Extracto
Antecedentes
sistema de telómeros /telomerasa ha sido recientemente reconocida como una atractiva objetivo para la terapia contra el cáncer. resultados de inhibición de la telomerasa en la regresión del tumor y el aumento de la sensibilidad a diversos fármacos citotóxicos. Sin embargo, no ha sido plenamente establecido aún si el mediador de estos efectos es la inhibición de la telomerasa
per se
o acortamiento de los telómeros como resultado de la inhibición de la actividad de la telomerasa. Además, las características y los mecanismos de sensibilización a fármacos citotóxicos provocados por la inhibición de la telomerasa no se ha aclarado de manera sistemática.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio se caracterizó la importancia relativa de inhibición de la telomerasa en comparación con acortamiento de los telómeros en las células cancerosas. Sensibilización de las células cancerosas a los fármacos citotóxicos se logró por acortamiento de los telómeros en una forma dependiente de la longitud, y no por la inhibición de la telomerasa
per se
. En nuestro sistema de esta sensibilización se relaciona con el mecanismo de acción del fármaco citotóxico. Además, acortamiento de los telómeros afectó también a otras funciones celulares de cáncer, tales como la migración. acortamiento de los telómeros induce daño en el ADN cuya reparación se vio afectado tras la administración de cisplatino, mientras que la doxorrubicina o vincristina no afectaron a la reparación del ADN. Estos resultados se verificaron también en
in vivo
modelo de ratón. La explicación putativa que subyace al fenotipo inducido por el acortamiento de los telómeros puede estar relacionado con los cambios en la expresión de varios microRNAs desencadenados por acortamiento de los telómeros.
Conclusiones /Importancia
Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que caracterizan el impacto relativo de inhibición de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros en varios aspectos del fenotipo de células cancerosas, especialmente relacionados con la sensibilidad a los fármacos citotóxicos y sus mecanismos putativos. Los cambios de microARN en células de cáncer que son acortamiento de los telómeros son nuevas informaciones. Estos hallazgos pueden facilitar el desarrollo de enfoques basados en los telómeros en el tratamiento del cáncer
Visto:. Uziel O, E Beery, Dronichev V, Samocha K, S Gryaznov, Weiss L, et al. (2010) El acortamiento de los telómeros sensibiliza a las células del cáncer a agentes citotóxicos seleccionados:
in vitro
y
En Vivo
Estudios y supuestos mecanismos. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10.1371 /journal.pone.0009132
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2009; Aceptado: 6 de diciembre de 2009; Publicado: 9 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Uziel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de investigación de Autoridad de investigación del Centro Médico Rabin y una beca de investigación de la Escuela de Medicina Sackler, Universidad de Tel Aviv, Israel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
telómeros humanos están compuestos de repeticiones TTAGGG de cadena simple y los correspondientes dúplex de este hexanucleotide situado en ambos extremos del cromosoma lineal. Junto con su complejo de proteína específica shelterina que proporcionan estabilidad a todo el genoma, enmascarando el cromosoma termina de ser tratado por los mecanismos de reparación del ADN como doble filamento se rompe [1]. Los telómeros incrementalmente erosionan en las células somáticas más en cada ronda de replicación del ADN, hasta que llegan a corta longitud crítica que finalmente inicia un cese del crecimiento celular denomina senescencia celular [2]. Las células cancerosas utilizan la enzima telomerasa para eludir acortamiento de los telómeros, y así lograr el potencial replicativo sin fin. La telomerasa es un complejo de ribonucleoproteína de la transcriptasa inversa única que mantiene un estado estable de la longitud del telómero mediante la síntesis de repeticiones TTAGGG en los extremos de los cromosomas. Es altamente activo en más de 90% de todas las neoplasias malignas, y por lo tanto considerado un sello del cáncer [3]. La telomerasa no se expresa en la mayoría de las células somáticas normales, pero conserva una actividad moderada en las células madre proliferativas y en un grado mayor en células de la línea germinal masculina. Debido a esta especificidad y la esencialidad de la vida útil ilimitada de las células cancerosas, la telomerasa se considera un objetivo contra el cáncer válido y atractivo [4].
