Extracto
Antecedentes
activina receptor 2 (
ACVR2
) es comúnmente mutado en microsatélites (MSI) cánceres de colon inestables, lo que lleva a la pérdida de la proteína, la interrupción de señalización, y tumores más grandes. Aquí, hemos examinado la interrupción de los cánceres de colon microsatélites estables (MSS) de señalización activina.
Métodos
Cincuenta y un cáncer de colon del SMS basados en la población fueron evaluados para ACVR1, ACVR2 y proteínas pSmad2. porciones de mutación propensos consenso de
ACVR2
fueron secuenciados en los cánceres primarios y todos los exones en líneas celulares de cáncer de colon. Se evaluó la pérdida de heterocigosidad (LOH) para
ACVR2
y
ACVR1
, y
ACVR2
promotor de la metilación mediante secuenciación y la inestabilidad cromosómica fenotipo-PCR específica de metilación y el bisulfito (CIN) a través de análisis de LOH fluorescente de 3 marcadores duplicados.
ACVR2
la metilación del promotor y de expresión ACVR2 fueron evaluados en líneas celulares de cáncer de colon a través de qPCR y borrones IP-occidentales. se determinó Re-expresión de ACVR2 después de desmetilación con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza). Otros 26 casos adicionales de cáncer de colon del SMS se evaluó la pérdida de ACVR2 y su mecanismo, y la pérdida de todos los cánceres ACVR2 probados en correlación con criterios clínico-patológicos.
Resultados
De los 51 tumores de colon del SMS, 7 (14% ) perdido ACVR2, 2 (4%) ACVR1, y 5 (10%) de expresión pSmad2. Sin somática
se detectaron mutaciones ACVR2
. La pérdida de expresión ACVR2 se asoció con LOH en
ACVR2
(p & lt; 0,001) y
ACVR2
hipermetilación del promotor (p & lt; 0,05).
ACVR2
LOH, pero no la hipermetilación del promotor, en correlación con el estado de la NIC. En líneas celulares de cáncer de colon con totalmente metilado
ACVR2
promotor, pérdida de
ACVR2
la expresión del ARNm y la proteína fue restaurado con el tratamiento con 5-Aza. La pérdida de ACVR2 se asoció con un aumento en el volumen del cáncer de colon primario (p & lt; 0,05).
Conclusiones
Sólo un pequeño porcentaje de los cánceres de colon del SMS perder expresión de los miembros de señalización activina. ACVR2 pérdida se produce a través de la LOH y
ACVR2
hipermetilación del promotor, revelando mecanismos distintos para ACVR2 inactivación de ambos subtipos de MSI y SMS de cáncer de colon
Visto:. Jung B, Gómez J, E Chau, Cabral J, Lee JK, Anselmo A, et al. (2009) activina señalización en microsatélites cánceres de colon estable se ve interrumpida por una combinación de factores genéticos y los mecanismos epigenéticos. PLoS ONE 4 (12): e8308. doi: 10.1371 /journal.pone.0008308
Editor: Irene Oi-Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 18 Junio, 2009; Aceptado: noviembre 20, 2009; Publicado: 14 Diciembre, 2009
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. Apoyado por el Senado Académico de la UCSD BJ, el Servicio de Salud Pública de Estados Unidos DK074019 a BJ; DK067287, el Servicio de Investigación VA, y la Sociedad Americana del Cáncer de Investigación Institucional de Grant#70-002 a J.M.C., y las Enfermedades Digestivas UCSD Centro de Investigación para el Desarrollo (DK080506). La secuenciación del ADN se realizó mediante el recurso compartido de secuenciación de ADN, UCSD Centro de Cáncer, financiado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer del Centro del Cáncer de apoyo Subvención#2 P30 CA023100-23. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cánceres de colon con inestabilidad de microsatélites de alta frecuencia (MSI-H) están asociados con mutaciones en varios genes con codificación de secuencias repetitivas, tales como
factor de crecimiento transformante β del receptor 2 Opiniones y (TGFBR2)
activina de tipo 2 del receptor (ACVR2)
[1] - [3]. microsatélites estables (MSS) cánceres de colon tienen desajuste de reparación del ADN intacto, pero pueden albergar
TGFBR2
mutaciones en el dominio quinasa [4]. Otros componentes de la cascada de señalización canónica TGF, tales como SMAD2 y SMAD4, se inactivan específicamente en una minoría de los cánceres de colon [5] - [7]. inactivación sistemática de la vía de la hermana de TGF, activina, no ha sido completamente aclarada en los cánceres de colon del SMS.
activina es un miembro de la superfamilia de TGF que regula la diferenciación celular en muchos tejidos [8]. De manera similar a TGF, activina utiliza dos receptores de superficie celular, receptor de activina 1 (ACVR1) y activina receptor 2 (ACVR2), seguido por la activación SMAD. Otro receptor de tipo 2, ACVR2B, no puede sustituir a las funciones y la señalización de ACVR2 [9].
