensión de los mecanismos moleculares de cáncer colorrectal subyacente. Sin embargo, a pesar del uso de la terapia dirigida de fármacos, el cáncer colorrectal sigue siendo asociado con un mal pronóstico. Mientras que las drogas como bevacizumab han mejorado el período de supervivencia para la enfermedad metastásica más allá de 20 meses, no han sido capaces de afectar a una cura. Recientemente, ensayos clínicos han demostrado el fracaso de los inhibidores de tirosina quinasa tales como sunitinib, lo que provocó un aumento de la gravedad y la incidencia de reacciones adversas graves con beneficio terapéutico mínimo [1]. Por lo tanto, la búsqueda de agentes eficaces para el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado sigue siendo una prioridad.

Numerosos estudios han demostrado que el proceso de apoptosis normal es disfuncional en el cáncer colorrectal [2-5]. La desregulación de la apoptosis contribuye al desarrollo de la resistencia a la quimioterapia y un mal pronóstico [6]. La apoptosis, como se ha descrito por primera vez por Kerr en 1972 [7], se caracteriza por una serie de cambios morfológicos, incluyendo formación de ampollas en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, fragmentación nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos. Los sellos de la apoptosis incluyen la exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática [8, 9], los cambios en la permeabilidad mitocondrial de membrana [10] y la liberación de citocromo c desde el espacio inter-membrana mitocondrial, con la posterior activación del efector caspasas [11].

la apoptosis es esencial para la regulación de la facturación normal de las células del epitelio intestinal. Sin embargo, en el cáncer colorrectal, tanto la extrínseca y las vías de apoptosis intrínsecas se vean comprometidas que favorece la proliferación de células neoplásicas. En el cáncer colorrectal, a pesar de la expresión del receptor FAS, las células son resistentes a ligando FAS apoptosis mediada que indica un defecto en la señalización mediada por FAS [12]. TNF apoptosis relacionado con el ligando inductor (TRAIL) mediada por el receptor de la apoptosis está regulada positivamente normalmente en las células cancerosas; sin embargo, en el cáncer colorrectal, se ha observado resistencia a receptor de TRAIL mediada por apoptosis [13]. El producto del gen supresor de tumores p53 está mutado o ausente en el 85% de los cánceres colorrectales. Este factor de transcripción es esencial para la activación de la vía apoptótica intrínseca, así como la expresión de la ciclina quinasa dependiente de inhibidor de p21
WAF1 /Cip1. Las células que son defectuosas en p53 se han reducido los niveles de proteínas de apoptosis, favoreciendo de este modo la proliferación de células neoplásicas [14].

Los agentes quimioterapéuticos que son capaces de inducir la apoptosis son beneficiosos, ya que provocan la muerte de las células cancerosas sin la activación de la respuesta inflamatoria y el síndrome de lisis tumoral asociado con necrosis. Los análogos de nucleósidos se utilizan ampliamente para el tratamiento del cáncer y gestionar las infecciones virales como el herpes y el VIH. Los fármacos que pertenecen a esta clase son conocidos para inducir la apoptosis en los cánceres en los que son eficaces [15].

En el presente estudio, nuevos análogos de nucleósidos se escrutaron contra líneas celulares de cáncer de colon de dos, para investigar tanto sus efectos citotóxicos y su potencial para inducir la apoptosis. Hemos demostrado que a pesar de mostrar relativamente altos de CI
50 valores según lo determinado por el ensayo de citotoxicidad MTT, algunos análogos de nucleósidos fueron comparables a la camptotecina con respecto a su capacidad para inducir apoptosis. Además, los compuestos inducen una respuesta mitocondrial inusual que puede proporcionar más pistas a las anomalías subyacentes de apoptosis en el cáncer colorrectal.

Materiales y Métodos

Cultivo de células

HT-29 (HTB -38 ™) y Caco-2 líneas celulares de cáncer colorrectal humano obtenidas de ATCC (HTB-37 ™), se cultivaron en bajo nivel de glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) que contenía suero de ternera fetal inactivado por calor al 5%. El medio de cultivo y suero de ternera fetal se obtuvieron de Highveld Biológicos, Sudáfrica. Las células fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos de cultivo y se incuban a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. Ambas líneas celulares se subcultivaron cuando alcanzaron la confluencia. Brevemente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato 10 ml seguido de la adición de 4 ml de tripsina y la incubación a 37 ° C durante 10 minutos. Independiente células se volvieron a sembrar en el mismo matraz. La camptotecina (Sigma), un conocido inductor de la apoptosis, y un inhibidor de la topoisomerasa-1, se utilizó como control positivo en todos los procedimientos experimentales.

