Extracto
Los estudios han sugerido que el receptor corepressor nuclear 1 (NCoR1) podría desempeñar un papel importante en los cánceres humanos. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados por el que funciona
in vivo
afectan a la progresión del cáncer no están claras. El presente estudio dilucidado el
in vivo
acciones de NCoR1 en la carcinogénesis utilizando un modelo de ratón (
thrB
PV /PV
ratones) que se desarrolla espontáneamente cáncer de tiroides.
thrB
PV /PV
ratones albergan un mutante dominante negativo del receptor de la hormona tiroidea β (TRβ) (denotado como PV). Hemos adoptado el enfoque de pérdida de la función mediante el cruce de
thrB
PV
ratones con los ratones que expresan una proteína mutante a nivel mundial NCoR1 (NCOR1ΔID) en el que los dominios de interacción del receptor se han modificado de manera que no puede interactuar con la TRβ, o PV, en ratones. Sorprendentemente, la expresión de la proteína de crecimiento NCOR1ΔID reducida tumor de tiroides, la progresión tumoral marcadamente retardada, y la supervivencia prolongada de los
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones. la proliferación celular tumoral fue inhibido por el aumento de la expresión de la ciclina dependiente inhibidor de quinasa 1 (p21
WAF1 /CIP1;
Cdkn1a
), y la apoptosis fue activado por una elevada expresión de pro-apoptótica Bcl-X Asociadas (
Bax
). Otros análisis mostraron que p53 fue reclutado para el sitio de unión de p53 en el promotor proximal de la
Cdkn1a
y el
Bax
gen como un co-represor complejo con PV /NCoR1 /deacetylas- histona 3 (HDAC-3), lo que lleva a la represión de la
Cdkn1a
así como la
Bax
gen de tiroides de
thrB
PV /PV
ratones. En tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, el complejo p53 /PV no podría reclutar NCOR1ΔID y HDAC-3, que lleven a una represión de las ambos genes para inhibir la progresión del cáncer. Los presentes estudios proporcionan evidencia directa de
in vivo Windows que NCoR1 podría funcionar como un oncogén través de la regulación de la transcripción en un modelo de ratón de cáncer de tiroides
Visto:. Fozzatti L, Parque JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Sy (2013) acciones oncogénicas del receptor nuclear Corepressor (NCoR1) en un modelo de ratón de cáncer de tiroides. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10.1371 /journal.pone.0067954
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Marzo, 2013; Aceptado: 23-may de 2013; Publicado: 26 de Junio, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. La presente investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural en el Centro para la Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptores de la hormona tiroidea (TR) son críticos en la mediación de las acciones genómicas de la hormona tiroidea (T3) en el crecimiento, el desarrollo, la diferenciación y el mantenimiento de la homeostasis metabólica. Dos genes, TR α y β, distribuidos en dos cromosomas diferentes, codifican tres isoformas principales TR unión de T3 (α1, β1, y b2). Los estudios que utilizaron ratones modificados genéticamente mostraron que,
in vivo
, TR isoformas tienen funciones comunes, pero también pueden ejercer acciones isoforma dependiente en los tejidos diana [1], [2]. La actividad de transcripción de TR se regula en múltiples niveles. Además de la regulación por parte de T3 y tipos de elementos en los promotores de los genes diana de ADN vinculante, la actividad transcripcional de TR es afinado por una serie de coactivadores nucleares y corepressors [3], [4]. En ausencia de T3, la TR no ligado recluta al receptor corepressor nuclear 1 (NCoR1) y el receptor corepressor nuclear mediador 2 /silenciamiento de los receptores de retinoides y hormonas de la tiroides (NCOR2 /SMRT) para la represión de la transcripción. La unión de T3 conduce a un cambio conformacional en el TR que libera el NCoR1 /NCOR2 complejo y permite la contratación de un complejo coactivador multiproteicos para la activación transcripcional [5].