ACVR2
se encuentra mutado en la mayoría de MSI-H cáncer colorrectal [10], [ ,,,0],11], principalmente debido a un desplazamiento del marco en la a
8 vías del exón 10. Restauración de la señalización de la activina y la supresión del crecimiento se produce en respuesta a
ACVR2
complementación en
ACVR2
de colon -mutant células del cáncer [12], [13]. Hemos demostrado anteriormente una alta frecuencia de
ACVR2
mutaciones en los cánceres de colon MSI-H, en relación con la pérdida de la expresión de la proteína ACVR2 [2] y la asociación con tumores de colon más grandes y más pobre grado histológico [14]. Además, encontramos un subgrupo de cánceres de colon del SMS que perdió la expresión ACVR2 [2], similar a
TGFBR2
ha encontrado en la pérdida de los cánceres de colon del SMS [4].
En este estudio, hemos explorado la activina señalización interrupción vía y los posibles mecanismos en muestras de cáncer de colon primarios del SMS y células de cáncer de colon. Hemos encontrado que la pérdida de expresión ACVR2 se produce en un subconjunto de tumores MSS, que a menudo se asocia con retenida pSmad2, el siguiente efector aguas abajo de ambos TGF y la señalización de la activina. A diferencia de la de TGFBR2, pérdida ACVR2 en tumores MSS se produce a través de una combinación de LOH en
ACVR2
y distinta
ACVR2
la metilación del promotor, pero no la mutación genética. En líneas celulares de cáncer de colon, los mecanismos para la pérdida ACVR2 también se segregan en función del estado de microsatélites, con líneas de células MSI-H mostrando
ACVR2
mutación del tracto polyadenine y las células de cáncer de colon del SMS que demuestra la hipermetilación del promotor. De esta manera se demuestra que la interrupción de la señalización de la activina se produce en MSI y SMS cánceres de colon por mecanismos distintos, dejando al descubierto la señalización de la activina como un objetivo importante en los dos subtipos genómicos más comunes de cáncer de colon.
Resultados
Los miembros activina vía de señalización son objeto de inactivación en los subgrupos de cánceres primarios de colon SMS
Nuestros datos anteriores sugerían al menos pérdida parcial de la expresión de la proteína ACVR2 en un subconjunto de muestras de cáncer de colon primarios del SMS a pesar de tipo salvaje
ACVR2
tractos polyadenine [2]. Examinamos esta más allá y trató de determinar los patrones de expresión de ambos ACVR2, ACVR1 así como su efector aguas abajo, pSmad2, en 51 diferentes muestras de cáncer de colon primario con antecedentes genómicos microsatélites estables obtenidos a partir de la misma cohorte de colon Carolina del Norte Estudio de Cáncer (NCCCS ) [15], [16]. Mientras que la expresión del receptor ACVR1 se perdió en sólo el 4% (2/51) de los especímenes tumorales del paciente (Figura 1AB, fila superior), la pérdida del receptor primario, ACVR2, se produjo en el 14% (7/51) (Figura 1CD, media fila). Además, la pérdida de expresión pSmad2 aguas abajo de la activación ACVR2 y ACVR1 por activina ocurrió en 10% (5/51) de los casos analizados (Figura 1EF, fila inferior), y se observó comúnmente en los tumores que revelan receptores totalmente expresados (Tabla 1).