Evaluación de la viabilidad celular

Evaluación de la prueba de nucleósido citotoxicidad se llevó a cabo por el (2-il-4,5-dimetiltiazol) -2,5-difeniltetrazolio, (MTT), ensayo de 3- (Sigma). El ensayo de exclusión de azul de tripano (Sigma) se utilizó para evaluar la viabilidad de las células de cáncer antes de placas células para ensayos de viabilidad celular de nucleósidos. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 9 000 células /pocillo, permite que se adhieran a la superficie de crecimiento durante 4 horas y luego expuestos a los nucleósidos de prueba durante 48 horas a concentraciones que oscilan entre 1 y 120 mM. El ensayo MTT se realizó esencialmente como se describe por Mossman [16] con la excepción de disolver los cristales de formazán en DMSO. En pocas palabras, después de la incubación con el MTT, 100 l de medio se reemplazó con DMSO para facilitar la solubilización de los cristales de formazán. La absorbancia de los cristales de formazano solubilizados se midió a 540 y 690 nm con un lector de placas Labsystems iEMS. Los datos se obtuvieron a partir de experimentos que se repitieron al menos tres veces, con cada punto de datos se determinaron por cuadruplicado. curvas de dosis-respuesta sigmoidal fueron construidos con GraphPad Prism, versión 5.

Aislamiento de leucocitos periféricos humanos
Permiso
para aislar los leucocitos humanos de voluntarios sanos se obtuvo del Comité de Ética Humana de la Facultad de Salud Ciencias de la Universidad de Witwatersrand (número de autorización, M070519). Escrito se obtuvo el consentimiento informado de cada donante para el uso experimental de sus /sus leucocitos en la investigación. leucocitos periféricos de un solo donante se aislaron de sangre recogida en un tubo heparinizado. Los glóbulos rojos se lisaron selectivamente utilizando el Kit de ADN de sangre Versagene (Gentra Systems). Recién se utilizaron leucocitos preparados para determinar la toxicidad de nucleósido con las células normales. Los leucocitos se transfirieron a RPMI (Highveld Biologicals) medio de cultivo suplementado con glutamina 2 mM (Sigma) y suero de ternera fetal 10% (separaciones). Después de la recolección de los leucocitos, su viabilidad se determinó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano antes de que fueran expuestos a los nucleósidos de prueba durante 24 horas.

Evaluación de la apoptosis

La inducción de caspasa 3 y caspasa 8 actividad.

caspasa 3 y caspasa 8 ensayos colorimétricos específicos, a saber, CPP32 y FLICE, se utilizaron para medir la actividad de caspasa según el protocolo del fabricante (Biovision Research Products). El nivel de actividad de la caspasa en los lisados ​​celulares fue directamente proporcional a la absorbancia de
p
nitroanilina (pNA) medida a 405 nm en un lector de placas Multiscan Labsystems iEMS. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 50 000 células por pocillo y se dejaron crecer durante 18 horas antes del tratamiento con nucleósidos. El contenido de proteína fue estandarizado en todas las muestras de ensayo. La caspasa 3 y actividad de la caspasa 8 se midió después de diferentes períodos de exposición de las células a los nucleósidos de prueba, típicamente a 2, 4, 8, 12, y 24 horas después de la adición de los nucleósidos de las células cultivadas

. Medición del potencial de membrana mitocondrial
.
el colorante catiónico 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro (JC-1) es selectivo para las mitocondrias y su fluorescencia intrínseca hace que sea útil para medir el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana mitocondrial. El protocolo se siguió de acuerdo con las especificaciones del fabricante (BD Pharmingen). El colorante JC-1 se acumula en la mitocondria de las células sanas como agregados rojos fluorescentes. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 50 000 células por pocillo y se dejaron crecer hasta casi confluencia antes del tratamiento con nucleósidos. La citometría de flujo, con filtros de excitación /emisión de 485/540 nm (fluorescencia verde) y 540/590 nm (fluorescencia roja), se utilizó para medir el efecto de los nucleósidos de prueba sobre el potencial de membrana mitocondrial. Las mitocondrias contienen rojos JC-1 agregados en las células sanas se detectaron en el canal FL-2 (puerta superior en la scattergraphs), mientras que verdes JC-1 monómeros en las células apoptóticas se detectaron en el canal de FL-1 (puerta inferior en los scattergraphs ).