El papel regulador importante de NCoR1 en las acciones de los receptores es evidente en su interacción con los receptores aberrantes subyacentes enfermedades humanas tales como la resistencia a la hormona tiroidea (RTH) [6], [7] y lipodistrófica grave resistencia a la insulina [8]. RTH es causada por mutaciones en el
THRB
genes [9], [10]. Las mutaciones de los receptores de γ proliferador de peroxisoma activados (
PPAR)
conduce a una grave resistencia a la insulina lipodistrófica [8]. Además, la interacción aberrante de NCoR1 /SMRT con los productos fusionados de genes del receptor de ácido retinoico alfa gen (
RAR) guía o con el gen de la leucemia promielocítica (
PML
) (PML-RAR α) o con el gen de dedo de zinc de leucemia promielocítica (
PLZF
) (PLZF-RAR-α) da como resultado el bloqueo de la diferenciación mieloide [11]. La participación de NCoR1 en otros cánceres humanos tales como cánceres de mama y de vejiga se demostró mediante una estrecha asociación de NCoR1 expresión anormal con el desarrollo del cáncer [12], [13], [14], [15]. Estudios recientes realizados por el Atlas (TCGA) Red de Investigación del Genoma del Cáncer también descubrieron supresión de genes homocigotos de NCoR1 en algunos pacientes con cáncer de colon y el recto adenocarcinoma [16], el adenocarcinoma de próstata [17], el carcinoma de ovario [18] o el carcinoma hepatocelular del hígado (sin publicar-provisional en la base de datos TCGA). Por otra parte, las mutaciones sin sentido y variantes de corte y empalme de
NCoR1
también fueron encontrados en pacientes con cáncer de mama [19]. Si bien estos estudios de asociación plantearon la posibilidad de que NCoR1 podría actuar para afectar a la progresión del cáncer, la evidencia directa de sus funciones en la carcinogénesis
in vivo
aún no existe.
La disponibilidad de un modelo de ratón que desarrolla de forma espontánea cáncer folicular de tiroides metastásico (FTC) nos proporcionó una poderosa herramienta para evaluar el papel de NCoR1 en el desarrollo y progresión del cáncer. El
thrB
PV /PV
ratón alberga una mutación negativa dominante knockin, conocido como PV, en el
thrB
gen locus [20]. La mutación PV fue identificado en un paciente que sufre de resistencia a la hormona tiroidea [21]. Como
thrB
PV /PV
edad ratones, la tiroides a someterse a cambios patológicos de la hiperplasia a la invasión capsular y vascular, anaplasia, y eventual metástasis en el pulmón [22]. El patológica progresión, la ruta y la frecuencia de metástasis en
thrB
PV /PV
ratones son similares a la de la FTC humano. Los análisis moleculares extensos de vías de señalización alteradas muestran que, como se encuentra en FTC humana,
thrB
PV /PV
ratones muestran las vías de señalización aberrantes que incluyen la activación constitutiva de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] y la integrina-Src señalización MAPK [25] y la acumulación aberrante de los tumores hipofisarios oncogénico transformación de la proteína del gen (PTTG) [26], [27] y ß-catenina [28]. Por lo tanto, el
thrB
PV /PV
modelo de ratón recapitula fielmente las aberraciones moleculares que se encuentran en el cáncer de tiroides humana y es de hecho un modelo preclínico de ratón de la FTC.
En el presente estudio, hemos adoptado el método de pérdida de la función mediante el cruce de
thrB
PV Vaya con los ratones que expresan una proteína mutante a nivel mundial NCoR1 (NCOR1ΔID). En esta proteína mutante NCOR1ΔID, dos dominios de interacción del receptor de terminal más aminoácidos denominan RID 3 y rio2, están desaparecidos. Este mutante no puede asociarse con TR, como RID3 es absolutamente necesario para la interacción NCoR1-TR [29], [30], [31]. En consonancia, también mostramos que la proteína mutante NCOR1ΔID no puede interactuar con TRβPV
in vivo
[32]. La falta de interacción de TRβPV con NCOR1ΔID se traduce en la mejora de los síntomas de la resistencia a la hormona tiroidea en
thrB
PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, indicativo de que NCoR1 regula la acción dominante negativo de mutantes TRβ
in vivo
[32].