El análisis inmunohistoquímico de los cánceres de colon primarios incluidos en parafina expresión de la proteína diana (marrón) evaluados en comparación con el tejido normal adyacente. A y B (fila superior): ACVR1 expresión se pierde en un subgrupo de tumores del SMS. Ejemplo de tumor con la expresión tanto en el tejido normal y de tumor de colon (panel izquierdo) y pérdida selectiva en un subconjunto de tumores, pero no en el tejido de colon normal adyacente (panel derecho). En general, se observó pérdida ACVR1 en 2/51 o el 4% de todos los cánceres de colon del SMS analizados. C y D (fila): expresión ACVR2 se pierde en un subgrupo de tumores del SMS. Se muestran dos ejemplos de pérdida selectiva de ACVR2 en tumor de colon, pero no en el tejido de colon normal (izquierda y derecha). En general, se observó pérdida ACVR2 en 7/51 o el 14% de todos los cánceres de colon del SMS analizados. E y F (fila inferior): expresión pSmad2 se pierde en un subgrupo de tumores del SMS. Ejemplo de expresión tanto en el tejido de colon normal y tejido tumoral de colon (panel izquierdo) y pérdida selectiva en un subconjunto de tumores, pero no normal (panel derecho). En general, se observó pérdida pSmad2 en 5/51 o el 10% de todos los cánceres de colon analizados.
Todos los especímenes con la pérdida de al menos un componente de ruta del receptor de activina revelaron la expresión de ambos total y SMAD2 TGFBR2 (Tabla 1, Figura 2). Estos datos sugieren que la pérdida de proteínas ACVR2 tiene la mayor prevalencia entre los tumores del SMS, seguido por la pérdida pSmad2, y luego por la pérdida ACVR1. ACVR2 la pérdida y la pérdida pSmad2 parecen ocurrir en los subgrupos complementarias, lo que sugiere más de un objetivo para la inactivación de señalización activina en los cánceres de colon del SMS. Por el contrario, todas las muestras de cáncer de colon SMS con pérdida de activina componente de señalización expresaron TGFBR2.
De los 51 cánceres de colon del SMS de la cohorte NCCCS probado para ACVR2 y ACVR1 pérdida, 8 pérdida de cualquiera de los receptores (7 ACVR2 perdido y 2 revelaron perdido ACVR1 con un tumor perder tanto, ver Tabla 1). De los 8, 1 perdieron pSmad2. De los 7 tumores con pérdida ACVR2, 3 revelado LOH y 3 tenido selectiva promotor ACVR2 hipermetilación, mientras que no se encontraron mutaciones en cualquiera de los tres puntos de acceso de dominio quinasa o el tracto polyadenine codificación del exón 10, comúnmente mutado en los tumores de colon MSI. Ninguno de los 2 tumores con pérdida ACVR1 reveló LOH en el
ACVR1
locus. Por el contrario, de los 43 tumores que expresan tanto ACVR2 y ACVR1, 4 o 9% de pérdidas expresión pSmad2, manteniendo al mismo tiempo la expresión total de SMAD2 y TGFBR2, lo que subraya la pérdida de la capacidad de fosforilación SMAD2 como un evento primario adicional para perturbar la señalización de la activina.
LOH, pero no la mutación, se asocia con la pérdida de ACVR2 expresión en primaria MSS del cáncer de colon especímenes
para evaluar si la pérdida de la expresión del receptor se debió a la pérdida de heterocigosidad (LOH), un mecanismo común de genómica supresor de inactivación tumoral en el cáncer de colon del SMS, se ensayó la LOH en el
ACVR2
y
ACVR1
loci de genes. De los 51 tumores MSS ensayadas, 4 reveló pérdida alélica. LOH en
ACVR2
está fuertemente asociada con la pérdida de la expresión de la proteína ACVR2 (p = 0,006, prueba exacta de Fisher) y 3/7 (43%) de los tumores del SMS con la pérdida de la expresión de la proteína ACVR2 también mostraron LOH (Figura 2), en comparación con los tumores que expresan 1/44 ACVR2. Sin LOH fue encontrado en la
ACVR1
locus en cualquiera ACVR1 expresar o tumores que no expresan. Para mayor correlación con la expresión ACVR2 LOH, hemos ampliado el número de tumores de pacientes de 51 a 77 muestras, que revelaron 5 tumores adicionales con pérdida de proteínas ACVR2, con lo que el número total de 12/77 o 16% (Tabla 2). En este grupo ampliado, 6/12 (50%) de los tumores del SMS con pérdida ACVR2 mostraron LOH (Tabla 2).
A continuación, secuenciado el microsatélite de codificación, así como 3 puntos calientes separados en la quinasa dominio de
ACVR2 gratis (similar a las mutaciones dentro correspondiente
TGFBR2 Hoteles en tumores MSS) [4]. Cabe señalar que el exón 10 A
8 vías en
ACVR2
se encuentra en el dominio quinasa de este receptor, y mutaciones de desplazamiento del marco, así como otras mutaciones en el dominio quinasa de la abolición de la capacidad de fosforilación de ACVR2. Sin embargo, no se encontraron mutaciones específicas del tumor correspondientes a la pérdida de expresión de la proteína ACVR2. Estos datos sugieren que otros mecanismos de inactivación juegan un papel en la pérdida de la expresión ACVR2.
