Extracto
autofagia muerte celular o la autofagia abortiva se ha propuesto eliminar dañado, así como las células cancerosas, pero sigue habiendo una brecha crítica en nuestro conocimiento de cómo se regula este proceso. El objetivo de este estudio fue identificar moduladores de la vía de la muerte celular por autofagia y dilucidar sus efectos sobre la señalización y la función celular. El resultado de nuestras pruebas de detección de la biblioteca siRNA muestran que un complejo coatomer intacta I (COPI) es obligatoria para la autofagia productiva. El agotamiento de los miembros del complejo COPI disminución de la supervivencia celular y deteriora la autofagia productiva que precedió estrés del retículo endoplásmico. Además, la autofagia abortiva provocada por el agotamiento de COPI alterado significativamente el factor de crecimiento de señalización en varias líneas celulares de cáncer. Finalmente, se muestra que los miembros complejas COPI se sobreexpresa en una variedad de líneas celulares de cáncer y varios tipos de cáncer de los tejidos en comparación con líneas de células o tejidos normales. En los tejidos de cáncer, la sobreexpresión de los miembros COPI se asocia con un mal pronóstico. Nuestros resultados demuestran que el complejo coatomer es esencial para la autofagia productiva y la supervivencia celular, y por lo tanto la inhibición de los miembros de COPI pueden promover la muerte celular de las células cancerosas cuando se ve comprometida apoptosis
Visto:. Claerhout S, Dutta B, W Bossuyt , Zhang F, Nguyen-Charles C, Dennison JB, et al. (2012) abortiva autofagia Induce retículo endoplasmático El estrés y la muerte celular en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (6): e39400. doi: 10.1371 /journal.pone.0039400
Editor: Gordon Langsley, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale - Institut Cochin, Francia |
Recibido: 22 de marzo 2011; Aceptado: 21 de mayo de 2012; Publicado: 26 de Junio, 2012
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Financiación:. Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de la Fundación Komen (KG 081694 y FAS0703849), la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas, y el Fondo de Investigación del cáncer de Ovario de GBM, y por el MD Anderson Cancer Center programa de subsidios para CA016672. SC es apoyado por el Programa de Odyssey y el Theodore N. Ley de Dotación para el Logro Científico de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center. JBD es apoyado por el programa de becas MD Anderson GlaxoSmithKline triunfo y BD por los Institutos Nacionales de Salud consorcio para la terapéutica de siRNA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas se encuentran con varios obstáculos, tales como cambios de pH y se redujera el suministro de nutrientes y oxígeno durante la iniciación del cáncer, la progresión y la difusión [1]. Para restablecer la función celular correcta y la homeostasis en condiciones de baja a niveles moderados de estrés, las células cancerosas activan procesos celulares de protección tales como la autofagia. La autofagia es un proceso altamente conservada que se encuentra de la levadura a los mamíferos. Es un proceso de degradación único caracterizado por el secuestro del citoplasma a granel incluyendo proteínas y orgánulos, que se entregan al sistema lisosomal para la digestión final [2]. El levantamiento y la degradación de estos componentes celulares produce energía y los bloques de construcción necesarios para la supervivencia de las células cancerosas durante el estrés metabólico. La finalización de este proceso se denomina autofagia productiva o flujo de autofagia [2]. Sin embargo, no productiva, no controlada, o la autofagia prolongada conduce a lo que se ha denominado "la muerte celular por autofagia" [3], [4] o, como nos referimos a "autofagia abortiva" [5].