los estudios actuales muestran que la expresión de NCOR1ΔID en la tiroides de
thrB
PV /PV
ratones inhibió el crecimiento del tumor, prolongada la supervivencia y la progresión del cáncer retardada. proliferación de células tumorales se inhibe por el aumento de la expresión de la ciclina dependiente de inhibidor de quinasa 1 (p21 /WAF1;
CDKN1A
), y la apoptosis fue inducida por la expresión activada de la proteína X asociada a Bcl-2 (
BAX
). Tanto el
Cdkn1a
y el
BAX
genes son los genes diana directos del supresor de tumores, p53. análisis molecular detallado mostró que la falta de dominio de interacción receptor en NCOR1ΔID condujo a una incapacidad del complejo p53 /PV para reclutar la desacetilasa-3 complejo represor NCoR1 /histona a los promotores de estos genes diana, lo que resulta en aumento de la represión de estos genes a inhibir la progresión del cáncer. El presente estudio proporciona evidencia directa
in vivo
para demostrar que el NCoR1 podría funcionar como un oncogén través de la regulación de la transcripción en la carcinogénesis de tiroides en un modelo de ratón.
Materiales y Métodos
las cepas de ratón
el estudio en animales se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Nacional Cancer Institute Cuidado y uso de animales. Los ratones que albergaban el
thrB
PV
gen (
thrB
PV
ratones) se prepararon y se genotipo como se describe anteriormente [20].
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
animales fueron criados por primera cruzar
thrB
+ /+ NCoR1
ΔID /+
ratones [29] con
thrB
PV /+ ratones
y luego cruzando
thrB
PV /+ NCoR1
ΔID /ΔID
ratones con
thrB
PV /+ NCoR1
ΔID /ΔID
ratones [32]. Los ratones con diferentes genotipos utilizados en el presente estudio fueron varias generaciones entrecruzados, y sus compañeros de camada con un fondo genético similar se utilizó en todos los experimentos. Los ratones se controlaron hasta que se convirtieron moribundo y por lo tanto la eutanasia. Tiroides y otros tejidos se obtuvieron de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones y
thrB
PVPVNcor1
ΔID /ΔID
ratones para pesar, histológicos análisis y estudios moleculares y bioquímicos.
Aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
ARN total fue extraído de tiroides de ratones utilizando TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó con un kit Quantitect SYBR Green RT-PCR (QIAGEN, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y usando un termociclador LightCycler (Roche Diagnostics). El ARN total (200 ng) se utilizó en las determinaciones de RT-PCR como se describe anteriormente [33]. Los cebadores específicos fueron los siguientes:
mp21
adelante, 5'-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 'y revertir, 5'-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3';
mBax
hacia adelante, '-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3' y revertir, 5'-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3 ';
MP53
adelante, 5'-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 'y revertir, 5'-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3'.
Análisis de transferencia Western y co-inmunoprecipitación
Los extractos nucleares de tiroides se prepararon como se describe anteriormente [32]. Las muestras de proteínas (25 g) se analizaron por Western blot como se describió anteriormente [28]. Anti-fosforilada la proteína retinoblastoma (pRb) (Ser780,#9307) y PUMA (# 7467) eran de Tecnologías de Señalización Celular (Beverly, MA) (1:500 dilución), anti-ciclina D1 (sc-450), BAX (sc -7480), Rb (sc-50), p21 (sc-6246) y p27 (sc-1641) anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y se usó a una dilución 1:200. Los anticuerpos anti-p53 (OP03) eran de Calbiochem (1:500 dilución). intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software NIH Image (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH).
Para la co-inmunoprecipitación que muestra la interacción física de p53 con PV, 0,5 mg de extractos totales de la tiroides se incubó durante la noche primera con conejo anti-TR (Código 600-401-A96, Rockland) en Tris-solución salina tamponada-0,6% NP-40 con inhibidores de la proteasa (Roche) a 4 ° C. Las muestras se mezclaron entonces con 20 l de proteína A-agarosa (Roche) a 4 ° C durante 2 horas, y perlas se lavaron cinco veces con inhibidores de la proteasa TBS-0,6% NP-40 que contienen. Las proteínas unidas se analizaron mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpos para p53 (OP03; Millipore, Inc.,) a una dilución 1:500 y anti-NCoR1 (PHQQ; 2 mg /ml). [32]
histológico análisis
glándula tiroides, pulmón y corazón fueron disecados, fijado en el 10% formalina tamponada neutra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y posteriormente se incluyó en parafina. Secciones de espesor 5-m se prepararon y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Para cada animal, se examinaron secciones al azar individuales a través de la tiroides, a través del pulmón, y a través del corazón.