ACVR2
hipermetilación del promotor asociado a la pérdida de ACVR2 Expresión en Primaria MSS del cáncer de colon especímenes
para estudiar si los cambios epigenéticos están asociados con la pérdida de la expresión ACVR2, se evaluó si el
ACVR2
promotor fue hypermethylated en el tejido de cáncer de colon en comparación a la normalidad y si es así, si un patrón de metilación específica de
ACVR2
correlacionada con la pérdida de proteínas ACVR2 en muestras de cáncer de colon primarios del SMS. Al principio habíamos dividido el
ACVR2
promotor en tres regiones, la región 1 (142 a -603), la región 2 (-607 a -958), y la región 3 (-958--1,484). Nuestros resultados de la secuenciación de bisulfito mostraron que no había metilación en la región 1 y la metilación mínimo en la región 2, pero los 46 dinucleótidos CpG entre a -958--1484 nucleótidos relativa al sitio de inicio de la transcripción (región 3) (Figura 3A) se metilado en ambas líneas celulares y muestras clínicas (Figura 3B), pero no correspondientes tejido normal adyacente (datos no mostrados). Debido a la dificultad en la amplificación de los amplicones más grandes de ADN de tejidos embebidos en parafina, se realizó la metilación específica de secuenciación de bisulfito de una región ligeramente más pequeño (-603 a -1297 posiciones) de la
ACVR2
promotor en las muestras clínicas.
a) promotor ACVR2 con el mapa de posicionamiento de cebadores MSP B) el uso de un programa de búsqueda de islas CpG, se identificaron las islas CpG en el
ACVR2
promotor en base a los siguientes criterios estrictos: porcentuales ~CG & gt; 55%; observado CpG /espera CpG & gt; 0,65; longitud & gt; 500 pb. Todas las secuencias de dinucleótidos CpG están representados por barras verticales a través de la línea horizontal que representa la secuencia del promotor. Cada círculo en el panel inferior ilustra un sitio CpG individual correspondiente a las barras verticales que aparecen en el panel superior. En base a la secuenciación de bisulfito, cada sitio CpG se obtuvo cuantitativamente como 100% metilados (círculos oscuros), & gt; 50% metilado (círculos grises oscuros), & lt; 50% metilado (círculos grises claros) o no metilados (círculos blancos). Como se ha indicado, 3 de 7 CRC ACVR2-negativas demostraron metilación completa de la región crítica del promotor ACVR2, mientras que ninguno de los tumores que expresan ACVR2 mostró ninguna evidencia de alto grado /metilación completa de promotor ACVR2. Se observó un patrón de metilación similar a la observada en los cánceres de colon ACVR2 negativa en la línea celular de cáncer de colon HT29 MSS con el ADN genómico a partir de HT-29 permite la secuenciación de una región ligeramente más grande de la
ACVR2
promotor. C) Las líneas celulares de cáncer de colon con seis diferentes inestabilidad de microsatélites fondos (véase la Tabla 3) se analizaron para la expresión de proteínas ACVR2 usando técnicas de inmunoprecipitación. Dos líneas celulares, HCT116 (una línea celular de cáncer de colon MSI con mutaciones de cambio de bialélicos en
ACVR2
) y la línea celular de cáncer de colon HT29 MSS (con
ACVR2
la hipermetilación del promotor), pérdida de ACVR2 revelaron expresión de la proteína. D) La pérdida de expresión de la proteína ACVR2 correlacionada con la disminución de la ACVR2 mRNA transcripción a través de PCR cuantitativo en las células HT29 cuando se compara con la línea celular que expresa ACVR2 FET usando GAPDH para la estandarización. Este experimento se realizó tres veces por triplicado, y el gráfico de barras representa un experimento con * indica una diferencia estadísticamente significativa con una p & lt; 0,001. expresión de la proteína E) ACVR2 se restableció después del tratamiento con desmetilación 5'Aza.