De hecho, numerosos estudios han demostrado que los resultados de inhibición de la telomerasa en la apoptosis de las células cancerosas, la contracción de tumores en modelos animales experimentales y una mayor sensibilidad de las células tumorales a diversas modalidades contra el cáncer [5]. Sin embargo, no está claro si estos efectos "beneficiosos biológicamente deseables" son la consecuencia del acortamiento de los telómeros o inhibición de la telomerasa
per se
. Además, no se ha determinado todavía si la mejora de la sensibilidad a los fármacos citotóxicos por la inhibición de la telomerasa /acortamiento de los telómeros es dependiente de la clase de mecanismo o el agente quimioterapéutico.
La mayor parte del punto de datos a un acortamiento de los telómeros por debajo de un límite crítico como el objetivo más importante alcanzado por la inhibición de la telomerasa [6], [7], apoyando la noción de que el logro de significativo acortamiento de los telómeros dará lugar a efectos clínicos contra el cáncer. Sin embargo, varios estudios implican actividades adicionales "extracurriculares" de la telomerasa, que son independientes de la regulación de la longitud del telómero. Por ejemplo, la telomerasa se ha demostrado que poseen propiedades antiapoptóticas [8], [9]. Además, su participación en la respuesta al daño del ADN [10] o la protección del ADN por "tapado" [11] se determinó también. La telomerasa también estaba implicado en el control de la expresión génica con independencia de la longitud del telómero y de la contribución al crecimiento de varios tipos de benignos [12] - [14]. [15], las células malignas y [16]
El objetivo de este estudio era aclarar la importancia de la inhibición de la telomerasa
por
sE frente al efecto de acortamiento de los telómeros en las células cancerosas y para evaluar el efecto de estas perturbaciones de la sensibilidad de las células a diversos fármacos citotóxicos con diferentes mecanismos de acción. Además, el objetivo fue que representa los mecanismos por los cuales las células con acortado la longitud del telómero sensibilidad diferencial exposición a estos fármacos.
Hemos encontrado que la inhibición de la telomerasa
per se
no altera la sensibilidad de varios líneas de células malignas a cualquiera de los fármacos probados. inhibición de la telomerasa a largo plazo que dio como resultado acortamiento de los telómeros sensibiliza las células a cisplatino, un agente de formación de aductos de ADN y no a la doxorrubicina, a doble filamento se rompe agente o a la vincristina, que el modo de acción no es a través de lesión directa del ADN que producen. Estos resultados fueron confirmados en un modelo animal que emplean ratones desnudos con xenoinjertos de células de carcinoma de páncreas que fueron expuestos al inhibidor de la telomerasa y fármacos citotóxicos. Las células con telómeros más cortos adquirieron fenotipo daño en el ADN cuya reparación se vio afectado después de sólo cisplatino y expresaron los genes miARN que están asociados con la detención del crecimiento de células cancerosas. Estas células también presentan la migración más lenta en comparación con el tipo salvaje (WT) homólogos. Sugerimos que acortamiento de los telómeros en las células cancerosas se asocia con cambios en la expresión de los genes miARN y conduce a la alteración de la reparación del ADN tras la exposición a cisplatino en concreto.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
línea de células SK-N-MC (sarcoma de Ewing) fue proporcionado amablemente por el Dr. Gad Lavie (Sheba Medical Center, Ramat-Gan, Israel). Se mantuvieron las células MCF-7 (carcinoma de mama) y K562 (leucemia mieloide crónica), las células en medio RPMI 1640 suplementado con 10 a 15% de suero inactivado por calor de ternera fetal (FCS), glutamina (2 mM), penicilina y estreptomicina (Beit Haemek, Israel ). Los ensayos de proliferación, los análisis de apoptosis y ensayos de actividad de la telomerasa se realizaron en todas las líneas celulares. línea SK-N-MC fue elegido para un análisis más detallado de los diversos mecanismos relacionados con el efecto de inhibición de la telomerasa en la sensibilidad a cisplatino. Las células de control se mantuvieron en cultivo sin inhibidor de la telomerasa, GRN163, en paralelo con las células de telomerasa inhibido.
telomerasa La inhibición
Las células se expusieron dos veces a la semana a GRN163 inhibidor de la telomerasa, la orientación de la región de plantilla de ARN de la subunidad de la telomerasa (hTR). Las células de control se mantuvieron en cultivo sin inhibidor de la telomerasa en paralelo con las células inhibidas. Para el
in vivo
inhibición de la telomerasa, los ratones fueron inyectados con GRN163L, una palmitoil (C16) en lípidos adjunta N3'-P5 'fosforamidato versión de GRN163. Ambos compuestos fueron amablemente proporcionados por Geron Corporation (Menlo Park, CA, EE.UU.)