Inmunohistoquímica
IHC se realizó como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [25]. secciones de tiroides de parafina fijadas con formalina se desparafinaron, se rehidrataron, se calentó a 98 ° C en anhídrido citracónico 0,05%, pH 7,4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), durante 1 hora y después se bloquearon durante 1 hora en 2% de cabra normal suero a temperatura ambiente. Después del lavado en solución salina tamponada con fosfato, los portaobjetos se incubaron a 4 ° C durante la noche con Ki-67 anticuerpo primario (dilución 1:300; Thermo Scientific, Fremont, CA;#RB-9043-P0). Después del lavado, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo durante 1 hora a temperatura ambiente y se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato. Los portaobjetos se incubaron a continuación en 3,3'-diaminobencideno (kit de sustrato DAB para la peroxidasa; Vector Laboratories, Burlingame, CA; SK-4100), y después de la tinción de desarrollo, que se contratiñeron en hematoxilina de Gill, se enjuaga y se montaron en Permount (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). El índice de proliferación se calculó como el porcentaje de núcleos Ki-67-positivas para el número total de núcleos en la sección de la tiroides. Contando se ha realizado mediante Institutos Nacionales de la Salud de la imagen del software (NIH) (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD).
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Ensayo
El chip de ensayo era llevado a cabo utilizando ADN de la cromatina preparado a partir de los tumores tiroideos (50 mg /ensayo) de
Thrb1
PV /PVNcor1
+ /+ ratones y
Thrb1
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, como se describe anteriormente [34]. El ADN inmunoprecipitado en 50 l de TE y PCR cuantitativa se realizó con 7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real (Applied Biosystems) usando el kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR (204.154, QIAGEN). El enriquecimiento en señales se calculó como señales de inmunoprecipitación frente a entradas de lisado de células enteras. Los cambios veces de tumores de tiroides de
Thrb1
PV /PVNcor1
+ /+
o
Thrb1
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
chip se normalizaron control negativo (IgG de ratón). Los cebadores utilizados fueron chip
Cdkn1a
hacia adelante, 5'-TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 '; y revertir, 5'-TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 'y
Bax
hacia adelante, 5'-GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3'; y revertir, 5'-GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 '.
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± SEM. Las diferencias entre grupos se examinaron para determinar la significación estadística utilizando
t de Student
con el uso de GraphPad Prism 4.0a (GraphPad Software); p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Resultados
NCOR1ΔID prolonga la supervivencia y retrasos tiroides carcinogénesis de
thrB
PV /PV ratones
. han demostrado previamente que
thrB
PV /PV
ratones tienen una alta mortalidad causada por la Comisión Federal de Comercio [22]. Hicimos un seguimiento de los efectos de la expresión de NCOR1ΔID sobre la carcinogénesis tiroidea mediante la comparación de la supervivencia de la primera
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones con el de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
. Los ratones se controlaron hasta que se convirtieron moribunda con signos de tumores palpables, pérdida rápida de peso, posturas encorvadas, y dificultad para respirar. muestra la Figura 1A que
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones sobrevivieron significativamente mayor (p & lt; 0,01; 50% la edad de supervivencia: 11,3 meses, n = 29) que los
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(50% de supervivencia edad: 9,3 meses, n = 58) durante el período de observación de 15 meses. Figura 1B muestra que la expresión de NCOR1ΔID condujo a una significativa reducción del 35% en peso de la tiroides en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (conjunto de datos 2 vs 1; p & lt; 0,0001 ).
(a) de Kaplan-Meier de supervivencia para
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones de hasta 15 meses de edad.
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID gratis (n = 29) sobrevivieron significativamente más tiempo que
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
ratones (n = 58) (
p Hotel & lt; 0,0001). (B) Tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones a las edades de 5 -15 meses se diseccionaron y se pesaron. Los datos se presentan como las proporciones de peso de la tiroides a peso corporal. Las diferencias entre los pesos de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones fueron significativas (
p Hotel & lt; 0,0001), según lo determinado por el estudiante de
t-test
análisis
el efecto de NCOR1ΔID en la progresión patológica se determinó mediante análisis histopatológico según.
