Extracto
Antecedentes y propósito
Los principales obstáculos para el tratamiento de cáncer de páncreas son los altamente invasiva de la capacidad y la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. El glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3) regula múltiples vías celulares y está implicado en varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Aquí investigamos un papel patológico de GSK3 en el fenotipo resistente invasiva y tratamiento del cáncer de páncreas.
Métodos
Se examinaron las células del cáncer pancreático para la expresión de GSK3, la fosforilación y la actividad utilizando el Western Blot y
in vitro
ensayo de quinasa. Los efectos de la inhibición GSK3 sobre la supervivencia de células de cáncer, la proliferación, la capacidad invasiva y la susceptibilidad a la gemcitabina y radiación se examinaron después del tratamiento con un inhibidor farmacológico o por interferencia de ARN. También se examinaron los efectos de la inhibición de GSK3 xenoinjertos de células cancerosas.
Resultados
cáncer de páncreas células mostraron una mayor expresión y actividad de GSK3 que las células no neoplásicas, que se asociaron con cambios en su fosforilación diferencial . La inhibición de GSK3 redujo significativamente la proliferación y supervivencia de las células cancerosas, ellos sensible a gemcitabina y radiación ionizante, y atenúa su migración y la invasión. Estos efectos se asociaron con una disminución en la expresión de ciclina D1 y la fosforilación de Rb. La inhibición de GSK3 también alteró la localización subcelular de Rac1 y F-actina y la microarquitectura celular, incluyendo lamellipodia. Coincidiendo con estos cambios fueron la reducción de la secreción de la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2) y la disminución de la fosforilación de la quinasa de adhesión focal (FAK). Se observaron los efectos de la inhibición de GSK3 invasión tumoral, la susceptibilidad a la gemcitabina, MMP-2 de expresión y la fosforilación de FAK en xenoinjertos tumorales.
Conclusión
La focalización de GSK3 representa una estrategia eficaz para superar la desafíos duales de la invasión y la resistencia al tratamiento en el cáncer de páncreas
Visto: Kitano. a, T Shimasaki, Chikano y, Nakada M, M Hirose, Higashi T, et al. (2013) aberrante glucógeno sintasa quinasa 3β está implicado en el cáncer pancreático de la célula La invasión y la resistencia a la terapia. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10.1371 /journal.pone.0055289
Editor: Sharmila Shankar, Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2012; Aceptado 20 de diciembre de 2012; Publicado: 8 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Kitano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes, Tecnología y Cultura japonesa; la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (a KK, TM); la Sociedad Japonesa para la Tecnología (a KK, TM); la Beca de Investigación de Extensión Universitaria de Colaboración de la Universidad de Kanazawa Instituto de Investigación del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es un importante problema de salud debido a una tasa de supervivencia global a 5 años inferior al 10% [1]. Se caracteriza por la capacidad de proliferación e invasivo de las células tumorales y una fuerte predisposición para la metástasis [2] - [4]. La naturaleza agresiva de cáncer de páncreas dificulta el diagnóstico precoz y la intervención quirúrgica curativa y lo hace resistente a la quimioterapia y la radiación [3], [4]. La terapia ampliamente utilizado es la gemcitabina en infusión, aunque menos de 20% de los pacientes responden a este tratamiento [3], [4]. Se necesitan nuevas estrategias terapéuticas que mejoran los efectos de gemcitabina y atenúan las propiedades invasivas de las células de cáncer de páncreas. terapia dirigida diana molecular ha surgido e incluye la orientación de los receptores del factor de crecimiento, factor angiogénico /receptor y metaloproteinasas de la matriz, ya que estos se expresan de manera aberrante en el cáncer de páncreas [2] - [4]. Varios ensayos clínicos de cáncer de páncreas ya se han apuntado a estos factores de crecimiento, ya sea como monoterapia o en combinación con gemcitabina, pero la mayoría han mostrado poco o ningún beneficio terapéutico [5]. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas moleculares que podrían aumentar los efectos terapéuticos de gemcitabina y radiación es de alta prioridad [6].
La glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3) es una quinasa serina /treonina proteína que regula múltiples vías de señalización [ ,,,0],7]. Sobre la base de sus funciones y la implicación en las patologías primarios conocidos, GSK3 ha sido implicado como un objetivo terapéutico para la intolerancia a la glucosa, los trastornos neurodegenerativos y la inflamación [8]. Hemos demostrado anteriormente que la expresión desregulada, la actividad y la fosforilación de GSK3 son rasgos distintivos de cánceres gastrointestinales y glioblastoma y que GSK3 sostiene la supervivencia y proliferación de estas células tumorales. Un papel para GSK3 aberrante en estos tipos de tumores es apoyado por la observación de que la inhibición farmacológica de su actividad reduce la supervivencia y proliferación de las células cancerosas y los predispone a la apoptosis
in vitro
y en xenoinjertos de tumor [9] - [ ,,,0],12]. Aunque su papel en el cáncer es todavía debatido [13], los resultados globales hasta ahora indican que la expresión aberrante y la actividad de GSK3 es una característica común y fundamental en un amplio espectro de tipos de cáncer (revisado en [14]).
Basado en estudios anteriores que demostraron la implicación de GSK3 en la supervivencia celular mediada por NF-kappa B [15], GSK3 se encontró para apoyar la supervivencia de células de cáncer pancreático a través de esta vía [16], [17]. A pesar de que GSK3 es un regulador clave de la polarización celular y la migración durante los procesos fisiológicos como el desarrollo de los tejidos y la cicatrización de la herida [18], se conoce muy poco sobre su papel en la migración y la invasión de las células cancerosas. Aquí se investigó la posible participación de GSK3 en la naturaleza invasiva de cáncer de páncreas y su resistencia a la gemcitabina y radiación ionizante, los dos principales obstáculos para un tratamiento más eficaz.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes con cáncer de páncreas antes de la cirugía. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la Universidad de Kanazawa.
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio en la Universidad Médica de Kanazawa, y de acuerdo con las directrices nacionales para la utilización de animales en la investigación en Japón (http://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). El protocolo fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Kanazawa.
Líneas celulares y muestras de tejido
Las células humanas embrionarias de riñón (HEK-293) y células de cáncer de páncreas (PANC-1, MIA PaCa-2, BxPC-3, Capan-1) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas líneas celulares se caracterizan por perfiles de ADN en ATCC, y se pasaron por menos de 6 meses después de la reanimación. Se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 en DMEM (HEK-293, PANC-1,, MIA PaCa-2 Capan-1) suplementado con 10% de suero bovino y RPMI 1640 (BxPC-3) fetal (FBS) y antibióticos (penicilina G y estreptomicina) (GIBCO). Las células se recogieron durante la fase de crecimiento exponencial para la extracción de ARN y proteínas.
Este estudio incluyó a 15 pacientes con cáncer de páncreas que se sometió a una cirugía en el Departamento de Oncología Quirúrgica, Hospital de la Universidad de Kanazawa (Tabla S1). Las muestras quirúrgicas fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra, se incluyeron en parafina y se procesaron para el diagnóstico histopatológico y los exámenes inmunohistoquímicos.
Western Blot
La proteína se extrae de las células cultivadas utilizando tampón de lisis (CelLytic -MT, Sigma-Aldrich) que contiene una mezcla de inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de los extractos de proteínas se midieron por ensayo de proteínas Coomassie (Pierce) Reactivos. A 30 g alícuota de proteína se separó en la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se analizaron por transferencia de Western para las proteínas de interés y su fosforilación [9], [11], [12] utilizando los respectivos anticuerpos primarios (Tabla S2). membranas electrotransferencia (Amersham) se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino antes de la detección de fracciones de proteínas fosforiladas. La cantidad de proteína en cada muestra se controló mediante la expresión de β-actina. Las señales fueron desarrolladas utilizando quimioluminiscencia mejorada (ECL).