Tratamiento de Drogas y
in vitro Protocolo experimental
Todas las líneas celulares se expusieron a los siguientes medicamentos durante tres días antes de la proliferación, ciclo celular y la apoptosis análisis: cisplatino, un aductos de ADN que forman fármaco, doxorrubicina, un agente de ruptura de doble hebra y la vincristina, que interfiere con la formación de los microtúbulos del huso, así las paradas de la separación de los cromosomas duplicados y impide la división celular. La concentración de los fármacos se representa en la sección de resultados
Para evaluar el efecto de inhibición de la telomerasa en comparación con acortamiento de los telómeros de la sensibilidad de las células a los fármacos citotóxicos ideamos cuatro condiciones experimentales:. 1. La telomerasa se inhibió en el tres líneas celulares de tres días la creación de células sin actividad telomerasa y los telómeros con intactas (WT). 2. inhibición a largo plazo (de tres a 16 meses), la creación de células sin actividad telomerasa y los telómeros acortados. 3. La retirada del inhibidor de la telomerasa en las células con telómeros acortados, creando células con telómeros más cortos y la actividad de la telomerasa reconstituida. 4. Como control se utilizó células de tipo salvaje intacta. longitud de los telómeros y la IC50 de los tres fármacos citotóxicos se determinaron después de 3 y 16 meses en las tres líneas celulares.
Ensayo de proliferación
Las células adherentes (1 x 10
4
-1 SK-N-MC y MCF-7) se sembraron por cuadruplicado en placas de 24 pocillos. se añadieron a las concentraciones siguientes Varios fármacos de rango: vincristina: 0-100 ng /ml, doxorrubicina: 0-1000 ng /ml y cisplatino: 0-10 g /ml. Después de 3 días, la proliferación se determinó con el ensayo de sulforodamina B [17]. La proliferación de las células K562 no adherentes se determinó por el WST 1-ensayo que sigue a la conversión de la sal de tetrazolio en el tinte de formazán por las enzimas mitocondriales de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania) y como se describe anteriormente [17].
ensayo TRAP
las células (5 × 10
4 /ml) en placas de 24 pocillos y se incubaron en presencia de GRN163 durante 1-3 días. Cada tratamiento se realizó por duplicado. Posteriormente, la medición de la actividad de la telomerasa se realizó mediante el ensayo TRAP basado en PCR, utilizando el TRAP
EZE kit de detección de telomerasa (intergene, NY, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las células se lisaron con tampón de lisis CHAPS enfriado con hielo) durante 30 min a 4 ° C y posteriormente se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. A continuación, se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se determinó por el ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories, CA, EE.UU.). Los extractos de proteína (0.2 g) se sometieron a ensayo para el análisis TRAP. Cada reacción se realizó en una mezcla de reacción que contiene 50 l 10 x tampón TRAP, mezcla de dNTP, cebador TS, TRAP mezcla de cebadores y Taq polimerasa. Las reacciones se realizaron a 30 ° C durante 30 min y luego se sometieron a amplificación por PCR durante 30 ciclos de 94 ° C, 58 ° C y 72 ° C durante 30 s cada uno, y se separaron por electroforesis en 12,5% geles de poliacrilamida (Acryl /Bis 19:01 solución). Los geles se tiñeron con SYBER verde mancha de gel de ácido nucleico (Amresco, Ohio, EE.UU.). Cuantificaciones se realizaron utilizando el software Cantidad-uno para los sistemas de análisis de imágenes de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Israel). Actividad de la telomerasa se calculó según la siguiente fórmula: TPG = [(X-X
0) /C]: [(r-r
0) /Cr * 100], donde TPG se genera el producto total, X significa cada muestra, C representa el control PCR interno 36 pb, r es el control de cuantificación TSR8.