en el cáncer, se ha propuesto el proceso de autofagia para contribuir tanto a la supresión de tumores y la progresión. Por un lado, la autofagia suprime tumores mediante la limitación de la iniciación y la progresión. La expresión de Beclin 1, el homólogo de mamífero de la levadura autofagia Atg6 gen que es crítico para la inducción de la autofagia, se reduce en muchos tejidos de cáncer y líneas celulares de cáncer [6]. Además, el gen asociado a la resistencia a la radiación ultravioleta (
UVRAG
), necesaria para la función supresora de tumores de Beclin 1, también es monoallelically mutado en muchos cánceres humanos [7]. Por otra parte, la autofagia también suprime la tumorigénesis, proporcionando el ATP necesario para la reparación del ADN [8] o mediante la eliminación de la p62 de larga vida de proteínas [9]. Por otro lado, la autofagia puede promover la tumorigénesis mediante la superación de la tensión provocada por la falta de nutrientes y oxígeno en tumores pre-invasivas y de rápido crecimiento. Nuestro laboratorio ha mostrado que la fosforilación dependiente de la vía LKB1-AMPK de p27 en la treonina 198 estabiliza p27 y permite las células para sobrevivir a la retirada del factor de crecimiento y estrés metabólico mediante la inducción de la autofagia [10]. Esta respuesta autophagic puede contribuir a la supervivencia de células tumorales durante la privación del factor de crecimiento o nutriente interrumpido y el metabolismo energético. Por lo tanto, dependiendo del contexto celular y la fuerza y la duración de las señales de estrés, la autofagia ya sea previene o promueve la carcinogénesis.
Además de su papel en la carcinogénesis, la autofagia también modula la eficacia de los fármacos terapéuticos. La inducción de un proceso de autofagia "productiva" por la quimioterapia y la radiación permite la supervivencia de células de cáncer [11]. Esto sugiere que la autofagia moduladores pueden sensibilizar células tumorales a terapias convencionales contra el cáncer [11], [12]. Al dirigirse a proteínas clave en la autofagia productiva, las células pueden someterse a "autofagia abortiva", un mecanismo de muerte alternativa para las células cancerosas resistentes a los agentes inductores de la apoptosis [11], [13]. Aunque el proceso de autofagia productiva se ha estudiado ampliamente, no está claro qué factores regulan la autofagia abortiva. La identificación de estos moduladores podría mejorar la eficacia de la terapia convencional y contribuir en el descubrimiento de nuevos tratamientos para pacientes con cáncer
.
El propósito de este estudio fue identificar los reguladores de la autofagia abortiva y elucidar su efecto sobre los mecanismos de señalización celular y la supervivencia en células de cáncer. Empleamos las pantallas pequeñas de ARN de interferencia (siRNA) en combinación con la validación y estudios funcionales. Miembros del complejo coatomer I (COPI), que están implicados en el tráfico celular, surgieron como los principales éxitos de nuestras pantallas de modulación de la autofagia y la muerte celular en las células cancerosas. Se observó la autofagia abortiva y estrés del retículo endoplasmático (ER) después de la precipitación de los componentes COPI. fosfoinosítido Además, COPI agotamiento afectó 3-quinasa (PI3K) /Akt vía. En total, los efectos de COPI sobre la muerte celular, la autofagia y el estrés ER fueron más pronunciados en las células cancerosas que en las células normales. Esto es coherente con la sobreexpresión de proteínas y genes COPI visto en líneas celulares de cáncer y muestras de pacientes.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y Reactivos
La célula de cáncer de mama humano líneas MDA-MB-231 [10], MDA-MB-468 [10], BT549 (American Type Culture Collection (ATCC); Manassas, VA), T47D [10], SKBR3 (ATCC), HCC1428 (ATCC) y MCF7 [10], las líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3 (ATCC), y OVCAR3 (ATCC) se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 5% de FBS. células MDA-MB-231, MDA-MD468 y SKOV3 transfectadas de forma estable con GFP-LC3 se cultivaron en el mismo medio. La línea celular de osteosarcoma U2OS (ATCC) y U2OS GFP-LC3 [10] se cultivaron en DMEM y FBS al 10%. MCF10A (ATCC) se cultivó en DMEM /F12 y suero de caballo al 5% con 20 ng /ml de EGF, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 100 ng de toxina /ml cólera, y 10 mg /ml de insulina. Se generaron líneas celulares estables GFP-LC3 como se describe en [10]. Las líneas celulares fueron validados por STR huella de ADN utilizando el kit AmpFℓSTR Identifiler de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems cat 4322288). Los perfiles STR se compararon con las huellas dactilares ATCC conocidos (ATCC.org), a la línea celular de base de datos de autenticación integrado Molecular (CLIMA) versión 0.1.200808 [14] y de la base de datos de huellas dactilares MD Anderson. Imatinib, una especie de regalo del Dr. S. Kondo en el MD Anderson Cancer Center, y bafilomicina A1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se disolvieron en DMSO. Brefeldina A (Sigma-Aldrich) y rapamicina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) se disolvió en metanol.