in vitro
Ensayo de quinasa GSK3 para la Actividad
Un nonradioisotopic
in vitro
ensayo de quinasa in (NRIKA) [19] se utilizó para detectar la actividad de GSK3 derivado de las células. El NRIKA utiliza una combinación secuencial de inmunoprecipitaciones para aislar GSK3 en las muestras de proteínas celulares, un
vitro de reacción de quinasa en
que utiliza la proteína recombinante humana β-catenina (sustrato) y no radioisotópica de adenosina trifosfato (ATP), seguido de inmunotransferencia para detectar la β-catenina phosporylated en la serina (S) 33, S37 y /o treonina (T) 41 residuos (p-β-catenina
S33 /37 /T41) [19]. Como control negativo, el anticuerpo monoclonal de ratón a GSK3 fue sustituido por una cantidad igual de IgG de ratón no inmune (Sigma-Aldrich) en la etapa de inmunoprecipitación. actividad GSK3 se demuestra por la presencia de p-β-catenina
S33 /37 /T41 en la reacción de prueba y por su ausencia en la reacción de control negativo. La cantidad de inmunoprecipitada GSK3 y la presencia de la proteína β-catenina recombinante en la reacción de quinasa fueron monitorizados por inmunotransferencia
Inmunohistoquímica
expresión y /o la fosforilación de GSK3, metaloproteinasa de matriz (MMP). - 2 y quinasa de adhesión focal (FAK) en tejidos tumorales y no neoplásicas adyacentes de pacientes con cáncer pancreático fueron examinados por el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa [11], [12]. Después de la desparafinación, desenmascarar antígeno microondas y el bloqueo de inmunorreacciones no específicos, las secciones de parafina se incubaron con anticuerpo de GSK3, tirosina (Y) 216-fosforilados GSK3 (p-GSK3
Y216), MMP-2, FAK, Y397 fosforilado o Y861 fosforilado FAK (p-FAK
Y397, p-FAK
Y861) y p-β-catenina
S33 /37 /T41, respectivamente. Fuentes y diluciones de trabajo de estos anticuerpos se muestran en la Tabla S2. Las secciones fueron incubadas con biotina de cabra IgG anti-conejo o caballo anti-IgG de ratón (diluido 1:200; Vector). La inmunorreactividad se detectó usando el kit de ABComplex /HRP (DakoCytomation). Para el control negativo, los anticuerpos primarios fueron sustituidos por conejo o IgG de ratón no inmune (DakoCytomation). La sobreexpresión o mayor fosforilación de las moléculas respectivas en los tumores se definió como la expresión más fuerte o la fosforilación de cualquiera de las proteínas en las células tumorales en comparación con conductos pancreáticos no neoplásicas en el mismo paciente.
Efectos de GSK3 inhibición sobre Supervivencia Celular y proliferación
células sembradas en placas de 96 pocillos se trataron con dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) o un inhibidor de GSK3 (AR-A014418; Calbiochem) disueltos en DMSO a las concentraciones finales indicadas en el medio. En particular, AR-A014418 no inhibe la actividad de 26 quinasas estrechamente relacionadas y se considera altamente específico para GSK3 [20]. En los puntos de tiempo designados, los números relativos de células viables y en proliferación se determinaron usando WST-8 (4- [3- (4-yodofenil) -2- (4-nitrofenil) 2H-5-tetrazolio] -1,3 benceno disulfonato) kit de ensayo (kit de recuento de células-8;. Wako) y la proliferación celular kit ELISA de BrdU (Roche), respectivamente
pequeños ARN de interferencia (siRNA) específico para GSK3 humana (GSK3 Validado sigilo RNAi) y control negativo siRNA (sigilo RNAi control negativo bajo GC duplex) se adquirieron de Invitrogen. El siRNA GSK3-específica se dirige a la secuencia 5'-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 '. Las células fueron transfectadas con 10 nM de ARNsi ya sea utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). El efecto de la interferencia de ARN en la expresión de GSK3 se determinó por transferencia de Western utilizando un anticuerpo contra tanto GSK3α y β (Tabla S2). La especificidad de siRNA GSK3-específica fue confirmado en nuestros estudios anteriores [11], [12]. Para examinar el efecto de la interferencia de ARN GSK3 en la supervivencia celular y la proliferación, las células sembradas en placas de 96 pocillos fueron transfectadas con 10 nM del control o siRNA GSK3-específico. A las 72 horas después de la transfección, los números relativos de células viables y en proliferación se determinaron por los métodos descritos anteriormente.