longitud TRF
fragmento de restricción terminal (TRF) de longitud, que corresponde a la longitud del telómero, se midió mediante una técnica de transferencia Southern no radiactivo. Las muestras de ADN fueron extraídos de las células mediante el kit de purificación de ADN genómico (Gentra, Minneapolis, MN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, se digirió durante 16 horas por
HinfIII
y
RSAI
y separados en 0 · 8% geles de agarosa. Después de la transferencia de carga positiva membrana de nylon, las muestras se hibridaron con la sonda marcada con digoxigenina (TTAGGG)
4 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) durante 16 a 18 h. Las membranas se expusieron a películas de quimioluminiscencia y minúsculas, y las longitudes medias de TRF se calcularon mediante el sistema de imágenes Versa Doc, utilizando un software Cantidad (Bio-Rad Laboratories).
Los análisis de los MIR Firma
aislamiento de ARN.
ARN se aisló utilizando el kit comercial EZ-RNA II (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas. En general, las células después de los tratamientos pertinentes se lisaron en tampón de lisis del kit y se almacenaron a -70 ° C antes de la extracción de ARN que estaba hecho a todas las células a la vez, antes de la hibridación con las matrices de miARN.
MicroARN microarrays.
microarrays
microARN encargo se han descrito anteriormente [18]. En pocas palabras, ~900 sondas de oligonucleótidos de ADN que representan microARN (Sanger versión de la base 10 y microRNAs adicionales previstos y validados por Rosetta Genomics) fueron vistos por triplicado en microarrays diapositivas recubiertos (Nexterion® Slide E. Schott, Mainz, Alemania). Cada muestra de ARN (15 g de ARN total) se marcó por la ligadura de una ARN-enlazador, p-RCRU-Cy /tinte (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 o Cy5) al extremo 3 '. Los portaobjetos se incubaron con el ARN marcado durante 12-16 horas a 42 ° C y después se lavó dos veces. Las matrices fueron escaneadas a una resolución de 10 micras y las imágenes fueron analizados utilizando el software SpotReader (Niles Científico Portola Valley, CA). Hay dos tipos de controles positivos fueron incluidos en el diseño experimental: (i) pequeños RNAs sintéticos se enriquecieron en cada muestra de ARN antes de su etiquetado para verificar la eficiencia de etiquetado y (ii) sondas para abundantes pequeños RNAs fueron vistos para validar la calidad del ARN. microarrays puntos se combinaron y se normalizaron las señales como se describe anteriormente [18]
análisis
Datos
Los datos incluyeron dos muestras:.. las células SK-N-MC con telómeros intactas y SK-N-MC células con telómeros acortados. Un total de 170 sondas de microARN tenía una señal que pasa el umbral mínimo de 300 en al menos una de las muestras. Para cada una de esas moléculas microARN se calculó el cambio de señal veces entre las muestras con telómeros más cortos y la muestra con telómeros intactas.
Análisis del Ciclo Celular y Apoptosis
Las células (0.7-1 × 10
4 ml
-1) se cultivaron durante 3 días. Flotante y se combinaron las células adherentes, se lavaron con PBS y los núcleos preparados a partir de 5 × 10
5 a 1 x 10
6 células para el análisis de citometría de flujo utilizando un método de detergente-tripsina seguido de tinción con yoduro de propidio [19]. El contenido de ADN se analizó mediante FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), utilizando el software de análisis del ciclo celular ModFitLT (Verity Software House Inc., Topsham, ME, EE.UU.). La apoptosis se evaluó mediante análisis de FACS mediante el cual se definieron las células en la etapa de pre-G1 del ciclo celular, apoptosis.