Medición de mitocondrial y citoplasmática del citocromo c.

el citocromo c humano Titerzyme Enzyme Inmunométrico de ensayo (Ensayo Designs Inc.) se utilizó para medir la concentración de citocromo c en el mitocondrial y la fracciones citoplasmáticas de las células expuestas a los nucleósidos de prueba. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 50 000 células por pocillo y se dejaron crecer durante 18 horas antes del tratamiento con nucleósidos. Se recogieron las células tratadas y se enjuagaron con helado de solución salina tamponada con fosfato. La fracción citosólica se obtuvo resuspendiendo el sedimento celular con un tampón de permeabilización celular, (sacarosa 250 mM, NaCl 137 mM, KCl 70, Na 4,3 mM
2HPO
4, 1,4 mM K
2HPO
4, 0,2 mg /ml de digitonina y 0,1% Hydorol M) que se suministra en el kit de aislamiento mitocondrial, (Ensayo Designs Inc.) que dejó a las mitocondrias intactas. Esto fue seguido por centrifugación para separar la fracción citosólica y para sedimentar las mitocondrias. Las mitocondrias se lisaron con tampón RIPA, que consta de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio y 0,1% de SDS.

Determinación de la apoptosis tal como se mide por el ensayo de anexina V.

fosfatidilserina (PS) translocación a la membrana celular externa se determinó por isotiocianato de fluoresceína (FITC) que llevan la etiqueta de citometría de anexina V. Flujo analiza con anexina marcada con FITC V y yoduro de propidio se realizaron según el protocolo del fabricante (BD Pharmingen), en las células expuestas a 100 mM de cada uno de los nucleósidos de prueba o de camptotecina durante 24 horas. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 50 000 células por pocillo y se dejaron crecer hasta casi confluencia antes del tratamiento con nucleósidos. tinción de las células se evaluó a través de Anexina V-FITC (fluorescencia verde), así como una exclusión de colorante de yoduro de propidio (PI) (negativo para la fluorescencia roja), grabación de al menos 10
4 eventos. Después de la exposición a los nucleósidos de prueba, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo en un flujo BD LSR II citómetro. Los datos se representa como una Scattergraph con FITC-anexina V (fluorescencia verde) representada en el eje X
frente
PI (fluorescencia roja) en el eje de ordenadas.

caspasa 9 actividad.
9 actividad
caspasa se determinó con el kit de tinción Abcam® caspasa 9 activa FITC. La caspasa 9 inhibidor selectivo LEHD-FMK conjugado con FITC penetra en las células vivas que se unen a la caspasa activa 9 de una manera irreversible. Las células se sembraron en cubreobjetos estériles (50 000 por cubreobjetos) se dejaron adherir durante cuatro horas y se expusieron a los nucleósidos de prueba y camptotecina, respectivamente, por 24 hrs. A partir de entonces las células se lavaron con PBS y después se incubaron con el sustrato a 37 ° C durante una hora. Las láminas fueron lavadas en PBS y se ve en un microscopio de epifluorescencia Olympus BX41. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DP72 y se analizaron con el paquete de software Olympus cellSens. Las células con pantalla caspasa 9 activada una fluorescencia verde brillante.

Evaluación de HT-29 y morfología de las células Caco-2

El efecto de los nucleósidos en la morfología celular se evaluó mediante contraste de fases y microscopía de fluorescencia . Por microscopía de contraste de fase, las células fueron cultivadas en placas de cultivo de 6 pocillos (50 000 células por pocillo), se dejaron adherir durante la noche y luego se exponen a nucleósidos para varios períodos de tiempo. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Las células se observaron con un microscopio invertido Olympus CKX41 y las imágenes se capturaron con una cámara Olympus DP21. La morfología celular se evaluó adicionalmente con el Hoechst 33342 (Life Technologies) y naranja de acridina (Life Technologies) colorantes fluorescentes. Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio esterilizados de calor y se expusieron a los nucleósidos de ensayo a concentraciones variables. El uso de los filtros adecuados, se observaron células con un microscopio de epifluorescencia Olympus BX41. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DP72 y se analizaron con el paquete de software Olympus cellSens.