En el ACVR2 que no expresan los cánceres primarios de colon desde el tamaño de la muestra original de 51 SMS tumores, cánceres demostró 3/7 metilación completa (100% alelos metilados) dentro de la región 3 de la
ACVR2
promotor, mientras que ninguno de los 13 ACVR2 expresando tejidos de los cánceres primarios de colon ensayó mostró completa
ACVR2
metilación, apoyando un papel causal para metilación y la falta de expresión ACVR2 (p = 0,03, prueba exacta de Fisher) (Tabla 2, Figura 3B). resultados de la secuenciación de bisulfito fueron consistentes con las observaciones MSP (datos no presentados), donde 3/7 CRCs ACVR2-negativo mostró la presencia de alelos metilados específicamente. Aunque los bajos niveles de metilación (& lt; 50% alelos metilados) también se encontraron en 7/13 de los CRCs ACVR2-expresión, ninguno de los CRCs demostró la metilación completa de cualquier dinucleótidos CpG, que era consistente con la activación de la expresión ACVR2 en estos tumores ( Figura 3B).
ACVR2
la hipermetilación del promotor se correlaciona con ACVR2 La transcripción y expresión de proteínas en líneas celulares de cáncer de colon
Para corroborar nuestros resultados de muestras clínicas
in vitro
, se evaluaron los mecanismos de
ACVR2
pérdida de células de cáncer de colon líneas sobre la base de la inestabilidad de microsatélites. Probamos 3 3 líneas celulares de cáncer de colon del SMS para MSI-H y: 1) la mutación en el tracto polyadenine codificación del exón 10 del
ACVR2
, 2)
ACVR2
la hipermetilación del promotor, 3) cuantitativa RT-PCR de
ACVR2
mRNA, y 4) expresión de la proteína ACVR2 por inmunoprecipitación. Como se informó anteriormente [2], [12], la mutación bialélico en el tracto polyadenine de
ACVR2 gratis (A
8 a A
7) en la línea celular de cáncer de colon MSI-H HCT116 causa la pérdida ACVR2 de la proteína (Figura 3C y Tabla 3).
en las líneas celulares de MSI-H SW48 y RKO, la proteína ACVR2 está presente, ya que es en el MSS líneas celulares de cáncer de colon CaCo2 y el FET ( Figura 3C). Tanto RKO y SW48 contienen una mutación heterocigota a
ACVR2
, revelando de tipo salvaje A
8, así como alelos mutantes (Tabla 3). El A
8
ACVR2
alelo permite la expresión de la proteína ACVR2. La línea celular de cáncer de colon HT29 MSS expresa niveles de ARNm y proteínas ACVR2 (Figura 3C, D y E) se redujo, a diferencia de su contraparte CaCo2 SMS y del FET, ninguno de los cuales abrigan ninguna exonic
ACVR2
mutación (datos no presentados ). células HT29 revelaron un distinto
ACVR2
patrón de la hipermetilación del promotor (Figura 3B) en asociación con el ARNm y la pérdida de proteínas, lo que sugiere que este patrón de metilación específico provoca la pérdida de
ACVR2
expresión. La desmetilación de la expresión
ACVR2
promotor con 5-Aza llevó a re-establecido de ACVR2 mRNA y de la proteína (Figura 3D y E). Se realizó una pantalla adicional de líneas celulares de cáncer el 11 de colon, ya sea con MSI (DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174, SNU175, SNU407) los fondos, o SMS (SNU81, SNU503, SW480, y T84) revelan niveles similares de ACVR2 ARNm y HT29 se establece como el único modelo de cáncer de colon observada SMS con la pérdida ACVR2 distinta.
Para correlacionar la expresión ACVR2 con el tamaño del tumor, grado y estadio, hemos analizado el grupo ampliado de 77 tumores, que contenía 12 tumores con pérdida ACVR2 ( Tabla 2). De ellos, 69 tenían datos sobre el género y la raza, 46 en el volumen del tumor, 59 del estadio del tumor, y el 65 de grado (ver Tabla 4) que permite subanálisis. Similar a los cánceres de colon MSI-H [14], la pérdida de expresión ACVR2 correlacionado con los tumores más grandes (p = 0,024), mientras que la etapa no se vio afectada en comparación con los tumores que expresan ACVR2-(Tabla 4). Esto es paralelo a nuestra anterior conclusión de los cánceres de colon MSI-H, donde la pérdida de proteínas ACVR2 se asoció con tumores más grandes y pobremente diferenciados en una moda de la etapa independiente [14].