Detección de γH2AX Focos
Las células se sembraron en portaobjetos de cubierta y se expone a la fármacos para 24h, se fijaron y procesaron como se describe anteriormente [20]. Brevemente, las células se fijaron con 4% paraformaldehído, se lavaron tres veces con PBS, y permeabilizaron con 5% de Triton X por 10 min. Después de tres lavados con PBS, las células fueron bloqueados por 10% de suero normal de burro y 1% de BSA, se lavaron de nuevo con PBS y se incubaron con solución γH2AX anticuerpo (1:350, Upstate Biotechnology, NY, EE.UU.) durante 16 horas a 4 ° C. Se añadió el segundo anticuerpo conjugado CY2 ratón anti (Jackson Immuno Research Laboratories, PA, USA) después de tres lavados con PBS. cubreobjetos fueron teñidas con DAPI y solución de montaje. focos γH2AX se visualizaron bajo el microscopio de fluorescencia (Applied Imaging espectral, Migdal Haemek, Israel). 50 núcleos fueron contados para cada muestra.
El Comet Assay
niveles de daño del ADN en las células de diferente longitud de los telómeros y los daños incurridos después de la exposición a las drogas fueron evaluadas por el ensayo cometa, como se describe [21 ]. Este ensayo sigue el nivel fragilidad del ADN mediante la evaluación de la migración de fragmentos de ADN (productos de pausas individuales y /o de doble cadena) desde el núcleo de núcleo para formar la forma cometa cuando se expone al campo electroforético. Después de la tinción con bromuro de etidio, la extensión de la cometa se puede supervisar y cuantificado. Básicamente, la suspensión de células se mezcló con 0,65% de agarosa bajo punto de fusión y se extendió sobre un portaobjetos de microscopio Star-heladas, pre-recubierto con 0,65% de agarosa de fusión normal. Una tercera capa que contiene 0,65% de agarosa de bajo punto de fusión se colocó en la parte superior y luego se lisaron las células mediante la inmersión de los portaobjetos durante la noche en una solución de lisis recién preparado (2,5 M NaCl, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, 1% de Triton X-100 , 10% de DMSO, pH 10,0) a 4 ° C. Después de la lisis, los portaobjetos se lavaron tres veces en agua fría y se colocan en un aparato de electroforesis en gel horizontal que contiene tampón de electroforesis recién preparada (EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH = 13,0) durante 20 min para permitir la anulación de ADN. a continuación, La electroforesis se llevó a cabo a 20 V y a una corriente de arranque de 300 mA durante 20 min a 4 ° C. A partir de entonces, los portaobjetos se neutralizaron con tres lavados de 0,4 M Tris, pH = 7,5, deshidratados con etanol y se seca. Los portaobjetos se tiñeron con una solución de 20 mg /ml de bromuro de etidio y se observan bajo una iluminación fluorescente utilizando filtros de excitación de 530-550 nm y filtro de barrera de 590 nm (cubo T-MNG, Olympus, Alemania). Todas las etapas se llevaron a cabo en la oscuridad para evitar daños en el ADN adicional. Para evaluar los parámetros de cometas, los portaobjetos se examinaron en el uso de software de análisis de imágenes en paralelo Viscomet. Un total de 150 células elegidas al azar de diapositivas fueron examinados por triplicado para cada muestra (50 células por diapositiva). Análisis de imágenes se realizó a 200 × magnificación. Las imágenes de células se proyectan en una alta resolución Heper-HAD ™ (Sony, Japón) cámara CCD (8 bits [APPLITEC, Israel, LIS-700]) y analizados con el software de análisis de imágenes Viscomet utilizando el capturador de fotogramas Delta MV (Matriz Vision , Alemania). daño en el ADN se midió usando los siguientes parámetros: medida cometa (la distancia desde el borde de ataque cabeza al borde de salida de la cola), el ADN porcentaje cola (porcentaje de ADN en la cola), y la cola medida momento (longitud X de ADN porcentaje cola cola ). Las láminas fueron codificados y un solo investigador analizó todas las diapositivas para minimizar la variación de puntuación
Ensayos de Migración
La migración de las células se evaluó mediante dos ensayos:. El ensayo de cicatrización de la herida y un ensayo de cámara de Boyden modificada (transwell ensayo).