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones envejecidos. La figura 2A muestra características patológicas representativas de la tiroides y los pulmones de la 3 a 15 meses de edad
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (columnas izquierda y derecha, respectivamente). En las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
a la edad de 7 meses, la invasión vascular avanzada y anaplasia focal se observaron frecuentemente (flechas en la figura 2Aa y 2AC, respectivamente) . Por otra parte, las metástasis pulmonares (Figura 2Ae, flechas) fueron frecuentes en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
. En
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, sin embargo, la invasión vascular se observa raramente (Figura 2Ab), pero sin anaplasia detectable (Figura 2Ad) y una marcada reducción en la ocurrencia de metástasis de pulmón (Figura 2AF). Estas observaciones pathohistological se resumen en la Figura 2B. A la edad más joven de 3-5 meses, se observó una menor incidencia de invasión capsular (~ 20%) para
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que para
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 2BA), pero no se detectó una frecuencia de ocurrencia similar de invasión capsular, tanto para los ratones mutantes en la edad avanzada (& gt; 7 meses de edad). No hay invasión, anaplasia, o metástasis pulmonares vasculares se encuentran en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 2BB, c, yd) a edades más tempranas de 3-5 meses. Para los ratones de más edad de 7 meses, la frecuencia de ocurrencia de invasión vascular, la anaplasia, y la metástasis de pulmón fueron 80%, 15% y 60%, respectivamente, para
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
ratones (Figura 2BB, c, y d). Sin embargo, la presencia de invasión vascular y metástasis de pulmón eran 14% y 10%, respectivamente, para
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, sin ocurrencia de anaplasia. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la expresión de NCOR1ΔID retrasa la progresión del cáncer de tiroides y bloqueó la pérdida de diferenciación (anaplasia) en
thrB
/PV
ratones.
(A) Hematoxilina y PV eosina (H & amp; e) tinción de secciones de la tiroides (superior e intermedio filas) y las secciones de pulmón (fila inferior) de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ gratis (a, c, y e ) y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID gratis (b, d, f) y ratones. Los cortes histológicos de los tejidos de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
ratones mostraron evidencia de (a) invasión vascular en la tiroides (flecha), (c) anaplasia en la tiroides (flechas), y lesiones (e) metastásicas en pulmón (flechas). Secciones de tiroides y los pulmones de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mostraron vasos sanguíneos (b) sin invasión vascular (flecha), (d) sin anaplasia, y (f) de pulmón sin lesiones metastásicas. (B) Comparación de la dependiente de la edad porcentaje aparición de invasión capsular (a), la invasión vascular (b), anaplasia (c), y metástasis de pulmón (d). Los datos se expresan como el porcentaje de ocurrencia de ratones mutantes totales examinados. El símbolo "#" indica 0% ocurrencia.
NCOR1ΔID reduce el crecimiento de la tiroides por inhibición de la proliferación celular en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
Ratones
El hecho de que el crecimiento de la tiroides se redujo en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 1B) nos llevó a preguntar si proliferación de células tumorales de tiroides se inhibió. Por lo tanto, hemos examinado la abundancia de proteínas del marcador de proliferación nuclear, Ki-67, mediante análisis inmunohistoquímico. Figura 3A.I-A y B muestran ejemplos representativos de tinción nuclear intensa en tiroides de dos
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
. Por el contrario, un menor número de núcleos se tiñeron con inmuno-Ki-67 en el marcador de proliferación tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 3A.Ic y -d, n = 2 ). Las células con Ki-67 núcleos inmuno-manchado fueron contadas y los datos cuantitativos se muestran en la Figura 3A.II. El análisis cuantitativo muestra que el número de células de la tiroides con Ki-67 núcleos teñidos fue 50% menor en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
, indican una disminución en la proliferación celular en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones.