Evaluación de Bcl-2 y Bax expresión

La expresión y localización celular de Bcl-2 y Bax en las líneas HT-29 y células Caco se determinaron por microscopía de inmunofluorescencia. Las células se cultivaron en cubreobjetos (50 000 células por cubreobjetos), se dejaron adherir durante la noche y se expone a los nucleósidos de prueba y camptotecina durante 6 horas. Después de enjuagar con PBS, las células se fijaron con formaldehído al 3% en PBS durante 20 minutos. Las células se lavaron y se permeabilizaron durante 5 minutos con 0,25% de Triton X100, preparados en PBS con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA). Tras la permeabilización, las células se bloquearon con 1% (BSA) en PBS durante 1 hora. A partir de entonces las células se lavaron y se incubaron durante la noche con los respectivos anticuerpos primarios (Bcl-2 o Bax en PBS con 0,5% de BSA) a 4 ° C. Mouse anti-Bcl-2 y el ratón anti-Bax se obtuvo de Biovision y se utilizan a una concentración de 10 mg /mL. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con especies compatible 568 (Abcam) anticuerpo secundario Alexa-Fluor. FITC-conjugado faloidina, (Abcam), se utiliza para visualizar el citoesqueleto y los núcleos se visualizaron con Hoechst 33342 tinción como se describe anteriormente. Las células fueron vistos usando un microscopio de epifluorescencia Olympus BX41 con los filtros adecuados para cada fluorocromo. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DP72 y se analizaron con el paquete de software Olympus cellSens.

Evaluación de las células para la inducción de la autofagia

Las células fueron cultivadas en cubreobjetos estériles en placas de 6 pocillos 9 (50 000 células por cubreobjetos) permite que se adhieran durante la noche y se trataron con 50 mM de los nucleósidos de prueba. La cloroquina (50 mM) se utilizó como control positivo puesto que se sabe de causar una formación de vacuolas autophagic [17, 18]. Las células fueron expuestas a compuestos de prueba, la cloroquina y camptotecina durante 3 horas, se lavaron con PBS y después se incubaron a 37 ° C con 50 mM monodansyl-cadaverina (MDC) (Sigma), en PBS durante 15 minutos [19, 20, 21]. La camptotecina se incluyó como un control negativo para la formación de vacuolas, ya que no pudo causar la formación de vacuolas en las dos líneas celulares. Los cubreobjetos se lavaron con PBS y las células vivas fueron vistos bajo el microscopio de epifluorescencia Olympus BX41. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DP72 y se analizaron con el paquete de software Olympus cellSens.

compuestos de ensayo de nucleósidos

Los nuevos derivados de nucleósidos, nucleósidos 1, 2 y 5 evaluado en este estudio se sintetizaron en la Facultad de Química, Universidad de Witwatersrand, y se caracteriza por 1
H y
13C espectroscopía de RMN, IR y HRMS. Ellos fueron sintetizados de una variedad de materiales de partida adquiridos de Sigma-Aldrich de acuerdo con procedimientos modificados descritos en Sproat, 1994 [22]. Nucleósidos 2 es un compuesto conocido y los espectros de los otros dos compuestos están disponibles de los autores. Las soluciones madre (20 mM) de los nucleósidos de ensayo se prepararon en el grado de cultivo de tejidos DMSO.

Análisis de datos y estadísticas

Todos los datos se analizaron las curvas de respuesta a la dosis construido utilizando la versión Graph-Pad Prism 5. las diferencias entre los controles y las muestras tratadas con nucleósidos fueron las pruebas de significación con el paquete de software Prizm3 INSTAT, mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba t de Student con un umbral de significación establecida en
p Hotel & lt; 0.05.