Pantallas de siRNA
pantalla para moduladores de la autofagia Accell siRNA.
MDA-MB-231, las células U2OS, y SKOV3 transfectadas de forma estable con GFP-LC3 se sembraron en placas de 96 pocillos a 2500 células /pocillo para las células MDA-MB-231 y SKOV3 o 1000 células /pocillo para las células U2OS. Después de 24 h medio se cambió a medio Accell que contenía 0,05% de SFB (80 l /pocillo) (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Accell siRNAs (G-201000 humano RNAi Global, Lot 08103, en placas de 96 pocillos) se disolvieron en 10 l de tampón 1x siRNA y se incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 30 min. Accell medios de comunicación (200 l) que contiene 0,05% de FBS se añadió a cada pocillo y se mezcló pipeteando cinco veces. Se añadieron los siRNAs disueltos (20 l) a cada pocillo para conseguir una concentración final de 1 siRNA M (100 l /pocillo). Se incubaron las células con siRNA durante 48 h. Los fármacos se diluyeron a diez veces la concentración de trabajo y se añaden a cada pocillo como se ha indicado (11 l /pocillo) para hacer concentraciones finales de 2 mM 2-desoxi-D-glucosa (2DG), 100 nM de rapamicina, y 10 M imatinib. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 45 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS, los núcleos teñidos con Hoechst 33342 durante 5 min y se lavaron una vez más con PBS, y 250 l de PBS se añadió a las células. formación autofagosoma se determinó mediante un analizador Cell Imaging 1000 Celular y sistema de análisis (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey). Los resultados se muestran como% autofagia. Además, todos los genes se combinan entre sí para el cálculo de puntuación z. Z-score de gen
I
se calculó a partir como
z
i
= (
x
i Network -
μ
) /
σ
, donde,
x
i
es la autofagia% desde la pantalla de la autofagia, y
μ
y
σ ¿Cuáles son la media y la desviaciones estándar en base a todos los genes presentes en la pantalla.
pantalla de siRNA para moduladores de viabilidad.
se utiliza una biblioteca de 779 piscinas dispuestos siRNA (http://www.dharmacon.com/product /Productlandingtemplate.aspx?id=225&tab=1 para la lista de genes) que cubre la kinome humana y los genes relacionados con la quinasa (librería Dharmacon SmartPool, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) en el MDA-MB-231, MDA-MB-468 , líneas celulares SKOV3 y OVCAR3. Cada grupo de siRNAs sintéticos estaba vestida de formato de 96 pocillos, y transfecciones se realizaron en placas por triplicado utilizando 25 nM de ARNsi entregado por DharmaFECT I (Dharmacon). Seis réplicas de RISC-libre no director siRNA y siRNA contra PLK (control tóxico) en cada placa proporcionan controles negativos y positivos para la muerte celular en toda la pantalla, respectivamente. Brevemente, DharmaFECT I se aplicó a 0,15 l /pocillo de 25 nM entrega siRNA en un modo de transfección inversa. Después de tres días, la viabilidad celular se ensayó con una célula Titer azul viabilidad celular de ensayo (Promega, Madison, WI). Cell Titer reactivo azul (resazurina 5 l /pocillo) se incluyó en el último 3 h de incubación. Las células viables reducen la resazurina en resorufina, que es altamente fluorescente. La intensidad de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 604 nm. sesgo Interplate fue eliminado por la normalización de los valores de viabilidad celular por el centrado media y a escala para tener igualdad de la varianza y después se convierte en las correspondientes puntuaciones z para cada uno de los tres experimentos replicados. La puntuación z del gen
'i' en
para la replicación
de búsqueda: 'j' en placa de
'k'
se calculó como
z
ij
= (
x
ij CD -
μ
jk
) /
σ
jk
, donde,
x
ij
es el valor de la intensidad en bruto, y
μ
jk
y
σ
jk ¿Cuáles son la media y la desviación estándar de las intensidades para todas las muestras en la placa de
k
, respectivamente. A continuación, la mediana de puntuación z se calcula para todas las repeticiones de cada gen en cada línea celular, y siRNAs con
valores z
i
ave
inferior a -2 fueron considerados como éxitos significativamente inhibitorios " "para la línea celular correspondiente
la transfección de siRNA y reactivos
siRNAs. (Dharmacon; Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) se transfectaron con DharmaFECT I (Dharmacon) o Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen), utilizando protocolos de los fabricantes. Las secuencias de los siRNAs son los siguientes: nontargeting control de RISC libre siRNA (D-001220-01-05), COPA (L-011835-00), COPB1 (L-017940-01), COPB2 (L-019847-00 ), COPG1 (L-019138-00), COPG2 (L-019988-01), EPOC (L-013063-01), COPE (L-017632-01), COPZ1 (L-020293-01), Plk1 (M -003,290-01) BIP1 (L-008198-00-0005), ATG5 (L-004374-00), y Atg12 (L-010212-00).