Efectos de GSK3 La inhibición de la susceptibilidad de las células cancerosas a la gemcitabina y a la radiación ionizante
Las células cancerosas sembradas en placas de 96 pocillos (3-6 × 10
4 células por pocillo) fueron tratados con crecientes concentraciones de gemcitabina (Eli Lily) o AR-A014418. Después del tratamiento durante 72 horas, el número relativo de células viables se midió por WST-8 ensayo para determinar IC
50 (la supervivencia celular 50% concentración inhibitoria) para gemcitabina y AR-A014418 y generar isobologramas. Las células se trataron luego con una dosis de gemcitabina cerca de IC
50 en presencia de DMSO o una dosis baja (5 o 10 mM) de AR-A014418. Se utilizó el método del isobolograma [21] para determinar si el efecto inhibidor de GSK3 en la susceptibilidad de células de cáncer pancreático a la gemcitabina fue aditivo, sinérgico o antagónico.
El efecto inhibidor de GSK3 en la susceptibilidad de células de cáncer pancreático a la radiación ionizante era examinado por el ensayo de supervivencia de las células de formación de colonias. En cada pocillo de placas de 6 pocillos, 1000 células de cáncer de páncreas se sembraron y se trató secuencialmente con DMSO o una dosis baja (5 o 10 mM) de AR-A014418 durante 24 horas y con radiación ionizante a dosis de 0, 4 y 8 Gy. A los 6 días después de la irradiación, el número total de colonias teñidas con 0,1% de violeta cristal (Wako) se obtuvo en cada pocillo. El número medio de colonias en tres experimentos separados se calculó con desviaciones estándar.
Los ensayos para la migración celular y la invasión
migración de las células del cáncer y la invasión se examinaron mediante ensayo y transwell de cicatrización de heridas basado en monocapa ensayo. monocapas confluentes de células de cáncer de páncreas en presencia de DMSO o AR-A014418 a una dosis de 5 o 10 mM estaban rayados con una punta de 20 l-micropipeta para crear una zona libre de células (herida). En cada condición, la distancia de separación entre los bordes de la herida se controló a tres puntos fijos de referencia de 6 a 24 horas por una cámara CCD (Axiocam MRM, Zeiss) conectado a un microscopio de contraste de fase (Axiovert 40 CFL, Zeiss). La migración de células en cada punto temporal se calculó como la distancia media de la herida medida en los tres puntos y se comparó entre las células tratadas con DMSO y AR-A014418.
migración celular y la invasión se examinaron mediante los ensayos Transwell usando sin recubrimiento y matrigel recubierto de 24 pocillos sistema de doble cámara (cámara BD BioCoat Matrigel ™ ™ incubación, BD Bioscience). Las células cancerosas se suspendieron en medio libre de suero que contiene DMSO o AR-A014418 (5 o 10 mM), y 2 × 10
4 células se aplicaron a la pareja cámara superior con la cámara inferior llena de medio que contiene 10% de FBS ( como un quimioatrayente) y DMSO o AR-A014418 (5 o 10 mM). A las 22 horas después de permitir que las células para migrar e invadir, las células en el lado inferior de la cámara se fijaron y tiñeron con Diff-Quick Kit (Symex). En cada ensayo, se contó el número total de células por campo microscópico de alta potencia en el lado inferior de la cámara sin recubrir o matrigel recubierto y obtuvo para la migración de células o invasor. La media del número de células en cinco campos microscópicos de alta potencia se calculó con desviaciones estándar.