A continuación, realizó subtipo genómico el análisis de todos ACVR2 no cánceres que expresan y se encontró que la falta de la inestabilidad cromosómica (CIN) fenotipo correlacionada con
ACVR2
la hipermetilación del promotor (Tabla 2), lo que sugiere vías separadas para MSI- /LOH + y MSI- /LOH -. cánceres de colon
en conjunto, estos datos sugieren que los efectos clínico-patológicas de la pérdida de proteínas ACVR2 pueden ser similares en ambos cánceres colorrectales MSI y SMS a pesar de diferentes mecanismos subyacentes de la pérdida, lo que implica la pérdida ACVR2 como un paso importante en la carcinogénesis de colon.
Discusión
La interrupción de la señalización de la activina es común en líneas celulares de cáncer de colon MSI-H a través de mutaciones de
ACVR2
en una de sus extensiones polyadenine [10] , causando la pérdida de la proteína ACVR2 [2]. La pérdida de la expresión de la proteína ACVR2 también se observó en un pequeño subgrupo de cánceres de colon del SMS [2]. A continuación, se evaluó la ocurrencia y el mecanismo de señalización de activina interrumpido en los cánceres de colon del SMS y demostramos que la señalización de activina está destinada a la interrupción en múltiples niveles en los tumores de colon del SMS. Por lo general,
ACVR2
expresión se pierde a través de una combinación de LOH y el silenciamiento epigenético de la
ACVR2
promotor. Estos resultados ponen de relieve la importancia de la señalización de la activina abrogada en la tumorigénesis de colon, ya que se produce la interrupción en ambos subtipos de MSI y SMS de cáncer de colon mediante diferentes mecanismos distintos.
En los cánceres de colon MSI-H, tanto TGF y la activina se abrogan debido a mutaciones de desplazamiento del marco en el receptor de tipo II [2], [17]. La pérdida de estas dos vías de señalización puede ser beneficioso para el crecimiento del tumor [12], [18]. Tanto TGF activina y utilizan las mismas proteínas Smad intracelulares (Smad 2 y 3) para transmitir su señal. Hemos observado previamente más de un 50% de solapamiento entre la
ACVR2
y
TGFBR2
mutaciones en los tumores primarios de colon MSI [2], posiblemente debido a los efectos aditivos en la mediación de la respuesta de crecimiento, que están actualmente bajo investigación .
parece que en los cánceres de colon MSI
ACVR2
mutaciones pueden ocurrir temprano en la tumorigénesis y están asociados con un mayor crecimiento local [14]. En los cánceres de colon del SMS, pérdida de ACVR2 correlaciona con tumores más grandes, en consonancia con la interrupción de la supresión del crecimiento inducida por la activina. El momento de
ACVR2
mutaciones en el cáncer de colon MSI puede ser similar a la de
TGFBR2
en el que las mutaciones del marco de lectura se producen en displasia de alto grado en la interfaz a la malignidad [17].
se demuestra que en los cánceres de colon del SMS al menos tres miembros de la cascada de señalización de la activina, ACVR2, ACVR1, y pSmad2 se interrumpen. Un subconjunto significativo de los tumores de colon muestra una disminución de la SMAD fosforilada con ACVR2 intacto y TGFBR2, lo que indica un evento primario separado aguas abajo de los receptores primarios. Se identificó un caso de pérdida de ACVR1, ACVR2 y pSmad2, que era tinción TGFBR2 positivo (Tabla 2). Esto podría ser debido a la inactivación principal de pSmad2 y orientación separado de los dos receptores de activina, o un IHC TGFBR2 truncada positivo, lo que lleva pérdida pSmad2. El efecto de la pérdida de los múltiples objetivos de la misma cascada de señalización todavía necesita ser cuidadosamente explorado y sugiere distintas funciones de cada miembro.
Hemos detectado LOH en el
ACVR2
locus en el 6% de los SMS tumores de colon, aumentando a 50% en los tumores con pérdida de expresión de la proteína ACVR2. Esta tasa global es ligeramente inferior a la frecuencia de
ACVR2
LOH informó anteriormente en una cohorte con desconocidos
ACVR2
de estado [19], aunque se ha observado previamente frecuencias de cohortes dependiente de expresión que ACVR2 puede ser el escenario o carrera dependiente [14]
.
Nuestro análisis mutacional se centró en puntos de acceso similares a los implicados en la inactivación de la
TGFBR2
inactivación dominio quinasa [4], pero no hemos encontrado las mutaciones asociadas a tumores al secuenciar todos los exones en ACVR2 expresar y líneas celulares de cáncer de colon que no expresa. Es posible que mutaciones fuera de los puntos de acceso pueden contribuir a la pérdida de ACVR2 en muestras de cáncer de colon primarios, aunque la luz de la evidencia de la LOH, así como el silenciamiento epigenético, esto es probable que sea un mecanismo tumorigénico menos importante. Sin embargo, puede jugar un papel en los tres tumores con pérdida de ACVR2 donde encontramos ningún mecanismo genético o epigenético que explica que la pérdida directa.