( AI) dos microfotografías representativas de manchado Ki-67 en las secciones de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ gratis (a y B representan dos diferentes ratones) y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (C y d representan dos diferentes ratones). En las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, un menor número de células de la tiroides se tiñeron con Ki-67 que en tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(flechas). (Parte II) Positivamente células nucleares de Ki-67-manchado de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
y
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
La ratones se contaron y se expresaron como porcentaje del total de células. El porcentaje de células proliferantes fue significativamente menor en las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
que
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
ratones. (BI) extractos de proteínas nucleares se prepararon a partir de los tumores tiroideos
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ gratis (carriles 1 y 2) o
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID gratis (carriles 3 y 4) los ratones. El análisis de Western blot de la ciclina D1, Rb fosforilada, el total de Rb, p21, p27 y están tan marcada, y la actina (panel f) se utilizó como control de carga. (B.II) La cuantificación de la intensidad de la banda que se muestran en (b.I). Las abundancias de proteínas de la ciclina D1 y Rb fosforilada fueron más bajos en las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, mientras que la abundancia de proteína de p21 y p27 fueron mayores en las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones.
Este hallazgo fue apoyado además por el análisis bioquímico en el que la abundancia de proteínas de un regulador clave del ciclo celular , ciclina D1, fue notablemente menor en las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 3B.I, panel a, carriles 3 y 4 amp;) que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(carriles 1 y 2 amp;). Por otra parte, la reducción de la ciclina D1 dio lugar a una abundancia de proteínas inferior de la proteína retinoblastoma fosforilada (PRB) (Figura 3B.I, el panel b, comparar los carriles 1 & amp; 2 con los carriles 3 y amp; 4) sin cambiar los niveles totales de proteína Rb (panel do). La reducción en el Rb fosforilado impidió la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S. En consonancia, la abundancia de proteína de p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina y p27 (Figura 3B.I, paneles D y E, respectivamente) también fue menor en las tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(comparar carriles 3-4 a los carriles 1-2). Los datos cuantitativos de las intensidades de la banda se muestran en la Figura 3B.II. En conjunto, estos resultados indican que la expresión de la NCOR1ΔID condujo a la inhibición de la proliferación de células tumorales, en parte, por el retraso de la progresión del ciclo celular G1-S.
si la apoptosis también contribuyó a la disminución de crecimiento del tumor de tiroides muestra en la figura 1B también se evaluó mediante el examen de los reguladores clave de la apoptosis. La abundancia de proteínas de asociados-Bcl-2 proteína X (BAX), que promueve la apoptosis, fue mayor en tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 4AA, comparar los carriles 3 y 4 amp; con 1 & amp; 2). PUMA, que es un (Bcl-2 dominio de homología 3) -sólo proteínas BH3 que induce la apoptosis a través de la vía de las mitocondrias, también fue mayor en tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 4AB, comparar los carriles 3 y 4 amp; con 1 & amp; 2). Las intensidades de las bandas cuantitativos se muestran en la Figura 4Ba, lo que indica un aumento de 2 veces en BAX y PUMA nivel de proteínas. Además, el aumento de la caspasa escindido 3 (Figura 4A, panel B, carriles 3 y amp; 4) y la disminución de poli ADP-ribosa polimerasa total (PARP), pero el aumento de PARP escindida (panel c, banda superior y banda inferior, respectivamente, en los carriles 3 & amp; 4) en
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones en comparación con
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones fueron
indicativo de la actividad apoptótica elevados en las células tumorales de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (ver también los datos cuantitativos en la figura 4BB). Estos resultados indican que, además de retardar la progresión del ciclo celular G1-S, el aumento de la actividad apoptótica en tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones también contribuyó a un menor crecimiento de la tiroides.
(A) los extractos de proteínas nucleares se prepararon a partir de los tumores tiroideos
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ gratis (carriles 1 y 2) o
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID gratis (carriles 3 y 4) los ratones. Se demuestran los análisis de Western blot de BAX (panel a), PUMA (panel b), caspasa 3 escindida (Panel C), PARP escindida y PARP (panel d), y el control de carga de actina (panel E). (B) Cuantificación de las intensidades de las bandas que se muestran en (A). * P & lt; 0,05 abundancia de proteínas de BAX y PUMA (panel a), se escindió de la caspasa 3 y PARP escindida (panel b) fue significativamente mayor y PARP totales (panel b) fue menor en el tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones.