Las células cancerosas Morfología celular e inmunofluorescencia Citoquímica
cultivadas en un cubreobjetos fueron tratados con DMSO o AR- A014418 (5 o 10 mM) durante 12 horas y luego rayados como se describe anteriormente. A las 12 horas después de rascarse, las células a lo largo de los bordes de la herida se observaron por microscopía de contraste de fase. Estas células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,1% Triton-X (Sigma-Aldrich). Las células se incubaron en serie con anticuerpo monoclonal de ratón a Rac1 (BD Bioscience; diluido 1:200) a 4 ° C durante la noche y con Alexa Flour® 488 marcado con anti-IgG de ratón (Invitrogen; diluyeron 1:1,000) a temperatura ambiente durante 40 min en la oscuridad. Después de lavar el exceso de anticuerpo, las células se tiñeron para la actina filamentosa (F) con faloidina marcada con Alexa 546 Flour® (Invitrogen; diluyeron 1:40) durante 20 min. A continuación, los núcleos celulares se contratiñeron con Hoechst 33342 (Molecular Probes) y se observaron por microscopía de fluorescencia (Keyence) para la expresión y localización subcelular de Rac1 y F-actina.
Rac1 Actividad
Proteína se extrajo de las células tratadas con DMSO o 10 M AR-A014418 durante 24 horas en tampón 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) que contiene NaCl 150 mM, MgCl 5
2, 1% NP-40, ditiotreitol y 1 mM 5% glicerol. Activo Rac1 fue aislado de la muestra de proteína por el método pull-down usando GST-humano Pak1-PBD (Thermo) y resinas (Glutathione Sepharose 4 Fast Flow; GE Healthcare). La fracción de Rac1 unido a guanosina trifosfato (GTP) (Rac1-GTP, una forma activa) se eluyó de las resinas y se detectó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpo policlonal de conejo a Rac1 (diluido 1:1,000; Thermo). Por otra parte, la proteína celular total se sondeó para el total de Rac1 usando el mismo anticuerpo.
expresión y secreción de MMP-2 (MMP-2)
La expresión de MMP-2 mRNA fue examinado por cuantitativa PCR con transcripción inversa (QRT-PCR). ARN total fue aislado de las células utilizando ISOGEN (Wako). ADN complementario (ADNc) se generó usando un kit de transcripción inversa (Promega). QRT-PCR se realizó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq
TMII (Takara Bio) con los respectivos conjuntos de cebadores sentido y antisentido para la amplificación de MMP-2 y β-actina (Tabla S2) [11].
MMP-2 expresión se analizó por zimografía de gelatina [22]. Las células cancerosas fueron sembradas en placas de 12 pocillos durante 48 horas y después se trataron con DMSO o AR-A01418 (10 o 25 mM) durante 24 horas en medio libre de suero. células tratadas medio acondicionado o se incubaron con tampón de muestra de SDS durante 30 min a 37 ° C. Las muestras se separaron en 10% de SDS-PAGE que contiene 0,005% de gelatina Alexa Fluor 680 marcado. Después de la electroforesis, los geles se lavaron en 2,5% de Triton X-100 durante 2 horas y después se incubaron en tampón de sustrato durante la noche a 37 ° C. El gel fue analizado por el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey LI-COR (Lincoln).
Tumor Study xenoinjerto
Hemos preparado subcutáneos PANC-1 xenoinjertos en ratones como se describe [23]. Estos ratones fueron asignados a 4 grupos y se trataron con inyección intraperitoneal (dos veces a la semana durante 10 semanas) de DMSO (diluyente), gemcitabina (20 mg /kg de peso corporal) y AR-A014418 (2 mg /kg de peso corporal, lo que equivale a 10 M en medio de cultivo tal como se determina y optimizado en nuestros estudios anteriores [10], [12]) solo o en combinación, respectivamente. Todos los ratones fueron terminadas después del tratamiento y los tumores de xenoinjertos se retiraron y se procesaron para examen histológico y técnicas de inmunohistoquímica para la expresión de MMP-2 y FAK y la fosforilación de FAK en las células tumorales, como se describe anteriormente.