Este es el primer informe que describe la pérdida ACVR2 en los cánceres de colon del SMS y
ACVR2
hipermetilación del promotor como un mecanismo, y contrasta con los mecanismos de
ACVR2
pérdida en las células de cáncer de colon MSI [12]. En ambos tumores primarios de colon del SMS y en células de cáncer de colon HT29, la región de la hipermetilación del promotor que se asocia con la pérdida de
ACVR2
expresión es entre los nucleótidos -1297 a -958. Entre los genes que son dianas para el silenciamiento epigenético,
hMLH1
es el mejor estudiado para la metilación, y se ha propuesto que la región del promotor adyacente al sitio de inicio de transcripción (TSS) es crítica para el silenciamiento transcripcional de este gen [ ,,,0],20]. Existe una falta de datos similar para la mayoría de los genes, pero
hMLH1
datos región promotora se usa a menudo como un paradigma, y se cree que para la mayoría de los genes, el análisis de una región promotora similares es crítica para correlacionar la metilación del ADN hallazgos con la pérdida de la expresión génica. En este estudio, hemos analizado & gt; 1.500 pb proximal a la SAT, y se encontró una buena correlación entre los
ACVR2
la metilación del promotor (en las regiones -958 a -1297) y la pérdida de la expresión de la proteína por IHC. Nuestros datos sugieren que en lugar de mera proximidad a la SAT, el acceso diferencial a metilación co-activadores o represores en un promotor determina el silenciamiento de genes, y por
ACVR2
una región, se puede producir más de 900 pb de la SAT.
Somos conscientes de que el número total de pacientes con pérdida del SMS ACVR2 que fueron investigados en este estudio no es muy grande, subrayando que este es un evento relativamente poco frecuentes [15]. No teníamos la intención de determinar las frecuencias globales de tales acontecimientos, sino de mostrar que un mecanismo alternativo de la pérdida de proteínas en el cáncer de colon ACVR2 del SMS. De 51 muestras primarias, basados en la población del SMS tumorales, 7 mostraron pérdida de la expresión ACVR2. De acuerdo con los 51 sujetos siendo extraído al azar de la cohorte, entre el 7% y el 21% de los tumores del SMS en la población debe mostrar una pérdida similar de expresión ACVR2 con un 95% de confianza (intervalo de confianza exacto Clopper-Pearson). El aumento del tamaño de la muestra a 77 reveló pérdida de ACVR2 en 12/77 o 16% y una correlación estadísticamente significativa de la pérdida de ACVR2 con el aumento de tamaño del tumor. Además, el análisis subtipo genómico reveló que LOH en
ACVR2
se asoció con el fenotipo CIN, mientras que
ACVR2
hipermetilación correlaciona con el fenotipo CIMP. Si bien estas categorizaciones permiten atribución de pérdida de
ACVR2
expresión a la hipermetilación del promotor y /o inestabilidad cromosómica como un mecanismo en los cánceres del SMS, mecanismos alternativos tales como la modificación y /o microRNAs histona pueden estar en juego, en particular en la LOH cánceres negativos negativo /metilación. Nuestros datos sin embargo, muestran una correlación significativa entre la pérdida de expresión ACVR2 y LOH /silenciamiento epigenético. Por lo tanto, aportar pruebas de la existencia de ninguna inestabilidad cromosómica o modificación epigenética de
ACVR2
en el cáncer de colon e identificamos un modelo celular para el silenciamiento epigenético de
ACVR2
. El impacto clínico completo de estos datos requerirá una confirmación adicional en los futuros estudios con muestras más grandes de pacientes
En conclusión., Pérdida de la expresión ACVR2, ACVR1 y pSmad2 se produce en un subgrupo de tumores del SMS, y la evidencia apoya que este resultado en la supresión de la actividad normal de supresión de crecimiento de la señalización de la activina. Disminución pSmad2 se asocia comúnmente con el tipo salvaje y ACVR2 ACVR1. Mecanismos de
ACVR2
pérdida incluyen LOH en
ACVR2
y
ACVR2
promotor hipermetilación entre los nucleótidos -1297 y -958, que se asocian con fenotipos CIN y CIMP, respectivamente. La pérdida de ACVR2 se asocia con un aumento de tamaño del tumor. Por lo tanto, la señalización de la activina pueden ser inactivados por mecanismos distintivos de MSI y SMS cánceres de colon, lo que sugiere la importancia de esta vía en el control del crecimiento colonocito.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Carolina del Norte hospitales. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras como parte de la fase de aprobación del IRB como parte del Estudio de Cáncer Colorrectal de Carolina del Norte (NCCCS) ver más abajo. Análisis como parte de este estudio fue completamente sin identificación ni información de identificación estaba a disposición de la PI, por lo que este estudio exento de un consentimiento por separado.