La herida ensayo de curación se llevó a cabo de acuerdo con ref [22]. Las células se sembraron a una densidad de 0,2 × 10
6 células /pocillo en placas de cultivo de seis pocillos y se dejó formar una monocapa confluente. La capa de células entonces se raspó con una punta de pipeta P200 para crear una herida de la anchura de aproximadamente 1 mm. Las imágenes de las heridas fueron capturados a
t = 0
y 24 horas a 40 × magnificación y el área de la herida se determinó usando el Scion Image para Windows de software alfa 4.0.3.2. La capacidad de las células para cerrar la herida, es decir, su motilidad, se evaluó mediante la determinación de la zona de curado. El porcentaje del área cicatrizada se calculó de la siguiente manera: (área de la herida a
t = área
0-herida a
t
= 22) /área de la herida a
t =
0) × 100. Las placas fueron marcados para asegurar coherente documentación fotográfica.
La cámara de Boyden modificada se llevó a cabo como se describe anteriormente [23]. Las células se sembraron por triplicado en filtros de policarbonato con 8 micras poros situados en el compartimiento superior de 24 pocillos (Costar Transwell cámaras, Cambridge, Mass, USA). La superficie inferior de las cámaras transwell se recubrió con fibronectina (5 mg /filtro). El medio de cultivo se añadió al compartimento inferior. Las células se dejaron migrar durante 18 horas a 37 ° C y los filtros se fijaron con metanol y se tiñeron con tinción de Giemsa. Las células de la superficie superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón. Finalmente, las células que han migrado al lado inferior del filtro se fotografiaron y se contaron bajo un microscopio.
Animales
hembra atímicos o macho BALB /c
nu /nu
ratones, 5-6 semanas de edad, se adquirieron de Harlan Ltd. (Jerusalem, Israel). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en jaulas superiores se filtra y se alimentaron con una dieta regular. Todos los procedimientos se llevaron a cabo utilizando las instalaciones y los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Hebrea de Hadassah.
, humano y murino modelo de xenoinjerto
células CRL 1867 (carcinoma de páncreas humano) se cosecharon por tripsinización de cultivos confluentes, se lavaron, y se resuspendieron a 1,0 x 10
8 células /ml en medio de crecimiento. Los ratones fueron inoculados con CRL 1687 células en medio 100 ul bajo la piel dorsal un día después de la irradiación de todo el cuerpo en 400 cGy, entregado por un acelerador lineal (Varian Climac 6 ×) a una fuente a distancia de la piel de 80 cm, y una tasa de dosis de 170 cGy /min. Los ratones se trataron con 30 mg /kg i.p. GRN 163L 3 veces por semana durante varias semanas, comenzando un día después de la inyección del tumor. El grupo de control fue inyectado con PBS (0,2 ml i.p.). El crecimiento tumoral se monitorizó cada 6-8 días mediante mediciones de la pinza de dos diámetros perpendiculares de xenoinjertos (D
1, el diámetro mayor y D
2, el diámetro más pequeño). El volumen del tumor se midió utilizando la fórmula: pi /6 (D
1 × D
2), y se expresa como volumen tumoral media ± SE (en mm
3). En 41-55 días después de la inyección de células, en el momento de la matanza, los tumores fueron extirpados libre de tejido conectivo, ponderan y la mitad de ellos se congelaron en nitrógeno líquido. La otra mitad se utiliza para la determinación de la longitud de los telómeros y los parámetros patológicos.
Histología
Al final de los experimentos, se sacrificaron los ratones y se extirpó el tumor, el páncreas y el tejido pulmonar. Los tejidos se fijaron en formalina al 10%, se incluyeron en parafina, se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se evaluaron mediante microscopía óptica.
Resultados
In Vitro
Estudios
inhibición de la telomerasa con GRN163 acorta los telómeros.
la administración de GRN163 como resultado una inhibición del 70-90% de la telomerasa (Fig. 1a). Esta inhibición se mantuvo hasta 72 horas y mediciones repetidas a lo largo de los 16 meses del experimento verificó la inhibición continua de la telomerasa en este rango (no se muestra). En todas las líneas celulares de los telómeros se acortaron en una gama de 20 a 30% y 40% después de 3 y 16 meses, respectivamente (Fig. 1 B).