Microscopía Electrónica de Transmisión
muestras de células se fijaron con una solución que contiene 3% de glutaraldehído, más 2% de paraformaldehído en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 h. Después de la fijación, las muestras se lavaron y se trataron con 0,1% de cacodilato filtrada Millipore tamponada ácido tánico, se fijaron posteriormente con 1% de tetróxido de osmio tamponada durante 30 min, y se tiñeron en bloque con acetato de uranilo filtrada Millipore 1%. Las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se infiltró, y se embebieron en medio LX-112. Las muestras se polimerizan en un horno de 70 ° C durante 2 días. Ultrathin secciones fueron cortadas en un microtomo Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo en un centro de tinción Leica EM, y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEM 1010 (JEOL, EE.UU., Inc., Peabody, MA ) a un voltaje de aceleración de 80 kV. Las imágenes digitales se obtuvieron usando un sistema AMT Imaging (Técnicas avanzadas de microscopía Corp., Danvers, MA).
Se realizó SDS-PAGE y Western Blot análisis
Western Blot como se describe anteriormente [12]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: p62 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), LC3 (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO), IRE1α, bip, calnexina, ATG5, Atg12, pSer473AKT, pThr308AKT, AKT, pSer235 /236 S6, pSer65 4EBP y 4EBP (todos de Cell Signaling Technology, Beverly, MA), COPB1 (Fisher Scientific, Lafayette, CO) y β-actina (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos contra la COPA, COPB2, EPOC, COPG1, y COPG2 fueron una especie de regalo del Dr. Wieland (Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania). La cuantificación de la intensidad de la banda se llevó a cabo por el software de gel de UN-SCAN-It (versión 5.1, Seda Scientific Corporation) y se expresa en términos de aumento del pliegue de control.
confocal y microscopía de fluorescencia
La microscopía confocal .
inmunotinción para LAMP2 (BD Biosciences; 1/200) o COPB2 (1/1000) se realizó usando procedimientos estándar. Para el ensayo de tfLC3, las células que expresaban transitoriamente tfLC3 [15] se cultivaron durante la noche y se trató como se describe. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 4 '6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Para Anexina-V-Alexa 568 de la tinción, las células que expresan de forma estable GFP-LC3 se cultivaron en portaobjetos de cámara de ocho pocillos (BD Biosciences) y se trató como se indica. Anexina-V-Alexa 568 (Roche, Mannheim, Alemania) tinción se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las imágenes fueron tomadas en un microscopio Olympus FV1000 con una lente 100X (N. A. 1.30). Las imágenes fueron adquiridas y procesadas mediante el software ImageJ Fluoview y
La microscopia de fluorescencia
imágenes de inmunofluorescencia para p62 (BD Biosciences; 1/200).. Fueron adquiridos utilizando un microscopio Nikon Eclipse TE200-E y software de imágenes IPLab (BioVision Technologies, Exton, PA).
celda de cristal violeta Viabilidad ensayo
ensayo de viabilidad (violeta cristal) se llevó a cabo utilizando procedimientos estándar.
ensayo clonogénico resiembra
las células fueron cultivadas en diversas condiciones y todas las células se recogieron por tripsinización y se sembraron a 100-400 células por pocillo en placas de cultivo tisular de seis pocillos. Las colonias se hicieron crecer durante 11-14 días en medio de crecimiento completo y se tiñeron con solución de cristal violeta 0,5% (80% dH
2O, 20% de metanol, 0,5% de cristal violeta). Fotos de las colonias fueron tomadas con el sistema de imagen FluorChemE (Cell Biosciences, Inc.), y se analizó el número de colonias usando AlphaVIEW SA (versión 3.2.3.0; Cell Biosciences, Inc.). El experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces.