Resultados

Los análogos de nucleósidos son citotóxicos para HT-29 y las células Caco-2

Tres nuevos análogos de pirimidina ribonucleósido se identificaron en un procedimiento de detección de veintitrés nuevos nucleósidos que tienen actividad citotóxica contra las dos líneas celulares HT-29 y Caco-2 cuando se prueba a una concentración de 100 mM. Las estructuras de los tres nucleósidos activos se muestran en la figura 1A. Nucleósidos 1 y 2 eran análogos de uridina y nucleósido 5 era un análogo de citidina. Las bases de pirimidina estaban vinculados a través de un
N
vínculo glucosídicos al carbono 1 del azúcar ribosa. Las tres moléculas fueron sustituidos con grupos fenilo voluminosos en el carbono 5 del azúcar ribosa. Nucleósidos 1 tenía un enlace C-O con un grupo 4,4-dimetoxitritilo y nucleósidos 2 y 5 estaban vinculados a un grupo terc-butyldiphenyl a través de un enlace Si-O estable. Los nucleósidos fueron numerados arbitrariamente uno de veintitrés años y prueba de nucleósidos número uno, dos y cinco resultaron ser activos en los ensayos de selección iniciales.

La concentración inhibitoria cincuenta por ciento (IC
50 ) los valores se obtuvieron para los tres nucleósidos activos y se muestran en la figura 1B. Las dos líneas celulares muestran sensibilidad diferencial a los tres compuestos de prueba activos y para la camptotecina. células HT-29 eran más sensibles a la camptotecina de células Caco-2, con una CI
50 valor de 5,7 M en comparación con 10,6 mu M, respectivamente. Nucleósidos de 5 fue el más eficaz contra las células HT-29 con una CI
50 valor de 3,4 M y mostró actividad similar a las células Caco-2 con un IC
50 valor de 4,8 M. En las células HT-29, nucleósido 1 y 2 tenían IC
50 valores de 6,4 y 3,4 veces mayor que la de la camptotecina, se presentan IC
50 valores de 36,3 y 19,1 mM, respectivamente. Esto está en contraste con las células Caco-2, donde nucleósido 1 tenía una actividad similar a la camptotecina y nucleósido 2 era 3 veces más activa que la camptotecina, con un IC
50 valor de 3,5 M. curvas de respuesta de dosis representativo se muestran en la figura S1

La exposición de leucocitos recién aisladas a cada uno de los tres análogos de nucleósidos y de camptotecina, se indica, respectivamente, que nucleósido 2 tuvo el mayor efecto inhibidor sobre los leucocitos, causando una disminución 38,5% de la viabilidad de leucocitos a una concentración de 100 mM. Esto fue dos veces menor que el efecto de la camptotecina en los leucocitos. Nucleósidos 1 y nucleósido 5 fueron los menos tóxicos para los leucocitos, con la viabilidad celular se mantiene a 82,7% y 99,9%, respectivamente (véase la figura 1C).

Nucleósidos inducen la caspasa 8 y la actividad de caspasa 3

caspasa 8 es una caspasa iniciadora que hace que la escisión y la activación de las caspasas efectoras, tales como la caspasa 3. la figura 2 muestra la caspasa 8 y caspasa 3 actividad determinada en varios intervalos de tiempo, después de la adición de los nucleósidos de prueba, para ambas líneas celulares. Los tres nucleósidos causó un aumento en la caspasa 8 y caspasa 3 actividad en ambas líneas celulares en relación con el control negativo. Sin embargo, con la excepción de nucleósido 2, la actividad de la caspasa no fue tan alta como la inducida por camptotecina. Nucleósidos de 2 fue el inductor más eficaz de la actividad de caspasa en ambas líneas celulares, induciendo la caspasa 8 y 3 actividad a un nivel similar al de la camptotecina. Sin embargo, tanto en las líneas celulares HT-29 y Caco-2, la inducción de la caspasa 8 y 3 actividad máxima tomó más tiempo para lograr (12 horas en lugar de 2-4 horas). Es importante destacar que la actividad de ambas caspasas se redujo a una velocidad más lenta que la de las células tratadas de camptotecina, permaneciendo más alta que la camptotecina después de 24 horas de exposición.