a. SK-N-MC, MCF-7 y K562 fueron expuestos a 5 uM de GRN163. La actividad telomerasa se evaluó mediante el ensayo TRAP después de 24 horas. las células no tratadas de control C-, M- desajuste no específica oligo revueltos, I-telomerasa inhibidor GRN163. R8- control de TRAP estándar, control negativo N- sin extractos celulares, IC- control interno de PCR. El grado de inhibición de la telomerasa se denota en porcentajes por debajo de los carriles. segundo. células SK-N-MC se expusieron continuamente a 5μM de GRN163. longitud de los telómeros se midió mediante transferencia de Southern. las células no tratadas de control C-, Ia- longitud de los telómeros de las células expuestas al inhibidor de la telomerasa durante tres meses, Ib- longitud de los telómeros de las células expuestas al inhibidor de la telomerasa durante 16 meses, M- marcador de tamaño molecular. La longitud del telómero se denota por debajo de cada carril, y el porcentaje de acortamiento de los telómeros se muestra también. do. La presentación gráfica de la magnitud del acortamiento de los telómeros después de la exposición de las células SK-N-MC a GRN163 por 1 año, medida por Southern blot.
acortamiento de los telómeros, pero ninguna inhibición de la telomerasa
per se
sensibiliza a las células específicamente a cisplatino.
Como se muestra en la Fig. 2 y en la Tabla 1 telómero acortamiento aumentó la sensibilidad de las tres líneas celulares a cisplatino en una forma dependiente de la longitud. inhibición de la telomerasa
per se
no tuvo ningún efecto independiente sobre la sensibilidad de las células cisplatino. El IC
50 de cisplatino disminuyó de 0.13μg /ml a 0.07μg /ml después de 16 meses. El acortamiento de los telómeros no afectó significativamente la sensibilidad de las células a la doxorrubicina y vincristina. La Tabla 1 resume estos resultados y la Fig. La figura 2 muestra en detalle los cambios en la sensibilidad de las células SK-N-MC a cisplatino. Puesto que todas las líneas de células comportaron de manera similar a este respecto, se seleccionaron las células SK-N-MC como un modelo para la caracterización adicional de los mecanismos subyacentes a la acortamiento de los telómeros sensibilización inducida de las células cancerosas a la quimioterapia y de la sensibilidad diferencial a cisplatino.
a. Proliferación de células con telómeros acortados expuesto a cisplatino. células SK-N-MC se expusieron continuamente a GRN163. La sensibilidad de las células a cisplatino se estimó después de tres meses y 16 de inhibición de la telomerasa. Los números indican la IC
50 del fármaco en estos puntos de tiempo (después de 22% y 40% de reducción en la longitud del telómero). valor de p se refiere a la diferencia entre el TE y cortos tel-16 meses. segundo. el estado del ciclo celular de las células SK-N-MC con telómeros acortados expuestos a 0.13μg /ml cisplatino. células SK-N-MC con telómeros acortados fueron expuestos a cisplatino y el estado del ciclo celular se evaluó por FACS. + O - se refiere a la exposición a cisplatino. C. El índice apoptótico de las células SK-N-MC con telómeros acortados expuestos a cisplatino. Las mismas células fueron analizadas por FACS para su índice apoptótico, como se representa por su estado preG1. Los números indican el LD
50 de cisplatino en las células con telómeros acortados o intactas.
acortamiento de los telómeros no afecta al estado del ciclo celular después de la exposición a fármacos citotóxicos.
acortamiento de los telómeros no afectó el estado del ciclo celular de las células (barras a y C en la Fig. 2b). La exposición de las células a cisplatino resultó en disminución de G0 /G1 y el aumento de las etapas G2 /M del ciclo celular. Estos cambios no se vieron afectados por el acortamiento de los telómeros (fig. 2b). También, acortamiento de los telómeros hizo aumentar la tasa de apoptosis de las células debido a la quimioterapia (Fig. 2c).
acortamiento de los telómeros más lenta la migración de células cancerosas.
Desde
in vitro
migración de las células de cáncer se considera una representación válida de su potencial metastásico, se evaluó el efecto de acortamiento de los telómeros en esta función también. La migración se evaluó por transwell membrana (cámara Boyden) (Fig. 3a, b) y la cicatrización de la herida (Fig. 3c, d) ensayos. Como se muestra en la Fig. 3, en el ensayo de membrana Transwell las células con telómeros acortados emigraron significativamente más lento que las células de control. El ensayo de cicatrización de la herida también demostró tendencia a la migración más lenta, pero los resultados no alcanzaron significación estadística.