Análisis RPPA
Los procedimientos se llevaron a cabo RPPA para la tinción de anticuerpos y detección de señal como se describe anteriormente [10], [16].
Oncomine Base de datos
el Bittner multicancer conjunto de datos está disponible en el dominio público en http://www.oncomine.org/main/index.jsp [17], y por lo tanto no se requería la aprobación del IRB. Los tejidos con expresión diferencial de los miembros del complejo COPI (P≤10
-6) fueron seleccionados.
Estadísticas y Análisis de Datos
Se analizaron todos los datos utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Las comparaciones entre los dos grupos fueron evaluados estadísticamente mediante una prueba t pareada de dos colas. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Para comparar los niveles de expresión de genes en grupos benignas y cancerosas, se utilizó la prueba t de Student para dos muestras. Se utilizó el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para el análisis de supervivencia univariante. Los puntos de corte de los altos y bajos de expresión de los grupos fueron optimizados para conseguir el más bajo valor de p. Todos los análisis estadísticos, gráficos de caja y gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se realizaron utilizando el software R (http://www.r-project.org).
Resultados
Proyección siRNA Identifica coatomer Complejo miembros como moduladores de la viabilidad y la autofagia
para identificar a los jugadores moleculares novedosas en el control de la muerte celular por autofagia, hemos realizado dos tipos de interferencia de ARN (RNAi), pantallas para encontrar genes que cuando derribados como resultado tanto disminución de la viabilidad celular y la formación de autofagosomas. En primer lugar, exhibió la kinome humano porque quinasas y los genes relacionados con la quinasa son los principales reguladores de las funciones celulares complejas, tales como la autofagia. siRNAs fueron transfectadas en cuatro líneas celulares diferentes: dos líneas celulares de cáncer de ovario (SKOV3 [
HER2
amplificada;
CDKN2A
,
PIK3CA
, y
TP53
los mutantes] y OVCAR3 [
PIK3R1
y
TP53
los mutantes]) y dos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231 [
BRAF
,
CDKN2A
,
KRAS
, y
TP53
los mutantes] y MDA-MB-468 [
EGFR
amplificada;
PTEN
,
RB1
,
TP53
, y
SMAD4
los mutantes]) con diferentes antecedentes genéticos. En total, se identificaron 67 genes, el 9% de la kinome, que cuando derribado redujo significativamente la viabilidad celular (z-score inferior a -2) (Tabla S1). De estos 67 éxitos positivos, desmontables de 12 genes reduce la viabilidad de al menos dos de las líneas celulares ensayadas. Estos genes fueron
AKT2
,
chek1
,
COPB2
,
PRKAR2B, rps6ka2
y
WEE1 gratis (en tres de cada cuatro líneas celulares) y
AVPR1B
,
CNKSR1
,
DGUOK, INSRR
,
JAK2, TAF1L
(en dos de las cuatro líneas celulares).
Para identificar los genes también participan en la regulación de la autofagia en las células cancerosas, se realizó una pequeña biblioteca RNAi basada en imágenes (Accell; Tabla S2) pantalla con la formación autofagosoma como criterio de valoración. líneas de células cancerosas MDA-MB-231, SKOV3 y U2OS fueron transfectadas de forma estable con la proteína fluorescente verde-proteína asociada a microtúbulos 1 cadena ligera 3 (GFP-LC3) reportera vector [18], [19]. Debido a LC3 se degrada durante las etapas finales de la autofagia productivo [20], se utilizó la acumulación persistente de LC3 en vesículas puntiformes como un marcador para la autofagia deteriorada o abortada. La rapamicina, 2-desoxi-D-glucosa (2DG), y imatinib eran controles positivos para la formación de autophagosome. No director siRNAs revueltos, utilizadas como controles negativos, no dio lugar a la autofagia (Fig. S1 A-C). En todas las líneas celulares ensayadas, se observó que el agotamiento de la proteína coatomer complejo subunidad beta 1 (COPB1) causó una acumulación de las motas LC3-positivas que son indicativos de la autofagia (Figura S1 A-C;. Tabla S3), lo que indica que la autofagia mecanismo se conserva entre diferentes linajes tumorales. En conclusión, el uso de pantallas de siRNA se identificaron COPB2 y COPB1 como moduladores de la viabilidad celular, respectivamente, y la autofagia.