Análisis estadístico
Entre el grupo se determinó la significación estadística utilizando el Student
t
prueba. En el estudio de xenoinjertos de tumores, los volúmenes tumorales en cada grupo de tratamiento se expresan como media ± desviación estándar (SD). La significación estadística de las diferencias entre los datos se determinó con Kruskal Wallis H prueba seguido de Mann-Whitney U-test con corrección de Bonferroni. Un
P
valor de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
expresión, fosforilación y la actividad de GSK3 en células de cáncer
células del cáncer pancreático. mostraron mayores niveles basales de GSK3 y la forma activa Y216 fosforilado (p-GSK3
Y216) y niveles más bajos de la forma inactiva fosforilada-S9 (p-GSK3
S9) en comparación con HEK 293 células (Fig. 1A ). derivado de células del cáncer de GSK3 fue activo para la fosforilación de su sustrato, β-catenina (Fig. 1B). Estos resultados indican que las células de cáncer de páncreas expresan GSK3 activos que no está regulada por la fosforilación diferencial a S9 y Y216. Inmunohistoquímica para las secciones en serie mostró que GSK3 y p-GSK3
Y216 se expresaron de forma difusa y colocalized en las células tumorales y sobreexpresa en las células tumorales invasivas de 8/15 (53%) pacientes de cáncer de páncreas (Fig. 1C). La sobreexpresión fue más frecuente en pacientes con T3 /T4 tumor primario o con ganglios linfáticos y metástasis a distancia en el momento de la cirugía (Tabla S1).
(A) extracto de proteína de cada línea celular se analizó mediante inmunotransferencia de la expresión de GSK3 y su fosforilación (p-GSK3
S9, p-GSK3
Y216). expresión ß-actina se controló como control de carga. actividad (B) GSK3 fue detectado por NRIKA [19] en las células respectivas. Como se describe en Materiales y Métodos, la actividad de GSK3 se demuestra por la presencia de p-β-catenina
S33 /37 /T41 en la reacción de prueba (T) y por su ausencia en la reacción de control negativo (NC). La cantidad de inmunoprecipitada GSK3 y la presencia de sustrato (β-catenina) en la reacción de quinasa fueron monitorizados por inmunotransferencia. (C, D) secciones de parafina de serie de un cáncer pancreático primario y su tejido no neoplásico adyacente (paciente Nº 5 en la Tabla S1) se inmunotiñeron para GSK3 y p-GSK3
Y216 (C), y para MMP-2 , FAK, p-FAK
Y397 y p-FAK
Y861 (D). La barra de escala en cada panel indica de 100 micras de longitud.
Efectos de GSK3 Inhibidor de la célula supervivencia y la proliferación
Hemos investigado si GSK3 contribuye a la supervivencia y proliferación de células cancerosas. Los niveles de glucógeno sintasa (GS) fosforilados en Y641 (p-GS
S641) y p-β-catenina
S33 /37 /T41 disminuyó en células de cáncer después del tratamiento con AR-A014418 (Fig. S1 A, B ), lo que indica su actividad contra GSK3 en células de cáncer. inhibición GSK3 atenuó la supervivencia y la proliferación de las células cancerosas (Fig. 2A, C). El agotamiento de GSK3 por ARN de interferencia atenuada la viabilidad celular y la proliferación en todas las líneas celulares de cáncer (Fig. 2B, D). Estos resultados son consistentes con los estudios anteriores [16], [17] lo que sugiere que los impactos GSK3 aberrantes sobre la supervivencia y proliferación de las células del cáncer pancreático.