Nucleósidos tienen un efecto mínimo en potencial de membrana mitocondrial (Δψm )

el Δψm se midió por citometría de flujo con el tinte fluorescente catiónico JC-1. Los porcentajes de Δψm en el nucleósido tratados HT-29 y células Caco-2 en comparación con las células de control negativo y positivo se resumen en la Tabla 1. En comparación con el control negativo, en las células HT-29, nucleósido 2 y 5 tenían una marginal (& lt; 3%) efecto en la Δψm. Nucleósidos 1 tratamiento dio lugar a 4% de las células con una disminución de la Δψm encima de la del control. Por el contrario, las células tratadas con camptotecina tenían 34,8% de las células con un Δψm disminuido en comparación con el control. En las células Caco-2, nucleósidos 1 y 5 afectados algunos 17% de las células resultantes en una Δψm disminuido, mientras nucleósido 2 tuvo un efecto marginal (& lt; 3%) superior a la del control. Esto está en contraste con camptotecina que causó células 34,6% con una Δψm en las células Caco-2. Scattergraphs se muestran en la Figura suplementaria S2.

Nucleósidos alteran intracelular citocromo c distribución

En las células, entre el 90 y el 100% de se encuentra normalmente dentro de la mitocondria celular total de citocromo c. Fig 3A y 3B muestran que los nucleósidos de prueba aumentó la fracción citocromo c citosólico para ambas líneas celulares en relación con el control negativo, pero no en la misma medida como la camptotecina. En las células HT-29, nucleósido 2 causó el mayor porcentaje de citocromo c de trasladar al citosol (75,35 ± 1,15%), aunque menor que la de la camptotecina (85,19 ± 1,54%). Nucleósidos 1 y 5 causaron algunos 68,22 ± 0,62% y 70,42 ± 0,62% de citocromo c a trasladarse a la citosol, respectivamente.

Las células fueron expuestas a 100 mM de nucleósido 1, 2, 5 y camptotecina, respectivamente , durante 24 horas. Las barras representan la media ± SEM de tres ensayos de ELISA llevadas a cabo por cada nucleósido.

En las células Caco-2, nucleósido 5 causó el mayor porcentaje de citocromo c se desplace hacia el citosol (70,42 ± 1,76%), que es menor que la de la camptotecina (86,94 ± 1,72%). Los efectos de los nucleósidos 1 y 2 eran comparables a nucleósidos 5 con fracciones citosólicas citocromo C de 63,87 ± 2,03% y 68,23 ± 0,62%, respectivamente. Así, los resultados indican que el tratamiento con los análogos de nucleósidos causó una disminución del citocromo c mitocondrial y citosólica aumento concomitante de citocromo c.

Anexina V aumenta de unión en HT-29 y células Caco-2

El ensayo de citometría de flujo para la anexina V-FITC, indica que se indujo apoptosis después de la adición de los análogos de nucleósidos activos a ambas líneas celulares, como se muestra en la Tabla 2 y Fig S3. Después de 24 horas de exposición a los análogos de nucleósidos o camptotecina, había principalmente dos poblaciones de células: células viables, no apoptosing (anexina V-FITC y PI negativo) y células sometidas a apoptosis (anexina V-FITC positivo y PI negativo). Una pequeña población de células se observó que la anexina V-FITC y PI positivo, indicando que estaban en la apoptosis en fase terminal o necrosis.

El porcentaje de cada subpoblación de células en ambas líneas celulares expuestos a los análogos de nucleósidos se muestra en la Tabla 2. en las células HT-29, nucleósido 1 fue el inductor de apoptosis más eficaz, con 38,4% de las células en apoptosis su detección precoz y 5,9% de las células a finales de apoptosis /necrosis. Si bien superior a la camptotecina para la apoptosis temprana, el tratamiento camptotecina, sin embargo, causó cierta 19,6% de las células a cambiar a finales de la apoptosis /necrosis. Esto indica que la camptotecina fue capaz de inducir apoptosis en una tasa más rápida que los nucleósidos. 2 nucleósido tratamiento resultó en 20,5% de las células que están en apoptosis temprana y el 10,6% a finales de la apoptosis. Nucleósidos de 5 tenía 22.2% de las células en apoptosis temprana y 2,3% de células en apoptosis tardía /necrosis.

Los efectos fueron diferentes en las células Caco-2, los tres nucleósidos mostraron un porcentaje similar de células viables, que van desde 61 al 66,3%. Nucleósidos de 5 fue el más efectivo con 30,9% de las células en apoptosis su detección precoz y 4,8% a finales de la apoptosis o necrosis, mientras que después del tratamiento nucleósido 1, 17,4% de las células estaban en apoptosis temprana y 14,8% a finales de la apoptosis. Se detectaron algunos 21,7% de las células en apoptosis temprana y el 11,4% de las células a finales de la apoptosis /necrosis tras 2 tratamientos nucleósido. Scattergraphs se muestran en la Fig S3.