coatomer proteínas modulan la viabilidad celular
COPB1 y COPB2, componentes del complejo COPI, fueron considerados como candidatos atractivos para estudio adicional basado en el impacto significativo en las células cancerosas tanto en la viabilidad celular y la formación de autofagosoma (Tabla S1 y S3, Fig. S1). En una pantalla secundaria, se validó y se analizaron los efectos sobre el crecimiento celular y la formación autofagosoma después de eliminar a los miembros independientes de este complejo en tres líneas celulares de cáncer (MDA-MB-231, MDA-MB-468 y SKOV3). Como se muestra en la Figura S2, siRNAs reducción de expresión de varios componentes COPI. De acuerdo con nuestros hallazgos de la pantalla siRNA, el agotamiento de la COPA, COPB1, COPB2, COPG1, EPOC y COPZ1 reduce el crecimiento celular (Fig. 1 A y C). Por el contrario, la viabilidad celular no se vio afectada en las células tratadas con no director siRNA (Fig. 1A y B) o sólo afectada ligeramente en MCF10A, una línea celular de mama normal-como, después de COPB2 desmontables (Fig. S9B). La adición del inhibidor de pan-caspasa zVAD no rescatar a la muerte celular (datos no mostrados) lo que indica que la muerte celular era independiente de caspasas. Para confirmar que el cáncer de células se comprometen a la muerte cuando se deteriora COPI, se determinó la recuperación clonogénico después de 72 h de tratamiento siRNA en MDA-MB-231 (Fig. 1D) y U2OS (Fig. 1E) las células cancerosas. En ambas líneas celulares, la eficiencia de resiembra no se redujeron después de la depleción COPG2 comparación con el control, lo que confirma nuestros resultados. Por el contrario, la reducción de la expresión de la COPA o COPB2 abolió casi por completo la recuperación clonogénico (Fig. 1D y E), que es consistente con nuestros resultados de viabilidad (Fig. 1A). Notablemente, la eficiencia replating no se redujo en las células U2OS tratadas con rapamicina (Fig. 1F), consistente con la capacidad de la rapamicina para inducir la autofagia productiva como un proceso supervivencia. La muerte celular después de COPI caída fue aún más visualizada y confirmada mediante tinción con anexina V (Fig. S3). En conjunto, estos resultados muestran que la mayoría de los componentes COPI modulan la viabilidad de las células cancerosas.
células (A) MDA-MB-231, MDA-MB-468, y SKOV3 fueron transfectadas con siRNA dirigidos a miembros independientes de COPI. Desmontables de Plk1 se utilizó como control positivo para la muerte celular. El número de células después de 72 h se midió por tinción con cristal violeta. (B, C) representativos de microscopía de luz imágenes de células MDA-MB-231 tratadas con RF o siRNA contra COPB2. (D) Clonigénicas eficiencia replating de MDA-MB-231 células de cáncer de mama después de la disminución de la expresión de la COPA, COPB2 o COPG2 en comparación con las células tratadas con RISC (SR). Los resultados son la media ± desviación estándar de triplicados de dos experimentos independientes. Clonogénico eficiencia replating de las células cancerosas U2OS después del tratamiento con ARNsi contra COPB2 o COPG2 (E) o rapamicina (F). Los resultados son la media ± desviación estándar de triplicados de dos experimentos independientes. **, P & lt; 0,01; ***, P. & Lt; 0,001
coatomer proteínas modulan la autofagia