(A) número relativo de células viables en los puntos temporales designados eran medido por WST-8 ensayo para las respectivas células en presencia de DMSO o AR-A014418 a las concentraciones indicadas. (B) se midieron números relativos de células viables para las células respectivas después de la transfección de no específica (NS) o siRNA GSK3-específico. (C, D) El número relativo de células en proliferación se determinó midiendo la cantidad de incorporación de BrdU. Las células en crecimiento se puntuaron a las 48 horas después del tratamiento con DMSO o AR-A014418 (10 M, 20 M) (C), o después de la transfección con no específica (NS) o GSK3-siRNA (D). Los valores mostrados en (A-D) son las medias ± DE de cinco experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05, una diferencia estadísticamente significativa entre las células tratadas con DMSO o AR-A014418 y entre las células tratadas con no específica y GSK3-siRNA
Efectos de GSK3. inhibidor combinado con gemcitabina o radiación contra el cáncer de células
los resultados anteriores nos llevaron a abordar si la inhibición de GSK3 podría aumentar los efectos de gemcitabina y radiación ionizante. Las dosis altas (25 o 50 mM) de AR-A014418 solo tuvieron un efecto terapéutico contra las células cancerosas (Fig. 2A, C). Por lo tanto, los efectos de dosis relativamente bajas (5 o 10 mM) se ensayaron en combinación con gemcitabina o radiación ionizante. En primer lugar, se examinaron los efectos dependientes de la dosis de AR-A014418 y gemcitabina sobre la supervivencia de células de cáncer y se determinó su IC
50 valores (Fig. 2A, Fig. S2). IC
50 valores para AR-A014418 fueron similares en PANC-1, MIA Paca-2 y BxPC-3 células, mientras que los de gemcitabina variado (Tabla S3). A continuación examinó el efecto de la AR-A014418 sobre la susceptibilidad de las células cancerosas a la gemcitabina. Cuando las células fueron tratadas con dosis crecientes (1 ng /ml a 10 mg /ml) de la gemcitabina, la combinación con dosis bajas de AR-A014418 reducido significativamente el IC
50 de gemcitabina (Fig. S2, Tabla S4). análisis de isobolograma [21] de los datos reveló que una dosis baja de AR-A014418 en combinación con gemcitabina fue aditivo contra las células PANC-1 y sinérgica contra MIA PaCa-2 células (Fig. 3A). Se confirmó que el tratamiento combinado con AR-A014418 mejora de forma significativa el efecto de la gemcitabina contra xenoinjertos de células de cáncer (Fig. 3C) en roedores, sin efectos perjudiciales por el reactivo.
(A) La influencia de la AR-A014418 en se analizó el efecto de gemcitabina con el isobolograma [21] mediante el trazado de la IC
50 de la terapia de combinación (Fig. S2, Tabla S4). (B) El efecto combinado de la radiación ionizante y AR-A014418 se probó en PANC-1 y las células MIA PaCa-2 mediante el ensayo de formación de colonias. *
p
& lt; 0,05, diferencias estadísticamente significativas entre las células tratadas con DMSO o AR-A014418. (C) El efecto combinado de gemcitabina y AR-A014418 se probó en PANC-1 xenoinjertos. ratones atímicos con PANC-1 xenoinjerto se asignaron a cuatro grupos de tratamiento con inyección intraperitoneal (dos veces a la semana) de DMSO (control; 8 ratones), gemcitabina (GEM; 20 mg /kg de peso corporal; 9 ratones) y AR-A014418 ( AR; 2 mg /kg de peso corporal; 8 ratones), solo o en combinación (GEM + AR; 9 ratones). En el momento después del tratamiento durante 10 semanas, el volumen del tumor (cm
3) se calculó utilizando la fórmula de 0,5 × S
2 × L, donde S es el diámetro del tumor más pequeño (cm) y L es la más grande (cm ) [10], [12]. El volumen medio del tumor se comparó entre los 4 grupos. *
p
& lt; 0,05, una diferencia estadísticamente significativa entre los datos
El efecto de AR-A014418 combinado con radiación ionizante se ensayó en células de cáncer.. En ensayo de supervivencia de células de formación de colonias, la presencia de 10 mM AR-A014418 redujo significativamente la viabilidad de las células de cáncer en comparación con el tratamiento con radiación ionizante solos (Fig. 3B). En conjunto, estos resultados demuestran que el tratamiento combinado con un inhibidor de GSK3 sensibiliza las células cancerosas a la gemcitabina y a la radiación ionizante.
Molecular alteraciones asociadas con GSK3 inhibición en células de cáncer
Para entender el mecanismo que subyace a la participación de GSK3 en la proliferación de células de cáncer y la resistencia a la terapia, se investigó el efecto de la inhibición de GSK3 en la expresión y la fosforilación de proteínas implicadas en la regulación y la proliferación del ciclo celular. De acuerdo con estudios anteriores (revisado en [2]), las células de cáncer de páncreas mostraron fosforilación de la proteína Rb (p-Rb
S780, p-Rb
S807 /811; Fig. 4), lo que sugiere que la unión al E2F factor de transcripción se veía afectada [24]. El tratamiento con AR-A014418 o siRNA GSK3-específica disminuyó los niveles de fosforilación de Rb y la expresión de ciclina D1 (Fig. 4), sin embargo no se encontraron cambios consistentes para CDK4 o CDK6 expresión.