Los nucleósidos no inducen la caspasa 9 actividad

Se determinó la capacidad de los nucleósidos de prueba para estimular la actividad de la caspasa 9 después de las células se expusieron a 50 mM de cada nucleósido durante 24 hrs. La camptotecina (20 mM) se utilizó como control positivo y fue capaz de estimular la actividad de la caspasa 9, en contraste con los tres nucleósidos como se muestra en la figura S4.

Nucleósidos no afectan a la expresión de Bcl-2 y Bax

para obtener más información sobre la redistribución de la citocromo c al citoplasma sin un cambio importante en el potencial de membrana mitocondrial, se determinó la expresión de Bcl-2 y Bax en las células HT-29 y Caco-2 líneas y su respuesta al tratamiento nucleósido. Las células se expusieron a 50 mM nucleósidos durante 6 horas.

Bcl-2 se expresa fuertemente y asociada con el núcleo en las células HT-29 y Caco-2.

En HT no tratado y tratado -29 células, Bcl-2 se expresó con una señal fluorescente fuerte y asociados con el núcleo (S5 Fig). Esto fue confirmado por la fusión de Hoechst y Bcl-2 imágenes que presentaban una imagen fusionada de color rosa que indica la co-localización de los dos fluorocromos. La exposición a los nucleósidos de prueba no tuvo ningún efecto evidente en Bcl-2 niveles de expresión o su distribución subcelular. Caco-2 células de manera similar, tenía una distribución predominantemente nuclear de Bcl-2. Sin embargo, algunas células emiten una señal mucho más débil que otros (S6) Fig. La exposición a los nucleósidos 1 y 2 causó redistribución mínima de Bcl-2 en el espacio perinuclear que no se observó con nucleósido 5 tratamiento.

Bax es pobremente expresado en HT-29 y las células Caco-2 con una distribución perinuclear.

En HT-29 células de control, Bax se asoció con baja densidad con los núcleos con una distribución predominantemente perinuclear (figura S7). Hoechst /Bax se fusionó imágenes apoyan la observación de que Bax tiene una distribución perinuclear. Noteably, la intensidad fluorescente de Bax fue mucho menor que la de Bcl-2 que indica comparativamente más bajos niveles de expresión. La exposición a los tres nucleósidos mostró un pequeño aumento en la fluorescencia Bax en comparación con la del control. Además, el tratamiento con nucleósido 5, causó una agrupación nuclear polarizada de Bax (S7 Fig). El Hoechst /Bax fusionó imagen muestra un aumento en la fluorescencia de color rosa que indica un aumento de la asociación de Bax con el núcleo.

Expresión y distribución celular de Bax fue similar en células Caco-2 (S8 FIG). Bax expresión fue baja en células Caco-2 y las imágenes tuvo que ser mejorado para mostrar la distribución subcelular. Por lo tanto, no era posible determinar si los nucleósidos tuvieron un efecto directo sobre los niveles de expresión de Bax o su distribución subcelular en células Caco-2.

Efectos de los nucleósidos sobre la morfología celular

Hoechst tinción identifica núcleos apoptóticos.

en células HT-29, ambos nucleósidos 1 y 2 fueron capaces de inducir apoptosis como se refleja por el patrón de tinción nuclear específica (indicada con una flecha sólida /bloques en la figura 4). Los núcleos de las células de control no tratados eran típicamente de forma oval, la tinción de azul con una distribución uniforme del colorante. Por el contrario, las células tratadas nucleósido 5 que permanecían unidos a la superficie de crecimiento después de 20 horas, demostraron núcleos de forma irregular (Fig 4), indicando que el núcleo de la célula puede ser un objetivo posible. Además, estas células mostraron un alto grado citoplásmica vacuolización (Fig 4), lo que indica un amplio efecto citoplasmática.

Las células se expusieron a 50 mM de nucleósido 1, 2 y 5 durante 24 horas y se tiñeron con Hoechst 33342 mancha . Barra de escala: 20 micras

Si no se trata células Caco-2 mostraron la estructura nuclear ovalada típica, incluso con tinte de distribución cuando se tiñen con Hoechst (figura 5)..

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