A continuación, hemos probado si el agotamiento de diferentes proteínas complejas independientes COPI autofagia inició, mediante la formación punteada GFP-LC3 como leer. expresión de la COPA, COPB1, COPB2, COPG1, EPOC reducida, y COPZ1 indujo la formación de GFP-LC3 puntiforme en MDA-MB-231, líneas celulares de cáncer de MDA-MB-468 y SKOV3 (Fig. 2A). Estos resultados fueron comparables a las observadas cuando las células se trataron con imatinib, un control positivo para la inducción autophagosome (Fig. 2A-C). formación autofagosoma también se evaluó mediante la conversión de endógeno LC3-I a LC3-II mediante inmunotransferencia porque la cantidad de LC3-II se correlaciona con la cantidad de membranas autofágicas marcado con LC3-II [19]. En consonancia con los datos obtenidos en las células cancerosas que sobreexpresan exógenamente GFP-LC3 (Fig. 2A-C) y con la excepción de COPG2, la reducción de la expresión de las subunidades coatomer conducido a una acumulación de endógeno LC3-II en las células MDA-MB-231 (Fig. 2D). Se encontraron resultados similares en células de cáncer U2OS (Fig. 2E) MDA-MB-468 y. Hemos validado aún más la persistencia del aumento LC3-II tras el agotamiento de COPI por un análisis del curso de tiempo extendido (Fig. 2F). Una reducción de la expresión sostenida de COPI mantiene la expresión LC3-II sin degradación aparente de LC3-II, sugerente de la autofagia alterada. análisis de microscopía electrónica (Fig. 3A, C y E; inserta Fig 3B, D y F.) confirmó la formación y marcado aumento (Fig 3G.) de autofagosomas después de la depleción COPB2 (Fig 3C y D). y tratamiento imatinib (Fig. 3E y F) a nivel ultraestructural por la presencia de orgánulos de membrana doble que contiene contenido citoplásmico no digeridos [18]. En contraste, el control de siRNA (RF) (Fig. 3A y B) no promover la formación de autophagosome. Aunque el aumento de autofagosomas fue similar entre las células MDA-MB-231 tratadas con COPB2 siRNA y imatinib, encontramos que autofagosomas inducidos por COPB2 siRNA fueron significativamente más grandes en comparación con autofagosomas inducidos por imatinib como se evaluó mediante la cuantificación de la zona autophagosomal /citoplasma en electrones microscopía imágenes (Fig. 3H). Esta observación se confirmó además por la determinación del tamaño de GFP-LC3 orgánulos positivos de células MDA-MB-231 tratadas con COPB2 siRNA o ARNsi de control (Fig. S4A). El tamaño de autofagosomas inducidos por siCOPB2 es también mayor que el de autofagosomas hambre inducida (Fig. S4B y S4C). En conjunto, estos resultados indican que los resultados de agotamiento COPI en la acumulación de manchas LC3-positivas en las células cancerosas.
(A) MDA-MB-231, células MDA-MB-468, y de forma estable SKOV3 que sobreexpresan GFP-LC3 eran transfectadas con siRNA dirigidos a miembros independientes de COPI durante 72 h, y la formación de autofagosoma se analizó mediante el analizador de células en el año 1000 el sistema. Imatinib se utilizó como control positivo para la formación de autophagosome. Los resultados son la media ± desviación estándar de los triplicados. se muestra gráfico representativo de dos experimentos independientes. (B, C) Imágenes representativas de microscopía de epifluorescencia (en la celda del analizador 1000) de vesículas GFP-LC3-positivo en el control de las células MDA-MB-231 o después del agotamiento de COPB2. análisis (D) inmunotransferencia de LC3 en las células MDA-MB-231 72 h después de siRNA mediada por el agotamiento de los miembros independientes de COPI. β-actina se utilizó como control de carga. las células (E) MDA-MB-468 y U2OS tratadas con RF o COPB2 siRNA se analizaron para determinar los niveles de proteína de LC3. células (F) MDA-MB-231 fueron transfectadas con siRNA contra COPB2, COPG2 o RISC (SR) y se dejaron crecer durante los tiempos indicados, se lisaron y sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos frente a LC3, COPB2, COPG2 y β-actina. *, Aspecific banda.