(A) Análisis de inmunotransferencia compara la expresión de Rb, CDK4, CDK6 y ciclina D1, y la fosforilación de Rb en S780 y S807 811 residuos /(p-Rb
S780, p-Rb
S807 /811) entre las células tratadas con DMSO ( DM) o 10 mM AR-A014418 (AR) por 24 hrs. (B) Los cambios en los niveles de p-Rb
S780 y p-Rb
S807 /811 y expresión de Rb y ciclina D1 se examinaron en MIA células Paca-2 en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento con 10 mM AR -A014418. (C) Expresión de Rb, ciclina D1, proteínas y niveles de fosforilación de Rb (p-Rb
S780) GSK3α y GSK3 se examinaron y compararon entre las mismas células de cáncer de páncreas transfectadas con siRNA no específica (NS) o GSK3β- siRNA (S) (10 nM cada uno). (A-C) la expresión de β-actina se controló como control de carga.
Efectos de GSK3 inhibición sobre la migración celular y la invasión del cáncer
El ensayo de cicatrización de heridas mostró que la migración de las células de cáncer se redujo significativamente por el tratamiento con 5 mM y 10 mM AR-A014418 (Fig. 5A, Fig. S3). Es importante destacar que estas concentraciones eran insuficientes para inhibir la proliferación celular de 24 horas después del tratamiento (Fig. 2A). En el ensayo transwell, 5 M y 10 M AR-A014418 inhibieron la migración quimiotáctica de las células cancerosas y su invasión de componente de la matriz extracelular (Fig. 5B).
(A) paneles superiores muestran el transcurso de tiempo para PANC- migración celular 1 en un ensayo de cicatrización de heridas en presencia de DMSO o AR-A014418 (AR). El panel inferior muestra las anchuras relativas de las heridas medidos como un porcentaje de la diferencia inicial en el tiempo cero. *
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& lt; 0,05, diferencias estadísticamente significativas entre las células tratadas con DMSO o AR-A014418. (B) se marcaron las células que migran a través transwell sin recubrimiento y la invasión de las células a través de Transwell Matrigel recubierto de por PANC-1 y células MIA Paca-2 tratados con DMSO o AR-A014418 (AR) durante 22 horas. photomicroscopic resultados representativos en cada ensayo se muestran a continuación las columnas. *
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. & Lt; 0,05, diferencia estadísticamente significativa entre las células tratadas con DMSO o AR-A014418
Los cambios en el fenotipo de las células invasiva del cáncer después de GSK3 inhibición
Los resultados anteriores nos llevaron a la hipótesis de que GSK3 tiene un papel en la migración celular y la invasión del cáncer. Esto se puede atribuir al epitelio-mesenquimal transición (EMT), un fenotipo responsable de la invasión de células del cáncer y la metástasis [25]. Se investigó la expresión de las moléculas relacionadas con EMT-E-cadherina, N-cadherina y vimentina en células de cáncer después del tratamiento con AR-A04418 y siRNA GSK3-específico. No se observaron cambios consistentes en los niveles de expresión de estas moléculas (Fig. S1c, D), lo que implica que EMT es poco probable que sea el mecanismo por el que la inhibición de GSK3 atenúa la migración de células de cáncer y la invasión. Una posible explicación puede ser que las líneas celulares de cáncer establecidas ya han adquirido el fenotipo EMT.
A continuación enfocados en microarquitectura celular y, en particular, en lamellipodia que juega un papel importante en la migración celular durante los procesos fisiológicos y en la migración de células de cáncer y la invasión [26]. Un miembro de la familia Rho-GTPasa, Rac1, participa en la formación lamelipodia y en la progresión del cáncer [27]. ensayo de la cicatrización de heridas mostró que la migración de células cancerosas forman lamellipodia en el sitio de Rac1 localización, con los filamentos de actina la organización de la estructura laminar. El tratamiento con AR-A014418 disminución de la formación lamelipodia en las células cancerosas en el borde de la herida y dio lugar a la distribución difusa citoplasmática de Rac1 y F-actina (Fig. 6A). 3C.