inhibición del crecimiento tumoral mediante activación de la vía de señalización de p53 en el tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones
los hallazgos de que la abundancia de proteína de p21 y BAX se alteraron como se muestra arriba nos llevó a examinar si su expresión a nivel de mRNA también se vio afectada. De hecho, encontramos que
Cdkn1a gratis (
p21
WAF1
) los niveles de mRNA fueron significativamente mayores en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 5A, barra 2 vs 1 bar). Del mismo modo,
Bax
nivel de mRNA fue mayor en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones que en
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 5B, barra de bar de 4 vs 3). Estos dos genes están regulados directamente por p53 [35], [36]. Por lo tanto, la hipótesis de que alterar la actividad de p53 en tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones daría lugar a la activación de la transcripción de la
Cdkn1a
y
Bax
genes. En primer lugar, examinamos si la expresión del ARNm de p53 y la proteína se vio alterada, cambiando de este modo la actividad en el tiroides de
thrB PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones. Hemos encontrado que la expresión de NCOR1ΔID no tuvo efectos de la expresión de p53 en el nivel de ARNm (barras 5 y 6, Figura 5A). Además, se encontró que la abundancia de proteína de p53 era igualmente baja en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 5B, panel superior, carriles 3 y 4, respectivamente). Por lo tanto, cuanto mayor sea
Cdkn1a
y
Bax
niveles de ARNm no se debieron a la activación de la actividad de transcripción p53 por la expresión de la proteína p53 elevada. Debido a que ha sido previamente demostrado que de tipo salvaje TRs interactuar físicamente con p53 y negativamente regulan la actividad transcripcional de p53 [37], [38], el próximo exploraron la posibilidad de que la actividad de p53 puede ser alterado a través de la interacción con PV en tiroides ratones de mutantes. análisis Co-inmunoprecipitación mostraron que PV se asoció con p53 en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
ratones (Figura 5B, panel superior, carril 1). PV también se asoció de manera similar con p53 en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (Figura 5B, panel superior, carril 2). Es importante destacar que, co-inmunoprecipitación mostró además que la energía fotovoltaica también se asoció con NCoR1 en los extractos nucleares de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(Figura 5B, panel inferior, carril 1) , pero no interactuar con NCOR1ΔID en los extractos nucleares de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (carril 2). Los carriles 3 y 4 muestran que una cantidad similar de NCoR1 y NCOR1ΔID, respectivamente, se detectó por Western blot directa (Figura 5B, panel inferior). Estos datos indican que la energía fotovoltaica interactuó con p53 y NCoR1 en un complejo ternario (p53 /PV /NCoR1) en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
, pero sólo una forma p53 complejo /PV en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones.
(a) Activado expresión de la
Cdkn1a Opiniones y los
Bax
genes en la tiroides de
thrB PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se llevó a cabo como se describe en Métodos y Materiales. Cada muestra de tiroides se llevó a cabo por triplicado con el número total de ratones de 3-5. Las diferencias en la expresión son significativas en la expresión de los
Cdkn1a gratis (carriles 1 y 2) y el
genes Bax
(carriles 3 y 4) entre
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (carriles 5 y 6). (B) Co-inmunoprecipitación de PV con p53 y NCoR1 en la tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+ ratones
(carril 1), pero no con NCOR1ΔID en extractos de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones (carril 2). Los carriles 3 y 4 muestran la banda p53 (panel superior) y NCoR1 y NCOR1ΔID de Western blot directa de los extractos nucleares de tiroides de
thrB
PV /PVNcor1
+ /+
y
thrB
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ratones, respectivamente. (C y D) La contratación de la energía fotovoltaica y NCoR1 a los sitios de unión al ADN de p53 /en el promotor de la
Cdkn1a
gen (C) y el
Bax
gen (D). chip de ensayo se llevó a cabo usando IgG (barras 1 y 6) o anti-p53 (barras 2 y 7) o anti-PV (barras 3 y 8) o anti-NCoR1 (barras 4 y 9) o anti-HDAC-3 ( barras 5 y anticuerpos 10) como se describe en
Métodos y materiales
. La unión se expresó como veces de cambios en referencia al control negativo en el que el ratón se utilizó IgG en la inmunoprecipitación * p & lt;. 0,05, y *** p & lt; 0,001. NS: no significativo.
Las conclusiones que
Cdkn1a
y
Bax
ARNm fueron mayores en el tiroides de
thrB
PV /PVNcor1 <