(A-F) electrónica de transmisión análisis de microscopía de la autofagia en las células MDA-MB-231 tratadas con RF o siRNA contra COPB2 durante 48 h o imatinib durante 24 h. puntas de flechas blancas indican autofagosomas se muestran en los paneles C y E. (B, D, F) Las imágenes de alta magnificación de áreas enmarcadas. Las barras de escala indican 2 micras (A, C, E) y 500 nm (B, D, F). (G) Número de autofagosomas por célula se calculó contando el número de orgánulos dobles de membrana en 20 o más células individuales. (H) La zona de Porcentaje autophagosomal se calculó por área cubierta por orgánulos dobles de membrana en el citoplasma de 20 o más células aisladas de medición. **, P & lt; 0,01; ****, P & lt; 0,0001,
La interrupción de COPI induce la autofagia abortiva
Debido a que el agotamiento de los miembros del complejo COPI causó la muerte celular y la formación autofagosoma, nos dispusimos a probar si abortiva autofagia era el mecanismo. Para diferenciar entre la autofagia abortiva y productivo analizamos p62, que se degrada preferentemente durante la autofagia, pero los niveles se mantienen constantes o aumento en la inducción de la autofagia abortiva [21]. Como se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de diferentes líneas celulares de cáncer (Fig. 4A) y el análisis de inmunofluorescencia en MDA-MB-231 células (Fig. 4B, C), siCOPB2 no redujo los niveles de p62, como era de esperar de la autofagia productivo, pero aumentó los niveles de p62 en comparación con los niveles de control. En contraste, los niveles de p62 se redujo en MCF10A (Fig. S9D), aunque los niveles de proteína COPB2 se redujo significativamente (Fig. S9C). Además, se utilizó bafilomicina A1 (BafA1), un inhibidor-lisosoma específico de degradación de la proteína y las etapas finales del proceso de autofagia para inhibir el flujo de autofagia [18], [22]. tratamiento BafA1 se ha demostrado que aumenta los niveles de LC3-II en las células sometidas a la autofagia productivo, pero tiene un efecto limitado sobre los niveles de LC3-II en las células sometidas a la autofagia abortivo [20]. En MDA MB--231 células, con la eliminación de COPB2, el tratamiento BafA1 no aumentó aún más el nivel II LC3-(Fig. 4D) en contraste con COPG2 agotado o control de las células, lo que indica la degradación alteración del contenido autophagosomal por los lisosomas después de la depleción COPB2 . Se confirmó esta observación en células de cáncer U2OS tratadas con BafA1 o rapamicina (Fig. S5). Deterioro de la degradación del contenido luminal interior del autofagosomas por lisosomas puede resultar de: 1) no autophagosome fusión /lisosoma; 2) la degradación deteriorado; o 3) el reciclado incompleta de los componentes autolysosomal [18], [23]. Para determinar cuál de estas posibilidades era responsable del aumento de LC3-II y p62 en las células con depleción de COPI, analizamos primera fusión de autofagosomas (GFP-LC3) y los lisosomas (LÁMPARA2) después de la caída de COPI en las células MDA-MB-231 establemente transfectadas con GFP-LC3 (Fig. 5A). Confocal análisis reveló colocalización de GFP-LC3 y LÁMPARA2 en las células cancerosas tratadas con siRNA contra COPB2 (Fig. 5A), lo que sugiere la fusión no fue bloqueado por completo por el agotamiento de COPI. Hemos probado aún más el efecto de COPB2 siRNA sobre la degradación autophagosomal usando mRFP-GFP tándem fluorescente etiquetados LC3 (tfLC3; [15]). En las células transfectadas transitoriamente con tfLC3, GFP /RFP puntos lagrimales positivos representan autofagosomas no fusionados a los lisosomas, mientras que los puntos lagrimales RFP-positivo /negativo para GFP representan autolisosomas como GFP se apaga más rápidamente por el bajo pH lisosomal [15]. MDA-MB-231 células transfectadas transitoriamente con tfLC3 mostraron colocalización de la señal de mRFP y GFP después de la depleción COPI o tratamiento BafA1 (Fig. 5B, fila 2 y 3), indicativa de deterioro de la maduración de los autofagosomas. El tratamiento de MDA-MB-231 células con imatinib resultó en puntos lagrimales RFP-positivo /GFP-negativo que representa la presencia de autolisosomas y por lo tanto el flujo autophagic (Fig. 5B, última fila). Se obtuvieron resultados similares en células de cáncer U2OS (Fig. S6). Además, las células COPB2 agotado mostraron grandes LAMP2 orgánulos positivos (Fig. S4D).