La migración de las células con telómeros acortados fue evaluado por el transwell y los ensayos de cicatrización de la herida. a. El ensayo de membrana Transwell. Se dejó que las células con telómeros acortados intactas o migrar a través de una membrana durante 16 horas, Gimza tiñeron y se contaron. Una imagen representativa se muestra. segundo. demostración gráfica de los conteos de células promedio de cuatro experimentos independientes. do. La herida ensayo de curación. Las células con telómeros acortados se sembraron en placas de Petri, y el cultivo se "rayado" y siguieron durante 24 horas. Se realizaron mediciones promedio de los huecos libres de células. Se muestra un ejemplo representativo. re. demostración gráfica de los conteos de células promedio de cuatro experimentos independientes.
Se realizaron los estudios posteriores con el fin de dilucidar los posibles mecanismos subyacentes a los cambios fenotípicos inducidos por el acortamiento de los telómeros.
acortamiento de los telómeros se asocia con un aumento de daño del ADN y alteración de la capacidad de reparación del ADN según se evaluó mediante el ensayo de cometa. Cisplatino deteriora aún más la reparación del ADN en las células con telómeros acortados.
Los telómeros acortamiento puede aumentar la respuesta al daño del ADN debido a la pérdida de su función protectora. Para evaluar el nivel del daño en el ADN en las células con telómeros más cortos, se empleó el ensayo cometa. Como se muestra en la Fig. 4a, el acortamiento de los telómeros b se asoció con daño del ADN en las células. Tail parámetro momento medida (que refleja la cola de ADN porcentaje X longitud de la cola, mientras que la longitud de la cola es la distancia en micras del centro de la cabeza a la punta de la cola) era 30% mayor en las células con telómeros más cortos. Evaluación de todos los demás parámetros de ensayo cometa reveló resultados similares, y la intensidad del cometa total aumentó en aproximadamente un 16% en estas células.
a. El principio del ensayo cometa. Células núcleos fueron expuestos a electroforesis y se tiñeron con bromuro de etidio. ADN roto migra fuera de los núcleos y forma la cometa. Se muestran tres grados de daño en el ADN: los núcleos de control con el ADN intacto (que representan el daño del ADN en las células con telómeros intactas,#1), el estado intermedio en las células con ADN parcialmente rota (que representa las células con acortamiento de los telómeros leve,#2) y células con acortado telómeros que albergan dañan el ADN roto (en representación de las células con telómeros acortados,#3). segundo. La cuantificación de la extensión de la condición de daño en el ADN de las células con telómeros acortados, lleva a cabo mediante el cribado de 50 imágenes por muestra en cuádruples. En el momento de la cola parámetro medida izquierda, en las intensidades totales de cometas de derecha. do. La cuantificación de la extensión de la capacidad de las células para reparar el daño del ADN aplicado por doxorrubicina (panel derecho) o cisplatino (panel izquierdo) de 2 y 4 horas daño inducido poste de drogas. El ensayo se realizó mediante el cribado de 50 imágenes por muestra en cuádruples. El estado de daño del ADN se determinó mediante el cálculo del momento de la cola medida.
Para entender por qué las células con telómeros más cortos son más sensibles a cisplatino que a doxorubicina, las células fueron expuestas a estos fármacos durante una hora, seguido de cambiando el medio a medio sin drogas. los niveles de daño del ADN se evaluaron los 2 y 4 horas después de la exposición al fármaco usando el ensayo de cometa. Como se muestra en la Fig. 4c, ambos fármacos inducida por daño en el ADN, pero las células con telómeros acortados fallaron para reparar el daño del ADN causado por cisplatino, mientras que el daño inducido por doxorrubicina fue reparado de manera similar por las células con telómeros ambos intactas y acortados.
acortamiento de los telómeros está asociada con la formación de focos de daño inducido por los telómeros (TIF) cuya reparación se ve afectada en las células con telómeros acortados. a. segundo. do. Higo.