muestras de pacientes
tumores de colon esporádicos se recogieron de forma prospectiva en virtud de la aprobación del IRB como parte del estudio de Carolina del Norte cáncer colorrectal (NCCCS), un estudio de casos y controles de base poblacional que comprende 503 pacientes [15], [16]. Análisis de microsatélites se realizó a partir de tejido incluido en parafina como se ha descrito anteriormente [2], la segregación de la cohorte en 54 MSI-H, y 449 pacientes MSS /MSI-L. Para este estudio, se seleccionaron al azar 51 muestras de pacientes con SMS amplia del tumor y el tejido normal.
Líneas Celulares
El MSI células de cáncer de colon HCT116 líneas, SW48, DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174T, SNU175, SNU407, SW48, y RKO, así como las líneas celulares de cáncer de colon MSS CaCo2, HT29, SNU81, SNU503, SW480, y T84 se mantuvieron en Modificado medio de Iscove de Dulbecco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y FET eran mantenido en F12 /Modificado Medio Eagles de Dulbeco en condiciones descritas anteriormente [12]. Todas las líneas celulares están disponibles de ATCC excepción de FET (especie de regalo de Michael Brattain, Colegio Médico de Ohio, Toledo, OH) [21].
microdisección de tejidos, extracción de ADN y ARN extracción
DNA a partir del material fijado con formalina, embebido en parafina se extrajo después de microdisección utilizando el kit Takara DEXPAT (Takara Bio Inc., Japón). Se obtuvo ADN genómico a partir de líneas de células usando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Se obtuvo ARN a partir de líneas de células usando el reactivo TRIzol (Life Technologies Inc. Carlsbad, CA).
Los anticuerpos
conejo anti-TyrGly mACVR2 (482-494) (generoso regalo de W. Vale , Salk Institute), con su epítopo diana en la región C-terminal de ACVR2 (más allá del truncamiento resultante de marco de lectura en el exón 10) se utilizó para inmunohistoquímica como se ha descrito anteriormente [2], [12]; conejo anti-TyrGly ACVR1 (474-494) fue utilizado en 1:800; pSmad2 (Señalización Celular) en 1:250; total de SMAD2 (Epitomics) en 1:400; y TGBR2-C16 (Santa Cruz) en 1:300.
La inmunohistoquímica para ACVR1, ACVR2, pSmad2, TGFBR2 y SMAD2 expresión de la proteína
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [2]. La tinción se agrupan en pérdida o 0 (ausencia o disminución significativa en comparación con el tejido normal adyacente), reduce o 1+ (sutil disminución en comparación con el tejido normal adyacente), sin cambios o 2 + (sin cambio en comparación con el tejido normal adyacente), y el aumento o 3+ (aumento en comparación con el tejido normal adyacente). Tres investigadores independientes anotó ciegamente todas las diapositivas. Los tres investigadores tuvieron que estar de acuerdo para que un tumor se llamará 0 o pérdida de la expresión.
La pérdida de heterocigosidad (LOH) Análisis
Evaluación de LOH en el
ACVR2
y
ACVR1
loci se realizó tal como se describe anteriormente [22] utilizando marcadores microsatélites 2 (D2S1353 y D2S1399) flanqueando
ACVR2
[19], así como un intragenic marcador para
ACVR1
(D2S2686) (véase el cuadro S1).
Análisis CIN se realizó
Análisis para CIN como se describe anteriormente [23]. En pocas palabras, los cebadores de oligonucleótido directo eran fluorescente marcada con FAM en el extremo 5 '(Applied Biosystems) y un conjunto de 6 marcadores polimórficos microsatélites D5S346, D5S409 (D17S261 D18S81 D17S250, D18S91 y D18S69) (ver Tabla S1) se utilizó para determinar LOH en el cromosoma 5q, 17q y 18q.